分子生物学实验的常见问题与解决方案

分子生物学实验的常见问题与解决方案-1

一、Southern杂交

问题1：电泳后发现凝胶中DNA扩散，导致结果难以确定，如何解决这一问题？ 解决方案：（1）在操作上：电泳时隔孔上样，电泳后要对凝胶及时处理使凝胶干燥；（2）琼脂糖的质量应该较好，尤其是不应含有内切酶，否则有时将使低拷贝数基因的杂交结果难以解释。

问题2：传统方法中转膜不完全的问题如何克服？

解决方案：经典的向上转移法会使凝胶短时间内变薄,此时即使延长转移时间至24小时以上,也不能使大分子DNA良好地转移出去,因此,转膜不完全。向下转膜法由于不需在吸水纸上增加重量,凝胶基本不变形；加之吸水纸的吸力与水受到的重力方向一致,故可以良好地完成DNA的转移,它不需要特殊的仪器,转移速度较快,转移效率高。

利用地高辛标记探针进行 Southern 杂交时，对于大于15kb的 DNA片断，转膜之前用盐酸进行脱嘌呤可以促进转膜效率, 但脱嘌呤过度可导致分子量相对较小的 DNA 被打断成过小的片段而难以和尼龙膜结合。如果实验转膜过程中同时含有大于 15kb的DNA(通常为基因组)和小片段DNA(通常是基因组酶切产物)，那么在转移的过程中倾斜容器，仅使凝胶上半部分浸泡于盐酸，这样既可以提高大片断 DNA 的转移效率，又不会打碎小片段DNA。

另外，等采用琼指糖凝胶直接杂交的方法，来解决这一难题：以转基因鼠的检测为例，实验步骤如下：1.转基因鼠的建立：以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5’调控区指导人G-CSF基因为构件，建立转基因小鼠。转基因小鼠的检测采用剪取鼠尾DNA做Southern进行鉴定。2.琼脂糖凝胶直接杂交:(l)用BanHI(150U)对由假孕鼠产生的仔鼠剪尾提取基因组DNA10μg酶切过液，取少量电泳检查酶切完全后，上样电泳8小时，(2)将电泳槽板连同凝胶置50℃放置3小时，用镊子轻轻揭起凝胶，放于变性液(0.5MNaOH，0.5MNaCl)20分钟，转置中和液(0.5MTrisHCl，0.15MNaCl)20分钟，将胶放于玻璃板上沥干液体，室温放置30分钟。(3)干胶应立即杂交。先将胶在水中泡一下，以利于操作。(4)将胶放人杂交液(6×SSC、5×Denhardt’S、0.25% SDS、100μg/ml鲑鱼精DNA)，加人探针，42℃杂交16-20

小时。(5)杂交完成后，洗膜8轮，42℃每次15分钟。2×SSC、0.1%SDS、1×SSC、0.1SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、各洗两次，在冰水中浸泡2分钟，以利于盐的排出。(6)干燥后按检测试剂盒操作，室温压片0.5-2小时。冲片照相。使用的探针为G-CSF。DNA，探针标记采用Fluorescein-12-dUTP，检测试剂盒为杜邦公司产品，操作按试剂盒说明书进行。用琼脂糖凝胶直接杂交的方法，较好地解决了微量核酸或低拷贝数转基因的检测问题，结果不仅直观，而且特异性好。与常规的Southern杂交相比，它所具有的优势是，它省略了将DNA进行转膜的步骤，从而避免了因转膜不完全所造成的DNA量的损失，特别是低拷贝数基因的丢失。另一方面，也使复杂的Southern杂交操作程序大大简化。因此，在转基因鼠的鉴定中以及微量核酸检测、疾病诊断中是防止低拷贝数基因漏检的一种可行途径。

问题3：在向下转膜法中，如何提高转膜效率？

解决方案：1、转移液的水平面应略低于凝胶的水平面。如果转移液的水平面高于凝胶，短时间内会有大量液体聚集在凝胶上，直接从侧面流失；果转移液的水平面过分低于凝胶，影响纱布的吸水力，转移效率下降。2、吸水纸吸水后易变形，使吸水纸与滤纸间产生空隙，而降低吸水纸的吸水效率，应及时更换吸水纸。

3、过夜转移时，及时添加转移液，防吸干。4、样本丰度高时，移时间可以缩短至1小时，此时凝胶上仍可见大分子量DNA的残留，当样本丰度低时，以延长转移时间。5、纱布上不要加盖重物，防凝胶受压变薄，响转移效率。

问题4碱转移结束后的尼龙膜潮湿不利于保存，且防止长期保存过程中DNA结合不紧密影响杂交效果，应如何做？

解决方案：将尼龙膜置于滤纸上干燥片刻，在紫外交联仪中将转有DNA的一面向上12000J交联4 min，若尼龙膜暂不杂交，可在4℃下保存备用但存放时间不宜超过半年。

问题5使用碱转移法，将导致杂交后探针的去除困难，几乎80%-90%的探针难以洗脱，如何解决这一问题？

解决方案：将煮沸的5g/LSDS溶液倒在膜上,待溶液自然冷却至室温,可除去膜上已杂交的DNA探针。洗脱后的尼龙膜,可反复用于其他探针的杂交(至少可耐5轮杂交与洗脱)。

问题6：Southern杂交中，探针的背景高，应如何解决？

解决方案：用随机引物法标记的探针要想得到最低的背景，在向尼龙膜上加

prob-DIG Easy H yb混合物前,要用0.45μm醋酸纤维素膜过滤，勿用硝酸纤维素滤膜过滤。对每一个探针和目的片段，总是要根据经验确定最合适的杂交条件，探针浓度很关键，如果太高，将会非特异性结合到膜上；太低，敏感性会降低。

利用地高辛标记探针进行 Southern 杂交时，以下 2 种措施可降低背景：(1)适当延长梯度洗膜的时间和提高洗膜温度；(2)控制地高辛抗体的浓度。使用足够量的地高辛抗体可以获得较好的杂交信号, 但过量的地高辛抗体会在膜上产生非特异结合斑点。

问题7：Southern杂交没有检测出出杂交信号的原因，如何解决？

解决方案：（1）目的DNA在总DNA中所占的比例，一般需要 10μg DNA 样品, 如果样品中目的基因含量较高, 可以按比例减少DNA用量。如果基因组中目的基因的拷贝数较低, 致使常规的基因组用量不能满足Southern 杂交的需要, 此时可加大基因组的用量；（2）探针的浓度和比活性：在杂交袋中杂交需要0.2ml/cm2的杂交液；使用圆筒状瓶子进行杂交可以使用较小的体积，约 0.1ml/cm2。（3）转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对：（见问题2，3）

二、蓝白斑筛选

问题1：做蓝白斑筛选只见白斑，不见蓝斑，该如何做？

解决方案：（1）做空白对照，将没有进行重组的宿主菌直接接入含有IPTG和X-gal LB琼脂糖平板在37℃下培养17小时以上以便显色。显色后将平板置于4℃两小时，蓝色会加深。如果正常显色，说明试剂，培养基及菌没有问题，如果不能正常显色，更换试剂重新配置培养基或者接入新的菌种，再次培养，确保空白

对照结果正确。（2）若空白试验结果正确，用牙签挑取白色菌落，进行PCR扩增，同时设立阳性、阴性和空白对照。阳性对照为经测序确认含有相同大小插入片段的重组菌落，阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落，空白对照为不加模板的PCR体系。PCR扩增产物通过非变性PAGE条带分析，确定是否重组，即PCR扩增后的反应液中加入2μl的6×上样缓冲液，混匀，上样至已预电泳的10％非变性PAGE加样孔中，200V电压电泳后，取胶至EB液中染色30min，最后在紫外灯下数码照相。比对结果，判断白斑是否为重组子。

问题2：做蓝白斑筛选时，只见蓝斑，不见白斑该如何做？

解决方案：（1）做空白对照，将没有进行重组的宿主菌直接接入含有IPTG和X-gal LB琼脂糖平板在37℃下培养17小时以上以便显色。显色后将平板置于4℃两小时，蓝色会加深。观察对照的蓝色是否和实验组的颜色一样，如果实验组的蓝色较浅，可能载体带有插入片段，但没有阻断lacZ阅读框。（2）用牙签挑取浅蓝色菌落，进行PCR扩增，同时设立阳性、阴性和空白对照。阳性对照为经测序确认含有相同大小插入片段的重组菌落，阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落，空白对照为不加模板的PCR体系。PCR扩增产物通过非变性PAGE条带分析，确定是否重组，即PCR扩增后的反应液中加入2μl的6×上样缓冲液，混匀，上样至已预电泳的10％非变性PAGE加样孔中，200V电压电泳后，取胶至EB液中染色30min，最后在紫外灯下数码照相。比对结果，判断浅蓝色菌落是否为重组子。

三、外源基因在大肠杆菌的表达

问题1：外源基因在大肠杆菌中高效表达易形成包含体，包含体形成有利于表达产物的纯化，但降低产生大量不具有生物活性的产物，如何降低包涵体的形成？ 解决方案：（1）采用胰胨-磷酸盐培养基能够限制包含体的形成。（2）培养液中加入甜菜碱和山梨醇来改变渗透压，使表达产物由包含体形式转变为活性状态，将温度从37℃降低到25℃时诱导表达，可降低包含体的形成。（3）选用pMBI衍生而来的载体质粒，因为其可以协同表达DnaK-DnaJ或GroEL-GroES，增加凝结蛋白的溶解度。分子伴侣折叠作用效率与细胞DnaK-DnaJ和GroEL-GroES的浓度有关，与表达蛋白的性质有关。

问题2：在lac、tac 表达系统中IPTG 用于诱导lac、tac启动子的转录，但由于IPTG本身具有一定的毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用IPTG，应如何做？

解决方案：（1）lac 和tac启动子的转录受温度严紧调控：把阻遏蛋白 LacI 的温度敏感突变体lacI(ts)、lacIq(ts)插入表达载体或整合到染色体后，均能使 lac 和tac启动子的转录受到温度严紧调控在较低温度（30℃）时抑制，在较高温度（42℃）时开放。（2）用乳糖替代IPTG诱导lac和tac启动子的转录：乳糖在Β-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖，异乳糖具有诱导剂的作用这一过程涉及乳糖的转运和转化，其效率受到多种因素的影响和制约因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖替代 lPTG 作为诱导剂的研究要与发酵工艺结合起来，才能显示其良好的前景。

问题3：T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但也不可避免出现在相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。

解决方案：在表达系统中低水平表达T7溶菌酶基因：因为T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外，还能与T7 RNA聚合酶结合抑制其转录的活性。目前T7溶菌酶基因都通过共转化质拉导入表达系统，它能明显降低本底转录，但对诱导后目的基因的表达水平无明显影响。

问题4：为了提高外源基因的表达水平，对表达载体如何进行改进？

解决方案：(l)可诱导拷贝数的表达载体。质粒的拷贝数由培养条件控制，当需要增菌培养时，质粒的拷贝数很低，每个细胞仅1-5个拷贝，经适当条件诱导后，载体拷贝数可达每个细胞100-500个拷贝。这种表达载体的优点减小了载体质粒的丢失，保证质粒在大肠杆菌中的稳定性，对外源基因的表达调控更为严格，有利于基因的高效表达。这里主要有两类条件控制拷贝数的表达载体，一类是基于质粒Rl基础上的单复制起始表达载体；另一类是双复制起始表达载体，一个复制起始来源于Co1EI，另一个来源于质粒pSC101。(2)多顺反子型表达载体。这种表达载体的设计在于将第二个顺反子的SD序列插入在第一个顺反子的终止密码子TAA之前，第一个顺反子要尽量短，后面接目的基因的起始密码子ATG。由于第一个顺反子翻译地有效起始，使得大量的核糖体结合在多顺反子mRNA上，

促进了核糖体对第二个顺反子的SD序列的识别和翻译起始，从而提高了表达水平。(3)带翻译增强子的表达载体。atpE基因SD序列上游的一段序列对其表达具有促进作用，它位于SD序列上游2-7bp处，这段序列在atpE基因的mRNA上核昔酸顺序为UUUUAACUGAAACAAA，将其插入到其它表达载体内构建的新型表达载体，对Β-干扰素和IL-2的表达提高了6-8倍。T7噬菌体基因10的mRNA中有一个翻译增强子，它是一段与16sRNA的互补序列，提高了核糖体与翻译起始区的亲和力，将其插入SD序列上游或起始密码子下游均可提高翻译起始效率。

问题5：质粒的过度增殖以及其后目的基因的高效表达影响受体细胞的生长代谢，导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。如何解决？ 解决方案：将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道：（1）采用条件控制拷贝数的表达载体，一类是基于质粒Rl基础上的单复制起始表达载体；另一类是双复制起始表达载体，一个复制起始来源于Co1EI，另一个来源于质粒pSC101；（2）将外源基因插入到大肠杆菌的染色体中chopin等报道，将分泌型IGF-I的基因，采用串连式的重复方式插入到大肠杆菌染色体的attλ位点，在不添加抗生素诱导的条件下，采用高密度发酵，IGF-I基因十分稳定。

问题6：在分泌型异源蛋白的表达中，附加的甲硫氨酸也可能改变蛋白质的免疫性质和药理性质，应如何去除？

解决方案：⑴ 在表达系统中共表达甲硫氨酸氨肽酶基因。 ⑵ 在分离纯化后在体外用外肽酶处理。但它们都对与甲硫氨酸相邻的氨莱酸残基类型有一定要求，因此在使用上有一定的限制。

问题7：把所表达的目标蛋白外泌到细胞外的培养基中可以进一步减少蛋白水解酶的降解，也有利于分离纯化。如何实现目标蛋白的外分泌表达？

解决方案：（1）与大肠杆菌本身的外泌蛋白基因融合表达；（2）与一些能提高细胞外膜通透性的因子融合或共表达；（3）改变培养基的成分。但方法仅对外泌分子量较小的蛋白有效，而且外泌效率一般都比较低。

问题8：如何使外源基因高效表达？

解决方案：（1）表达质粒的优化和设计：构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始密码ATG 与 SD 序列之间的距离和碱基组成处于一个适当的范围内。核糖体结合位点序列的变化对 mRNA 的翻译效率有显著影响，具体表现为：SD序列 UAAGGAGG的翻译效率要比 AAGGA 高3-6倍；翻译起始密码 ATG 与 UAAGGAGG的最适距离是6-8个碱基长度，与 AAGAA 的最适距离是5-7个碱基长度；ATG 与 UAAGGAGG 至少相隔 3-4个碱基，与 AAGAA 至少相隔5 个碱基mRNA 的翻译才能进行；ATG与SD序列之间的碱基组成为A，T 碱基丰富时，mRNA 翻译效率较高。其次，尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中 A/T 碱基的含量，降低mRNA 5’ 端形成的“茎环”结构的可能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。在必要的情况下，还可通过定点突变，PCR 等技术改变个别关键的碱基来破坏mRNA 5’端的“茎环”结构。把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身的高效翻译起始元件后加上第二个SD序列和目标基因，一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因 5’端序列容易形成二级结构，而又不宜改变其序列的情形下。再者，在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特征和特点，注意引入翻译增强子序列。（2）共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因：由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的tRNA的丰度有正比关系稀有密码子对应的tRNA的丰度很低，有可能在翻译过程中发生中止和移码突变。可采用1.通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率高的同义密码子；2.在表达系统中共表达稀有密码子tRNA 基因，以提高大肠杆菌细胞内稀有密码子 tRNA 的丰度。（3）提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性：利用蛋白转运系统把目标蛋白最终累积在周质空间，或分泌到培养基中；采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌；对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表达；共表达能提高特定目标蛋白稳定性的辅助因子，如分子伴侣基因；对蛋白质序列中的蛋白水解酶敏感区域和识别位点进行改造；在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。（4）高密度发酵和工程化宿主细胞：：大肠杆菌高密度发酵是大规模制备重组蛋白质过程中不可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因的表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数量的成倍增加来实现总表达量的提高。目前常用的发酵方式有：恒定培养、流加补料培养、连续培养三种。工程化宿主细胞：1.构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌是解决高密度发酵后期由于菌体的生长密度较高，培养基中的溶氧饱和度往往比较低，氧气的不足导致菌体生长速率降低和乙酸的累积，乙酸的存在对目标基因的高效表达有明显的阻抑作用的根本途径。利用透明颤菌血红蛋白能提高大肠杆菌在贫氧条件下对氧的利用率的生物学性质，把透明颤菌血红蛋白基因vgb 导入大肠杆菌细胞内以增加其对溶氧的宽容度。从而降低菌体产生乙酸所要求的溶氧饱和度阀值；用基因敲除技术缺失大肠杆菌的磷酸转乙酰酶基因 pta1 和乙酸激酶基因ackA，使从丙酮酸到乙酸的合成途径被阻断；改变代谢流的方向，通过共转化把枯草杆菌、酿酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因 alsS，单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因 pdc1 和乙醇脱氢酶基因 adh2 导入大肠杆菌，使丙酮酸的代谢有选择地向生成

3-羟基丁酮或乙醇的方向进行。2.构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌：rpoH基因编码大肠杆RNA聚合酶的r32亚基，r32 亚基对大肠杆菌中多种蛋白水解酶的活力有正调控作用。rpoH 基因缺陷的突变株己经被构建，研究结果表明它能明显提高目标基因的表达水平。

1 PCR反应

1.1假阴性，不出现扩增条带

可能原因：

（1）模板：①模板中含有杂蛋白质；②模板中含有Taq酶抑制剂；③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚，模板本身拷贝数低；⑤模板核酸变性不彻底。

对策：纯化模板；配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改；如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA。

（2）酶失活

对策：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

（3）引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，

对策：①选定一个好的引物合成单位；②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度；③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效；④引物设计不合理，如引物长度不够引物之间形成二聚体等，需重新设计引物。

（4）Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 对策：调整Mg2+浓度，从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。

（5）反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要摸索条件，否则容易失败。

（6）物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

对策：优化PCR温度，有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度。

（7）靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

1.2假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

可能原因：

（1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。

对策：需重新设计引物。

（2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：

一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。

对策：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生。 对策：可用巢式PCR方法来减轻或消除。

1.3出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：

（1）引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。（2）Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。（3）酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

对策：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。⑤降低Mg2+浓度。

1.4 出现片状拖带或涂抹带

可能原因：酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多。

对策：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。

2 RT-PCR反应

2.1 在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物

可能原因：

（1）RNA被降解

对策：①在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA，使用良好的无污染技术分离RNA；②在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；③如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。

（2）RNA中包含逆转录抑制剂

对策：通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。（逆转录

抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，spermidine，甲酰胺和胍盐。）将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。

（3）多糖同RNA共沉淀

对策：使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。

（4）用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火

对策：①确定退火温度以适合引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。②对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体。③确定GSP是反义序列。

（5）起始RNA量不够

对策：增加RNA量。对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。

（6）RNA模板二级结构太多

对策：①将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火。②提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。不要在高于37℃时使用M-MLV。③如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。

（7）引物或模板对残余的RNA模板敏感 对策：在PCR前用RNaseH处理。

（8）靶序列在分析的组织中不表达 对策：尝试其他靶序列或组织

（9）PCR没有起作用

对策：对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。

2.2 污染造成假阳性

可能原因：

（1）样品间的交叉污染

对策：①收集样品的容器最好使用一次性的，如重复使用，应在使用前应于180℃的高温下干烤6小时或更长时间；②样品存放时要密封严实，以防外溢造成相互间的交叉污染；③样品在提取过程中离心管及吸样枪头最好使用一次性的，以免

不同实验样品间相互污染；④由于吸样枪污染会导致样品间的污染，也是一个值得注意的问题，由于操作不慎将样品或提取物吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取时要十分小心，吸时要慢，吸取尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染；⑤同时要注意操作时不要剧烈地摇动反应管，开盖时也容易造成气溶胶污染。每次实验完毕都要及时清理实验台面，用0.5%次氯酸钠消毒后再打开紫外灯照射半小时。

（2）RT-PCR本身使用的试剂污染在试剂配制过程中，由于加样枪、容器及其它溶液被污染。

对策：所有试剂都应尽量小量分装，以减少重复加样次数，避免污染机会，另外RT-PCR试剂应尽可能密封好分类存放。每次操作完毕后同样要进行台面消毒和紫外线照射消毒。

（3）扩增产物的污染，极微量的扩增产物污染就可造成假阳性。

对策；每次实验完后，扩增产物都要及时密封后处理。设阳性对照。

（4）操作人员污染：只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，从而影响结果的准确性，RNA酶可存在操作人员手汗、唾液中，也可灰尘中，一旦器械、玻璃制品、塑料制品受到污染，容易造成实验失败。

对策；操作人员应戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。设置PCR操作专用实验室，所用实验用具应为专用，并合理分隔实验室，将样品的提取、配制RT-PCR反应液、PCR循环扩增等步骤分室进行，实验前应将实验室及实验人员工作服用紫外线或臭氧消毒以破坏残留的DNA或RNA。

2.3在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果

可能原因；

（1）对照RNA中含有痕量DNA。

对策：第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影响。

（2）有可能是引物二聚体的条带。

2.4扩增产物滞留在加样孔中

可能原因：由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。

对策：将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。

分子生物学实验中常见的问题与对策-3(2009-06-11 11:52:17)

3 定量PCR

3.1 无CT值（信号）出现

可能原因：

（1）反应循环数不够

对策；35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。

（2）测荧光信号的步骤有误

对策：一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

（3）引物或探针降解 对策：可通过PAGE电泳检测其完整性。

（4）引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。

对策：重新设计引物或探针

（5）模板量不足

对策；对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

（6）模板降解 对策：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

3.2 CT值出现过晚

可能原因：

（1）扩增效率低，反应条件不够优化

对策：设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。

（2）PCR各种反应成分的降解或加样量的不足

（3）PCR产物太长 对策：一般采用80-150bp的产物长度。

3.3 标准曲线的线性关系不佳

可能原因：

（1）加样存在误差，使得标准品不呈梯度 对策：精确操作。

（2）标准品出现降解 对策：避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。

（3）引物或探针不佳 对策：重新设计更好的引物和探针

（4）模板中存在抑制物，或模板浓度过高 对策：降低模板浓度或重新制备。

3.4 阴性对照也出现明显的起飞

可能原因：

（1）混合物或水被污染 对策：避免污染。

（2）引物二聚体的出现

对策：用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。

（3）反应过程中探针的降解 对策：用PAGE电泳对探针进行检测。

（4）如果使用了ROX校正，则可能是ROX的降解所造成。

3.5 熔解曲线不止一个主峰

可能原因：

（1）引物设计不够优化 对策：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

（2）引物浓度不佳 对策：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

（3）镁离子浓度过高 对策：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。

（4）模板有基因组的污染

对策：RNA提取过程中避免 DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

3.6 扩增效率低

可能原因：

（1）反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。

（2）反应条件不够优化 对策：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。

（3）反应体系中有PCR反应抑制物

对策：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。

3.7 实验重复性不好

可能原因：

（1）加样不准确 对策：精确操作。

（2）仪器在样品上温度条件有差异，即温度均一性不好。

（3）模板浓度低。样品初始浓度越低，重复性越差 对策：应减少样品的稀释倍数。

3.8变性温度是否合适

大部分的双链DNA在95°C就开始解链了，在有些情况下在90至94°C都不能很好地变性DNA。由于部分变性，参加反应的探针和引物相应的减少了，因此反应效率会下降。

3.9 变性时间是否合适

15到20秒对于变性扩增子是足够了，然而，长一点的产物，可能会需要30秒，60秒的变性时间通常是不需要的。

3.10 退火温度和时间是否合适

检查引物和探针的Tm值，SYBRGreenI的退火时间大约20到35秒，双标记探针通常是两步法，退火和延伸合并为一步，时间大约是45到60秒，温度通常在60°C，对于FRET探针退火步骤大约20到30秒。

3.11在哪一步骤采集信号

SYBRGreenI应当在72°C，此时绝大部分的DNA是双链状态，如上所述，双标记探针通常是两步检测，因此信号采集应该在退火延伸的整合步骤。对于FRET检测，数据应该在退火步骤检测。如果对于信号采集点不确定，可以多点采集作对比。如果监控屏幕检测不到信号，检查程序设定是否存在至少一个的信号采集点。

3.12是否选定了合适的增益值

一些情况下会看到曲线超过了窗口范围，在荧光强度100的地方成一直线。尽管大部分的数据可以用，但是减少增益，一些原始数据就不会超出范围。有时，在第一个循环信号就跳出了窗口范围，这是由于增益选得太高，看起来像没有检测到数据。如果熔解曲线分析时，开始荧光就达到了100，则应当用低的增益重新运行，而不需要重新运行扩增反应，SYBRGreenI和FRET的样品可以在一定程度上反复使用。

4 DNA限制性内切酶酶切反应

4.1 DNA完全没有被内切酶切割

可能原因：

（1）内切酶失活 对策：标准底物检测酶活性。

（2）DNA不纯，含SDS、酚、EDTA等内切酶抑制因子。

对策：将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA

（3）条件不适（试剂、温度）对策：检查反应系统是否最佳。

（4）DNA酶切位点上的碱基被甲基化

对策：换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株。

（5）DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I）

对策：换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增。

（6）DNA位点上存在其它修饰 对策：将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证。

（7）DNA不存在该酶识别顺序 对策：换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证。

4.2 DNA切割不完全

可能原因：

（1）内切酶活性下降 对策：用5-10倍过量消化。

（2）内切酶稀释不正确 对策：用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶。

（3）DNA不纯，反应条件不佳

对策：将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA；检查反应系统是否最佳。

（4）内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰

对策：换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株；将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证。

（5）部分DNA溶液粘在管壁上 对策：反应前离心数秒。

（6）内切酶溶液粘度大，取样不准 对策：将内切酶稀释，增大取样体积。

（7）酶切后DNA粘末端退火

对策：电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷.

（8）由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性

对策：使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡。

（9）过度稀释使酶活性降低 对策：适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏。

（10）反应条件不适 对策：使用最佳反应体系。

（11）识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序 对策：加大酶量5-10倍。

4.3 DNA片段数目多于理论值

可能原因：

（1）内切酶星状活性

对策：检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均可导致星状活性，降低酶的使用量。

（2）其它内切酶污染 对策：用λDNA作底物检查酶切结果。

（3）底物中含其它DNA杂质

对策：电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段。

4.4 酶切后没有观察到DNA片段的存在

可能原因：

（1）DNA定量错误（如RNA含量较高）

对策：用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量。

（2）在酶切反应液中形成非特异性的沉淀

对策：在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次。

4.5 内切酶保存期内快速失活

可能原因：

（1）保存温度不合适

对策：内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20℃低温保存。

（2）以稀释形式保存 对策：稀释酶液不宜长期存放，应一次使用。

（3）贮藏缓冲液不适当 对策：使用厂家推荐的贮藏缓冲液。

（4）低蛋白浓度 对策：内切酶与500ug/ml的BSA一起保存。

4.6 电泳后DNA片段的带型弥散，不均一

可能原因：

（1）DNA上结合有蛋白质

对策：电泳前上样液65℃加热5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提纯化。

（2）内切酶中含有DNA外切酶

对策：减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶。

4.7 酶切后的DNA片段连接效率低

可能原因：

（1）含磷酸盐的浓度高 对策：透析，乙醇沉淀去除磷酸盐

（2）内切酶失活不全或含有ATP酶 对策：延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA。

（3）平末端连接 对策：加大T4 DNA连接酶的用量。

（4）外切酶污染 对策：减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA。

（5）连接缓冲液不合适 对策：重新配制连接缓冲液。

5 DNA的连接反应

5.1 TA克隆连接失败或效率低

可能原因：

（1）连接缓冲液活性低，ATP降解或缓冲液稀释不当

对策：使用一次性分装的缓冲液，避免反复冻融。提供的T4连接酶缓冲液为十倍浓度，正确稀释。

（2）连接酶失活 对策：更换连接酶

（3）PCR产物中含有抑制连接的成分，导致连接失败

对策：将PCR产物和连接反应对照混合，观察是否存在抑制效应。如怀疑有抑制成分存在，应重新纯化PCR产物。

（4）PCR产物没有3’A突出端，不能连接

对策：使用能产生3’A突出端的DNA聚合酶或平端PCR产物先通过聚合酶及dATP进行加尾反应产生3’A突出端，再与T载体连接。

（5）载体T突出端丢失，引起载体平端连接

对策：避免核酸外切酶的引入，降解T突出端。只使用无外源核酸酶的T4连接酶。

（6）插入片段与载体比例不理想 对策：优化比例

5.2 粘端连接注意事项

（1）连接反应的温度：ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃，但在此温度下，粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是１２℃过夜。

（2）DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。二者连接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。

（3）碱性磷酸酶处理质粒载体：为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮＡ自生连接问题，为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化，通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。

（4）连接反应的检测：连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。

（5）如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功，则说明有效。

5.3 平端连接注意事项

（1）插入片断和载体片断的比例要高。

（2）连接酶要加的多点，最好用高浓度的酶。

（3）载体片断要做去磷酸化处理。

（4）可以用15％的PEG8000来增加连接效率和减少载体自联。

（5）反应体系10UL，不要太大。

（6）去磷酸化的步骤要根据自己酶的性质而定，一般要反应一个小时，在反应半小时后再补充酶再反应半小时。

（7）插入片断和载体片断要酶切良好。

（8）低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好，平端连接需要过夜反应。建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好。

5.4 用T4 DNA连接酶连接后转化失败

可能原因：

（1）反应体系内无ATP或Mg2+

对策：使用随酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中加入ATP。含ATP的Buffer保存超过1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败。当补加ATP时，确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。

（2）反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高 对策：纯化DNA

（3）去磷酸化步骤完成后，CIP、BAP或SAP失活不彻底

对策：根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶。

（4）DNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA

对策：保持总DNA浓度在1-10μg/ml之间。

（5）连接末端为单碱基突出末端

对策：使用最高至5μl高浓度连接酶16°C过夜连接。

（6）插入片段和质粒没有磷酸化。注重：假如载体已经去磷酸化了，而引物又没有磷酸化会导致连接失败，订购磷酸化的引物或对引物进行磷酸化。

（7）加入过多的连接混合物至感受态细胞

对策：50μl感受态细胞应加入1-5μl连接混合物。

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