实验六 淀粉酶的专一性和温度pH激动剂抑制剂对酶活性的影响
更新时间:2023-05-11 09:32:01 阅读量: 实用文档 文档下载
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实验六 淀粉酶的专一性和温度、pH、激活剂
及抑制剂对酶活性的影响
实验类型:验证型
目的和要求
1.通过本实验观察、验证酶的专一性和温度、pH、激动剂及抑制剂对酶活性的影响。 2.熟悉淀粉及其酶解产物的特殊显色方法;电热恒温水浴的使用。 3.了解唾液淀粉酶的收集与预处理。
原理
酶具有高度专一性,一种酶只能催化一种或一类底物发生反应,如淀粉酶只能水解淀粉,不能水解蔗糖。当淀粉被淀粉酶彻底水解为还原性麦芽糖和葡萄糖时,能使班氏试剂的Cu还原成Cu,生成砖红色Cu2O沉淀。淀粉酶的活性受温度、pH、激动剂及抑制剂、酶浓度以及作用时间等多种因素影响,因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。不同程度的水解糊精可与碘反应生成紫色、棕色或红色络合物。通过上述特征性反应,并以蔗糖等作对照,便可观察、验证淀粉酶是否具有专一性以及它的催化活性是否受到影响。
操作方法
一、唾液淀粉酶的收集与处理
1.制备唾液
实验者先将痰咳尽,用自来水漱口,以清除口腔内食物残渣,再在口腔内含蒸馏水约15ml,并作咀嚼咕漱运动,3分钟后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱布的漏斗内,过滤于小烧杯中备用,为与下面稀释唾液相区别,此称制备唾液。 2.煮沸唾液
取上述唾液约2ml,盛入1中号试管中,置沸水浴煮沸5分钟备用。 3.稀释唾液
调整唾液淀粉酶活性,使之在pH6.8、37℃和既无激动剂又无抑制剂条件下,作用5min,水解淀粉至红色糊精为宜。具体做法是取12凹白瓷反应板一块,按下列步骤操作: ①第1排每凹各加1滴制备唾液,12、13、14凹分别加生理盐水1、2、3滴,用滴管采用抽吸法,由稀到浓(14→12)小心混匀各凹,勿使溅入相邻凹中。每混匀一凹便取其1滴放入同列的2排凹中,剩余稀释唾液应全部放回原凹中。
②在盛有不同稀释度唾液的第2排各凹中,均加入4滴缓冲液(pH6.8),2滴1%的淀粉液和2滴蒸馏水,用①混匀法充分混匀,置37℃下5min。
③在第2排各凹中加I液一滴,混匀,观察比较各凹颜色,以浅棕-红色对应的稀释倍数,用生理盐水稀释3ml制备唾液备用。
二、唾液淀粉酶的专一性以及温度、pH、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活性影响的观察
2+
1+
(一)取试管3支编号,按下表1操作 表1 唾液淀粉酶专一性的实验观察 试剂 试管
1 2 3
pH6.8缓冲液
20滴 20滴 20滴
1%淀粉溶液
10滴 10滴 -
1%蔗糖溶液
- - 10滴
制备唾液 5滴 - 5滴
煮沸唾液
- 5滴 -
将上述各管混匀后,置37℃水浴中保温10分钟,然后每管加入班氏试剂20滴,再放入沸水浴中煮沸约15分钟,观察各管颜色反应,并说明原因。
(二)温度影响酶促反应的实验观察 1.取试管3支编号,按下表2操作: 表2 温度影响酶促反应的实验观察
2.将一、二管移入冰水浴中,待各管温度一致后速向各管加入碘液1滴,混匀后观察各管颜色的区别,
并说明温度对酶促反应的影响。
四、pH影响酶促反应的实验观察 1. 取试管3支编号,按下表3操作:
表3 pH影响酶促反应的实验观察
试管1 试管2 试管3
pH4.0缓冲液 pH6.8缓冲
液
20滴 - -
- 20滴 -
pH8.0缓冲1%淀粉溶液 液
-
- 20滴
10滴 10滴 10滴
稀释唾液
5滴 5滴 5滴
2.将上述各管混匀后,置37℃水浴中保温10分钟,然后每管加入碘液1滴,混匀后观察各管颜色的区别,并说明pH对酶促反应的影响。
五、激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察
1. 取试管4支编号,按下操作:
表4 激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察
1 2 3 4
2. 将上述各管放入37℃水浴中保温10分钟怎么减肚子,然后每管加入碘液1滴,混匀
pH 6.8缓冲液 20滴 20滴 20滴 20滴
1%淀粉溶液 10滴 10滴 10滴 10滴
蒸馏水10滴 - - -
0.9%NaCl - 10滴 - -
1%CuSO4 - - 10滴 -
1%Na2SO4 - - - 10滴
稀释唾液 5滴 5滴 5滴 5滴
后观各管颜色的区别,并说明激动剂和抑制剂对酶促反应的影响。
注意事项
1.反应试管应清洗干净,不同酶液、试剂及其滴管不能交叉混用; 2.使用混合唾液,或通过预试选出合适的唾液稀释度,效果更为显著。
试剂和器材
一、器材
1.滴管、烧杯、试管(架)及试管夹 。 2.恒温水浴箱与水浴锅。 3.脱脂棉、漏斗及纱布。 4.白瓷反应盘 二、试剂
1.1%淀粉 称取淀粉1g,岳阳家政加少量水调成糊状,加入煮沸的0.3%NaCl溶液至100m1。
2.1%蔗糖溶液
3.班氏试剂 A液:取柠檬酸钠173g,无水碳酸钠100g,加水600ml,加热溶解,冷却后稀释至850ml;B液:取结晶硫酸铜(CuSO4·5H2O)17.3g溶于100ml预热的蒸馏水中,冷却后加水至150ml。将A液缓慢倒入B液中混匀置试剂瓶备用。
4.碘液:称取碘4g、碘化钾6g溶于l000ml蒸馏水中,置棕色瓶内贮存备用。 5.各种pH缓冲液
⑴pH6.8缓冲液:取0.2mol/LNa2HPO4溶液772ml,0.1mol/L怎么减肚子柠檬酸溶液228ml混合即成。
⑵ pH4.0缓冲液:取0.2mol/LNa2HPO4溶液385.5ml,0.1mol/L柠檬酸溶液614.5ml混合即成。
⑶ pH8.0缓冲液:取0.2mol/LNa2HPO4溶液972ml,0.1mol/L柠檬酸溶液28ml混合即成。6.0.9% NaCl 溶液
7.1%CuSO4 溶液 8.1%Na2SO4溶液
思考题
1.简述温度、pH、激动剂及抑制剂排毒养颜胶囊、酶浓度等因素影响对淀粉酶活性的影响。
2.简述淀粉酶活性测定的原理及注意事项。
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