玻璃化冷冻法保存人类囊胚的临床应用

玻璃化冷冻法保存人类囊胚的临床应用

戴志俊 季钢 张芳芳 张奕

（合肥市妇幼保健院，合肥 230001，安徽）

摘要：目的：探讨玻璃化冷冻法保存人类囊胚的临床应用效果。方法：回顾性分析2011年1月～10月在我院生殖中心行玻璃化冷冻解冻囊胚患者共12个周期的结局。结果：玻璃化冷冻解冻共21枚胚胎，存活21枚（存活率100%），共解冻12个周期，均有胚胎移植，获得临床妊娠5例（妊娠率41.67%），着床率23.81%（5/21）。结论：玻璃化冷冻法是保存人类囊胚的一种有效方法。 关键词：囊胚，玻璃化，冷冻保存，人类

Clinical Application Of Vitrification For Human Blastocysts

Dai Zhijun, Ji Gang , Zhang Fangfang , Zhang Yi

（Hefei Maternity and Child Health Hospital,Hefei 230001,Anhui） Abstract:Objective: To examine the clinical value of vitrification for human blastocysts. Methods: Retrospective analysis of 12 patients who conduct embryos vitrification from Jua.2011 to Oct.2011. Results: All of the 21 blastocysts were thawed and survived , survival rate was 100%(21/21);5 cycles of 12 cycles got clinical pregnancy after transferred, clinical pregnancy rate were 41.67% ,implantion rate were 作者单位：合肥市妇幼保健院

安徽医科大学妇幼保健临床学院 安徽 230001

23.81%(5/21). Conclusion: Vitrification ca n be an effective method for cryopreservating human blastocysts.

Key Words：blastocysts; vitrification; cryopreservation; human

自从1998年Mukaida等首次报到了玻璃化冷冻人类胚胎获得成功以来[1]，玻璃化冷冻技术在临床上得到广泛推广和应用，将胚胎培养至囊胚再行冷冻或移植可以在一定程度上起到筛选作用，改善妊娠结局。我院生殖中心应用玻璃化冷冻技术保存人类囊胚应用于临床，并取得较满意的结局，总结如下。 1 资料和方法

1.1 一般资料 2011年1月～10月在合肥市妇幼保健院生殖中心行囊

胚玻璃化冷冻复苏移植的患者12个周期，这些患者新鲜周期放弃移植或移植失败，年龄20～40岁，玻璃化冷冻胚胎解冻后培养2小时选择存活的胚胎进行移植。

1.2 试剂和耗材 采用日本加藤公司玻璃化冷冻、解冻试剂盒

（Kitazato Biophama Co.Ltd.Shizuoka.Japan）。冷冻试剂包括平衡液（Equilibration Solution，ES）、冷冻液（Vitrification Solution，VS）；解冻试剂含有解冻液（Thawing Solution，TS）、稀释液（Diluent Solution，DS）、洗液1（Washing Solution 1，WS1）和洗液2（Washing Solution 2，WS2）；冷冻载体为Cryotop（日本加藤公司生产）。

1.3 冷冻胚胎的标准 参照本院生殖中心囊胚评分标准，第五、六天

发育到3BB以上的胚胎予以冷冻。

1.4 玻璃化冷冻 取0.5mlES、VS于Falcon 3037皿内室温（24℃）

下平衡，将胚胎（一次最多3枚）移入平衡液ES中5～20min，然后移入冷冻液VS中，充分混匀后迅速将胚胎置于冷冻载体Cryotop顶端，并立刻投入液氮中，时间控制在60s内。 1.5 胚胎解冻复苏 将0.5ml解冻试剂取出在室温下平衡，并取解冻

液TS于Falcon 3653皿中置于37℃预温，将要解冻患者的胚胎从液氮中取出，迅速将Cryotop顶端置于TS中1min，然后在室温下依次将胚胎转入DS、WS1、WS2中3min、5min和5min。最后将胚胎移入平衡过的培养液中，置于37℃、6%CO2的培养箱中培养2h等待移植。

1.6 临床妊娠的确认 解冻当天选择存活的胚胎行宫腔内移植，移植

14天后测定血或尿人绒膜促性腺激素水平，阳性者移植30天后行B超下监测，见到孕囊者为临床妊娠。 2 结果

2011年1月～10月行囊胚玻璃化冷冻复苏移植的患者12个周期，21枚胚胎解冻后，存活胚胎21枚，胚胎存活率为100%；每周期移植胚胎1.75枚，共有5例患者获得临床妊娠：其中1例流产，其余4例继续妊娠中，胚胎着床率为23.81%（5/21），临床妊娠率41.67%。 3 讨论

胚胎的冷冻保存是人类辅助生殖技术实施过程中一个必不可

少的重要环节，玻璃化冷冻技术是指细胞在高浓度的冷冻保护剂作用下，快速降温，使细胞内外的水分直接形成玻璃态，避免了冰晶的形成对细胞的冷冻损伤。玻璃化冷冻方法具有简便、快捷、经济等优点，相对于程序化冷冻法需要精密的程序化冷冻仪，且操作复杂，时间长，消耗液氮量大而言具有很大的优势和临床应用价值。

自2000年Yokota等[2]首次报道囊胚玻璃化冷冻后获得临床妊娠，近年来学者们在囊胚期胚胎玻璃化冷冻方面开展相关的研究，并取得可喜的成绩[3]。张顺吉等[4]研究表明卵裂期胚胎、囊胚玻璃化冷冻解冻后，虽然囊胚的复苏率（94.12%）略低于卵裂期胚胎（96.76%），无显著性差异，但囊胚的冻融移植妊娠率、着床率均明显高于卵裂期胚胎（75% V 40.94%、50% V 22.37%）。有学者[5]囊胚期冷冻胚胎在一定程度上减少了可用胚胎的数量，但可以改善种植率和减低多胎妊娠率，同田莉峰等[6]报道的结果一致。

在胚胎冷冻保存方面玻璃化冷冻技术有诸多的优势，但其安全性也值得关注。本研究中使用的Cryotop载体属于开放式载体，在操作过程中与液氮直接接触，加大了胚胎被污染的风险。同时由于缺少必要的设备冷冻前未进行人工皱缩，可能会影响冻融移植后的结局。 参 考 文 献:

1 Mukaida T，Wada S，Takahashi K，et a1．Vitrification of human

embryos based on the assessment of suitable conditions．Hum Reprod,l998, 13:2874-2879．

2 Yokota Y,Sato S,Yokota M,et a1.Successful pregnancy following blastocyst vitrification:case report[J].Human Reproduction,2000,15:1802-1803

3 Zhu D,Zhang J,Cao S,et al.Vitrification-warmed blastocyst transfer cycles yield higher pregnancy and implantation rates compared with fresh blastocyst transfer cycles:time for a new embryo transfer strategy [J].Fertil Steril,2011,95(5):1691

4 张顺吉,林戈,卢光琇等.卵裂期胚胎、囊胚的玻璃化冷冻解冻的妊娠结果分析[J].2011,21(8):955-958

5 黄国宁,孙海翔等.体外受精-胚胎移植实验室技术.人民卫生出版社 6 田莉峰,黄志辉,丁涛等.采用玻璃化冻融囊胚技术临床妊娠7例报道[J].江西医药,2011,46(9):845-847

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