ww内切β 葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

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第25卷第2期食品与生物技术学报Vol.25　No.2　　　　　　　　　　　　　　2006年3月Mar.　2006JournalofFoodScienceandBiotechnology文章编号:167321689(2006)0220024204　

内切β2葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

孟广荣,　杨树林3,　曾亮亮,　李新柱,　蔡凤

(南京理工大学生物工程研究所,江苏南京210094)

摘　要:利用A¨KTAUPC2900快速蛋白液相色谱系统(FPLC)从黑曲霉发酵粉中分离纯化出内

切β2葡聚糖苷酶。分离纯化后的酶比活力提高了8.1倍,回收率为7.5%。经SDS2PAGE电泳分析该内切酶的相对分子质量为26400。酶学试验研究表明:该酶的最适反应温度为55℃,最适pH为4.8,Lineweaver2Burk法求得动力学参数,Km和Vmax分别为6.×1023mg/mL、2.906×1022(mL min)/mg。并确定了FPLCL时分离效

果达到最佳。

关键词:黑曲霉;纤维素酶;内切β2葡聚糖苷酶;;中图分类号:Q814.1:A

βandPropertiesofanEndo22glucanase

MENGGuang2rong,　YANGShu2lin3,　ZENGLiang2liang,　LIXin2zhu,　CAIFeng

(BiotechnologyInstitute,NanjingUniversityofScienceandTechnology,Nanjing210094,China)

βAbstract:Anendo22glucanasewasisolatedandpurifiedfromacommercialpreparationof

AspergillusnigerbymeansofFPLC(A¨KTAUPC2900).

Thespecificactivityofthe

endoglucanaseincreased8.12fold,andrecoverycoefficientreached7.5%.Themolecularweightwasestimatedas26400bySDS2PAGE.TheoptimalreactiontemperatureandpHoftheendoglucanase55℃and4.8,respectively.ThevaluesofKmandVmaxcalculatedfromLineweaver2Burkplotswere6.8381023mg/mland2.9061022(mlmin)/mg,respectively.Theendoglucanasewaspurifiedeffectivelyunderthebufferionicstrengthof4.8mmol/L.

Keywords:Aspergillusniger;cellulase;endoglucanase;purification;enzymeproperty;kinetics

纤维素酶是起协同作用的多组分酶系,可广泛应用于医药、食品、纺织、酿酒等领域[1]。纤维素酶的来源广泛,组分复杂,不同菌株,甚至同一菌株在不同培养条件下,发酵所产纤维素酶系的组成以及酶学性质也有很大差别,这就增大了纤维素酶分离纯化的困难和纤维素酶动力学性质研究的复杂性[2]。因此纤维素酶的分离纯化非常重要,是全面

收稿日期:2005210213;　修回日期:2005212220.

了解纤维素酶的组成、性质及各组分间的协同关系

的前提。目前已从曲霉、木霉等发酵产物中分离出纤维素酶的多种成分[3-5],张志强等[6]从黑曲霉发酵粉中分离纯化出了一种内切β2葡聚糖苷酶,Hen2ningJ rgensen等[7]由一株青霉菌IBT20888中分离纯化出了3种内切酶,JózsefMedve等[8]从一种霉菌的纤维素酶中分离纯化出了一种内切酶,并对

基金项目:国家“十五”科技攻关专项项目(2001BA706B218);南京市科学技术局项目(2003010145).

作者简介:孟广荣(19752),女,山东德州人,生物化学博士研究生;3为通讯作者.

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其酶学性质进行了试验研究。作者探索了利用A¨KTA快速蛋白液相色谱系统(FPLC)从市售黑曲霉发酵粉提取内切β2葡聚糖苷酶的纯化条件,并对纯化后内切酶的酶学性质进行了试验研究。

阴离子交换柱,快速蛋白液相色谱系统(FPLC)记录分离结果。pH410Na2HPO42柠檬酸缓冲液平

衡,含1mol/LNaCl的上述平衡液进行梯度洗脱,洗脱速度为1mL/min,5个柱体积(5CV)平衡,20min内洗脱液的浓度从0达到100%,分步收集器自动收集,每管1mL。过柱前平衡液、洗脱液均需经0122μm微孔滤膜过滤。

11316　SDS2PAGE不连续垂直平板电泳　分离胶

1　材料与方法

1.1　材料

黑曲霉发酵粉(南京林通生物技术公司),

SephadexG100(AmershamBiosciences,Sweden),HiTrapTM1mLDEAEFF弱阴离子交换预装柱(AmershamBiosciences,Sweden)。电泳所用试剂

浓度为12g/dL,浓缩电压和分离电压分别为80V和100V。考马斯亮蓝R250染色,采用凝胶成像系统的工作站BIO2RAD,Quantityone241512软件确定相对分子质量。

及标准相对分子质量蛋白质为BBI原装产品,其它试剂为国产分析纯。1.2　仪器　

A¨KTAUPC2900FPLC(AmershamBiosci2ences,Sweden)、4300pro紫外可见分光光(AmershamBiosciences,Sweden)、冷冻离心机(HeraeusBiof,2ANⅡ电泳仪(,)2218离心浓缩仪(Christ)(BIO2RAD,America)。1.3　试验方法

1.3.1　纤维素酶活力测定　内切β2葡聚糖苷酶活

2　21:在30～50%相对饱和度区间

,(H4)2SO4浓度的增加而明显增多,在50～80%相对饱和度区间内数值比较相近,而图2显

示:pH410～610的3条曲线几乎重合。因此可判断:(NH4)2SO4盐析的最佳相对饱和度区间为30～50%,缓冲液的pH对盐析影响很小

。

力的测定参照文献[4],外切β2葡聚糖苷酶和β2葡萄糖苷酶活力的测定参照文献[9]。以015mol酶溶液在50℃条件下反应30min分解羟甲基纤维纳产生1mg还原糖为1个酶的活力单位U。1.3.2　蛋白质量测定　酶蛋白测定参照文献[7]。1.3.3　盐析条件　20g酶粉溶于200mLNa2HPO42柠檬酸缓冲溶液中,4℃浸泡12h,8500

),收集上清液。分成7等r/min离心20min(4℃

图1　内切酶活力与相对饱和度关系曲线

Fig.1　Therelationoftheendogulanaseactivityandthe

realtive

saturation

份,分别用20～80%相对饱和度的(NH4)2SO4于4

℃盐析12h,8500r/min4℃离心20min,收集沉淀物。重复上述过程两次,分别用pH410,510,610的Na2HPO42柠檬酸缓冲液将三次过程所收集的沉淀物复溶至原体积,在A550与A280条件下分别测定其内切酶活力及蛋白质质量。11314　SephadexG100柱层析　取最佳相对饱和度区间内盐析沉淀物,溶解于pH510的Na2HPO42柠檬酸缓冲溶液中至20mL,取5mL上SephadexG100凝胶柱(D212cm×70cm)。柱压力34cmH2O,洗脱速度为110mL/min,每管收集715mL。11315　DEAEFF弱阴离子交换柱层析　将经过SephadexG100柱层析的内切酶峰值溶液用0122μm微孔滤膜过滤,取011mL上DEAEFF1mL

图2　蛋白质含量与相对饱和度关系曲线

Fig.2　Therelationoftheproteincontentandthereal2

tivesaturation

212　SephadexG100凝胶柱层析

测各收集管中酶液的蛋白A280及内切酶酶活

A550。结果如图3所示。蛋白曲线呈现3个峰,而

内切酶组分主要集中在第二个蛋白峰内。经Seph2

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one241512程序标定出纯化所得内切β2葡聚糖苷酶

adexG100柱层析后,说明已去除了一部分高相对

分子质量蛋白和低相对分子质量蛋白

。相对分子质量为26400(图5)。

表1　内切β2葡聚糖苷酶的分离纯化结果

Tab11　Theresultsofisolationandpurificationoftheen2

doglucanase

纯化

步骤粗酶液

总蛋内切酶纯化回收

比活/U

白/mg总活力/U倍数率/%

28517

192418902176191114413

61791221145412

1114312811

1004619321271

5

(NH4)2SO4盐析9716SephadexG100

2819217

图3　SephadexG100凝胶过滤

Fig.3　GelfiltrationchromatogramofSephadexG100

DEAEFF

213　DEAEFF弱阴离子交换柱层析

取212中第二个峰酶液011mL进行阴离子交换柱层析,结果如图4所示。经测定表明第二个峰

为内切β2葡聚糖苷酶活力峰[6]

。

图5　SDS2PAGE电泳图

Fig.5　ElectrophoresisofSDS2PAGE

215　内切酶最适反应温度、最适pH值

图4　DEAEFF离子交换柱层析

Fig.4　AnionexchangechromatogramofDEAEFF

在不同反应温度下,测定内切酶水解CMC2Na

的能力。图6显示在30～50℃,内切酶活力随温度升高而增加,基本呈线性关系,在55℃酶活力达到峰值,说明内切酶的最适反应温度为55℃。由于温度的升高,酶的反应速度和酶失活的速度均随之增加,两种因素综合作用的结果产生了该酶的最适温度。

试验中发现:缓冲液中Na2HPO4浓度为10mmol/L时仍干扰蛋白的吸附,在浓度降为418mmol/L后,分离效果大为改善,洗脱阶段的蛋白峰

可有效地分开,并避免了脱尾现象。平衡液中的离子可减弱被分离蛋白与离子交换介质的亲和力,从而影响蛋白的吸附,本试验中平衡液中离子浓度低于文献中离子强度[7-8,10-11]。推测本试验中蛋白与离子交换介质的亲和力较弱,从而蛋白的吸附受离子强度的影响较大,所以需要更低的离子强度以降低其对离子交换层析吸附能力的抑制作用。

粗酶液经(NH4)2SO4盐析、SephadexG100及DEAEFF阴离子交换层析后,内切β2葡聚糖苷酶的比活力提高了811倍,回收率为715%。回收率高于文献值[5,12]。各步分离纯化结果如表1所示。214　内切酶的相对分子质量

图6　反应温度对内切酶活力的影响

Fig.6　Effectofreationtemperatureontherelativeac2

tivityofendoglucanase

对阴离子交换柱层析的峰2收集液浓缩,进行SDS2PAGE不连续垂直平板电泳。BIO2RAD凝胶成像系统记录电泳结果[13],采用该系统的Quantity

以不同pHNa2HPO42柠檬酸缓冲液配制的

)测定CMC2Na溶液为底物,在最适反应温度(55℃

内切酶活力,结果表明缓冲液的pH显著影响内切酶活力,最适pH为418。在pH310及pH710时

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酶活力仅为最大值的44%和21%

。

3　结论

(NH4)2SO4经黑曲霉发酵粉溶解制取粗酶液、

盐析、SephadexG100脱盐并初步分离,利用快速蛋

白液相色谱系统(FPLC)分离纯化得到内切β2葡聚糖苷酶,SDS2PAGE测定其相对分子质量为26400。比活力提高811倍,回收率为715%。

平衡液和洗脱液的pH值和离子强度是影响离子交换柱层析效果的两个重要因素。在pH410时分离效果较好,pH310时几乎失去分离能力,而大于410时洗脱阶段的峰未能完全分开且脱尾严重。经多次摸索离子交换柱层析参数,在平衡液为pH410Na2HPO42,其中Na2HPO4浓418。FPLC系统在25,快速准确自。

、最适pH分别为55℃和418,L2B法求得动力学参数Km和Vmax分别为61838×1023mg/mL、21906×1022mg/(mL min)。

图7　pH对内切酶活力的影响

Fig.7　EffectofpHontherelativeactivityofendoglu2

canase

216　动力学常数Km和Vmax

用pH510的Na2HPO42柠檬酸缓冲溶液配制

质量浓度分别为010025,0100625,01001,01001375,0100175mg/mL的CMC2Na溶液,测定与不同浓度底物反应时的内切酶活力,根据葡萄糖标准曲线得到还原糖含量,对还原糖含量—线进行二次拟合,得反应初速度V0,L[14]求得动力学参数,Km和maxg/mL、21906×22)。

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(责任编辑:杨萌)

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