生化习题及大纲
更新时间:2023-12-19 11:53:01 阅读量: 教育文库 文档下载
习题
2–1.图2—1的滴定曲线描述了谷氨酸的电离。请回答下列问题:①指出三个pK‘a的
-=
位置;②指出Glu和Giu各一半时的pH;③指出谷氨酸总是带净正电荷的pH范围;④指
-
出Glu±和Glu能作为一种缓冲液的共轭酸碱对的pH范围.
图2-1 谷氨酸的酸-碱滴定曲线
2–2.为什么甘氨酸处在等电点时是以偶极离子的形式存在,而不是以完全不带电荷的形式存在?处在等电点时,其完全不带电荷的形式是多少?
2–3.甘氨酸是乙酸甲基上的氢被氨基取代生成的,但是,甘氨酸羧基的pK’a值比乙酸羧基 pK’a低。为什么?
2–4.在pH9.0时,计算赖氨酸的两性离子、阳离子以及阴离子所占的比例。已知赖氨酸三个可电离基团α-COOH,α–NH3+和ε- NH3+的pK’a值分别为2.18、8.95和10.53。 2–5.用强酸型阳离子交换树脂分离下述每对氨基酸,当用pH7.0的缓冲液洗脱时,下述每对中先从柱上洗脱下来的是哪种氨基酸?
①天冬氨酸和赖氨酸;②精氨酸和甲硫氨酸;⑧谷氨酸和缬氨酸;④甘氨酸和亮氨酸;⑤丝氨酸和丙氨酸。
2–6.计算出由Ala、Gly、His、Lys和Val所构成的可能的五肽数目。
2–7.在大多数氨基酸中,α–COOH的pK’a值都接近2.0,α–NH3的pK’a值都接近9.0。
+
但是,在肽中,α–COOH的pK’a值为3.8,而α–NH3的pK’a比值为7.8。你能解释这种差别吗?
2–8.某蛋白质用凝胶过滤法测定的表观分子量是90kD;用SDS-PAGE测定时,它的表观分子量是60kD,无论2-巯基乙醇是否存在。哪种测定方法更准确?为什么?
2–9.一种分子量为24,000、pI为5.5的酶被一种分子量类似、但pI为7.0的蛋白质和另外一种分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质污染。提出一种纯化该酶的方案。
+
2–10.下面的数据是从一个八肽降解和分析得到的,其组成是:Ala、Gly2、Lys、Met、Ser,Thr、Tyr。该八肽
用CNBr处理,得到:①Ala、Gly、Lys、Thr; ②Gly、Met、Ser、Tyr 用胰蛋白酶处理,得到:①Ala、Gly; ②Gly、Lys、Met、Ser、Thr、Tyr 用糜蛋白酶处理,得到:①Gly、Tyr; ②Ala、Gly、Lys、Met、Ser、Thr 经分析,N–末端残基是:Gly
C–末端残基是:Gly
请确定该肽的氨基酸顺序。 解答:
2–1解答: ①三个pK‘a的位置如图2—4所示
图2–4 谷氨酸的酸-碱滴定曲线显示出它的三个 pK‘a的位置以及它在不同pH下的电离状态
②Glu和Glu各一半的pH值为9.67。 ③当pH小于3.22时,谷氨酸总是带净正电荷。
④Glu±和Glu作为一种缓冲液的共轭酸碱对的pH范围是pH4.25左右
-
-
=
2–2解答:因为羧基的酸性(pK’a=2.36)比质子化的氨基的酸性强得多(pK’a=9.60)。因此,羧基将倾向于供出质子使氨基质子化,并且其平衡常数是107。这表明平衡状态非常强烈地偏向右边:
因甘氨酸的等电点是5.97,首先我们需要测定甘氨酸处在等电点时〔–COO〕/〔–COOH〕和〔H3+N–〕/〔–NH2〕的比例。如果我们单独处理每个功能基团,并利用Henderson—Hass- elbalch方程,就会得到:
-
两者合并起来考虑时,两性离子与完全不带电荷的比例是:
因此,甘氨酸处在等电点时,大约1/107以不带电荷的形式存在的。
2–3解答:甘氨酸羧基的pK’a值为2.34,乙酸羧基的pK’a值是4.7。当甘氨酸溶液的pH值低于6.0时,氨基以正电荷的形式存在。这种正电荷通过静电相互作用使带负电荷的羧基离子稳定。这就意味着甘氨酸的羧基将比较容易失去它的质子,因而它是一种更强的酸(具有更低的 pK’a值)。
2–4解答:赖氨酸有三个可电离的质子:
[Lys±]=1.12[Lys]=1.12×46.45=52
+
由此可见,在pH9.0时,〔Lys〕含量甚微,可以忽略不计,〔Lys〕占46.45%,〔Lys
+--
〕为52%,〔Lys〕为1.53%,整个分子带部分正电荷。 2–5解答:氨基酸从离子交换柱上被洗脱下来的速度主要受两种因素的影响:①带负电荷的树脂磺酸基和氨基酸带正电荷的功能基团之间的离子吸附,吸附力大的在树脂上停滞的时间长,从柱上洗脱下来的速度慢;②氨基酸的侧链基团与树脂强非极性的骨架之间的疏水相互作用。非极性大的侧链R基氨基酸与树脂骨架间的疏水作用力强,从树脂柱上洗脱下来的速度慢。
根据氨基酸可电离基团的pK’a值,我们可以确定题中每组氨基酸的结构以及在pH7时它们的平均净电荷。如果平均净电荷相同,则取决于它们侧链基团的疏水性。
++
+
①天冬氨酸净电荷为–l,赖氨酸净电荷为+1;赖氨酸与树脂磺酸基相反离子吸附力大。因此,天冬氨酸先被洗脱下来。
②精氨酸净电荷为+1,甲硫氨酸净电荷接近零。因此,甲硫氨酸先被洗脱下来。 ③谷氨酸净电荷为–1,缬氨酸净电荷接近零,谷氨酸的负电荷与树脂荷负电的磺酸基之间相互排斥,减小了谷氨酸与树脂的附着力,故先被洗脱下来。
④甘氨酸和亮氨酸的净电荷都接近零,但亮氨酸庞大的非极性侧链与树脂骨架之间的非极性相互作用力大。故甘氨酸先被洗脱下来。
⑤丝氨酸和丙氨酸的净电荷都接近零,但丝氨酸的侧链非极性小,故先被洗脱下来。 2–6解答:五肽的第一个残基是五个残基中的一个,第二个残基是余下四个残基中的一个,余此类推。因此,可能形成的五肽数目是:5×4×3×2×1=120
2–7解答:在游离的氨基酸中,邻近的电荷影响每个基团的pK’a值。带正电荷的–NH3+的存
-
在,使带负电荷的–COO稳定,使羧基成为一种更强的酸.相反地,带负电荷的羧酸使–NH3+稳定,使它成为一种更弱的酸,因而使它的pK’a升高.当肽形成时,游离的α-氨基和α-羧基分开的距离增大,相互影响降低,从而使它们的pK’a值发生变化.
2–8解答:蛋白质的分子形状影响它在凝胶过滤时的行为。分子形状较长的蛋白质在凝胶过滤时具有类似于分子较大的蛋白的行为。用SDS-PAGE测定的蛋白质分子量应该是比较准确的,因为变形后的蛋白质的迁移速度只取决于它的分子大小。
2–9解答:用凝胶过滤(即分子排阻层析)法先除去分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质,余留下来的低分子量的含酶的混合物再用离子交换层析法分离,于是就能获得所需要的纯酶。
2–10解答: 根据CNBr、胰蛋白酶、糜蛋白酶水解该肽的结果,并结合组成及末端分析
CNBr: Gly-(Tyr、Ser)-Met (Thr、Lys、Ala)-Gly 胰蛋白酶: Gly-(Tyr、Ser、Met、Thr)-Lys Ala-Gly 糜蛋白酶: Gly-Tyr (Ser、Met、Thr、Lys、Ala)-Gly 根据片段重叠,推测该肽的顺序是:Gly-Tyr-Ser-Met-Thr-Lys-Ala-Gly 、酶和它的底物分子、激素与受体、以及抗体与抗原等。 习题:
3-1.构象(conformation)指的是,一个由多个碳原子组成的分子,因单键的旋转而形成的不同碳原子上各取代基或原子的空间排列,只需单键的旋转即可造成新的构象。多肽链主链在形式上都是单键。因此,可以设想一条多肽主链可能有无限多种构象。然而,一种蛋白
质的多肽链在生物体正常的温度和pH下只有一种或很少几种构象,并为生物功能所必需。这种天然的构象是什么样的因素促成的?
3-2.假若一条多肽链完全由丙氨酸构成,什么样的环境促使它很可能形成α–螺旋,是疏水环境还是亲水环境?
3-3.以nm为单位计算α-角蛋白卷曲螺旋(coiled coil)的长度。假定肽链是由100个残基构成。
3-4.一种叫做Schistosoma mansoni 寄生虫的幼虫能感染侵入人的皮肤。这种幼虫分泌出能裂解的-Gly-Pro-X-Y-(X和Y可能是几种氨基酸中的任何一种)顺序中的X和Y之间肽键的酶。为什么该酶活性对这种寄生虫侵入是重要的。
3-5.①是Trp还是Gln更有可能出现在蛋白质分子表面?②是Ser还是Val更有可能出现在蛋白质分子的内部?③是Leu还是Ile更少可能出现在α-螺旋的中间?④是Cys还是Ser更有可能出现在β-折叠中?
3-6.下面的多肽哪种最有可能形成α-螺旋?哪种多肽最难以形成β-折叠?
①CRAGNRKIVLETY;②SEDNFGAPKSILW;③QKASVEMAVRNSG
3-7.胰岛素是由A、B两条链组成的,两条肽通过二硫键连接。在变性条件下使二硫 键还原,胰岛索的活性完全丧失。当巯基被重新氧化后,胰岛素恢复的活性不到天然活性的10%请予以解释。
3-8.对于密度均一的球状蛋白质来说,①随着蛋白质分子增大,其表面积/体积(A/V)的比例是增大还是减小?②随着蛋白质分子增大,其亲水侧链氨基酸残基与疏水侧链氨基酸残基的比例是增大还是减小?
3-9.胎儿血红蛋白(Hb F)在相当于成年人血红蛋白(Hb A)β链143残基位置含有Ser,而成年人β链的这个位置是具阳离子的His残基。残基143面向β亚基之间的中央空隙。①为什么2,3-二磷酸甘油酸(2,3-BPG)同脱氧Hb A的结合比同脱氧Hb F更紧?②Hb F对2,3-BPG的低亲和力如何影响到Hb F对氧的亲和力?③Hb F的P50是18托(torr),Hb A的P50是26托。基于这两个数值如何解释氧从母亲血液有效转运到胎儿。
3-10.在生理条件下,多聚赖氨酸呈随机卷曲的构象。在什么条件下它可以形成α-螺旋?
3-11.某蛋白质用凝胶过滤法测定的表观分子量是90kD;用SDS-PAGE测定时,它的表观分子量是60kD,无论2-巯基乙醇是否存在。哪种测定方法更准确?为什么?
3-12.请根据下面的信息确定蛋白质的亚凝胶过滤测定,分子量是200kD;②用SDS-PAGE100kD;③在2-巯基乙醇存在下用SDS-PAGE测40kD和60kD。
3-13.每分子人细胞色素c含有18分子
基组成:① 用测定,分子量是定,分子量是
的赖氨酸。100克细胞色素c完全水解得到18.7
克的赖氨酸。求
细胞色c的分子量。
3-14.有一种混合液含有五种多肽(P1、P2、P3、P4和P5),在pH8.5的条件下进行电泳分离,染色后揭示出如图2–6a的迁移图谱。已知这五种多肽的 pI是:P1为9.0,P2为5.5,P3为10.2,P4为8.2, P5为7.2。并且已知它们的分子量都接近1200。①请在图上鉴定出每条带相应的多肽;②现有一种pI为10.2的多肽(P6),它的分子量大约为600。该肽若与上述五肽一起在pH8.5下电泳,请你指出它的位置。
3-15.一种纯净的蛋白质样品用普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)在pH8.2条件下进行分析鉴定,得到如图2–7(A)的结果。该蛋白质样品在用SDS处理后,接着用SDS-PAGE进行分析,得到如图2–7(B)的结果。通过对上述两种电泳结果的比较,关于该蛋白质的结构你将得出什么样的结论?该蛋白质的等电点是低于pH8.2还是高于pH8.2?
3-16.一个蛋白质混合物含有下面几种不同的组分: a Mr=12,000 pI=10; b Mr=62,000 pI=4
c Mr=28,000 pI=7; d Mr=9,000 pI=5
不考虑其他因素,分别指出在下述情况下被洗脱的顺序。
①该混合物用DEAE-纤维素柱层折时,以逐渐增高洗脱液的盐浓度方式进行洗脱。 ②该混合物用SephadexG-50凝胶柱层析分析。
3-17.一种分子量为24,000、pI为5.5的酶被一种分子量类似、但pI为7.0的蛋白质和另外一种分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质污染。提出一种纯化该酶的方案。 解答:
3-1解答:①由于肽键因共振结构而使C—N键具有部分双键的性质,不能自由旋转,因而使得一条多肽主链构象的数目受到了极大限制。②与位于相邻刚性平面交线上的Cα相连接的侧链基团的结构、大小和性质对于主链构象的形成及稳定有很大的影响,使多肽链主链构象数目又受到很大的限制。因为Cα与两个刚性平面连接的单键的旋转度不同程度受到侧链的限制。③各种侧链基团相互作用所形成的各种力使蛋白质在热力学上达到了一种最稳定的构象。。
3-2解答;一条多肽链呈α-螺旋构象的推动力是所有肽键上的酰胺氢和羰基氧之间形成的链内氢键。在水环境中,肽键上的酰胺氢和羰基氧既能形成内部(α-螺旋内)的氢键,也能与水分子形成氢键。如果后者发生,多肽链呈现类似变性蛋白质那样的伸展构象。疏水环境对于氢键的形成不能提供任何竞争,因此,更可能促进α-螺旋结构的形成。
3-3解答:α-角蛋白的每条肽链呈α-螺旋构象,而每个α-螺旋含3.6个残基。在α-角蛋白中,每轮螺旋的长度为0.51nm。因此, α-角蛋白卷曲螺旋(coiled coil)的长度是: (100残基÷3.6个残基/轮)×0.51/轮=14.2nm
3-4解答:-Gly-Pro-X-Y-顺序频繁出现在胶原蛋白分子中,在身体的各部位都存在,包括皮肤。由于该幼虫酶能催化胶原蛋白多肽链裂解,故该寄生虫能进入宿主皮肤而生存。 3-5解答:蛋白质氨基酸残基在蛋白质结构中出现的位置与这些氨基酸残基的亲水性或疏水性相关。亲水性残基(极性残基)通常位于蛋白质分子的表面,而疏水性残基(非极性残基)通常位于蛋白质分子疏水的内部。①Gln是亲水性残基,它比Trp更有可能出现在蛋白质分子表面。②Val是非极性残基,它比Ser更有可能位于蛋白质分子的内部。③Ile在它的β碳位上有分支,不利于α-螺旋的形成,因此它通常不出现在α-螺旋中。④侧链小的氨基酸残基常出现在β-折叠中,因为这有利于片层的形成。所以Ser更有可能出现在β-折叠中。
3-6解答:多肽③最有可能形成α-螺旋,因为它的三个带电荷的残基(Lys,Glu,Arg)在该螺旋的一侧相间排成一行。一个有邻近碱性残基(Arg和Lys)的多肽会使螺旋去稳定。多肽②含有Gly和Pro,这两种氨基酸是螺旋的强破坏者。Gly和Pro的存在也会阻止β-折叠的形成。所以多肽②最难以形成β-折叠。
3-7解答:胰岛素是以前体的形式合成的。前体分于是一条单一的肽链。在前体合成及折叠后,切除前体分子的一部分(包括连接肽C肽),留下由二硫键连接的A和B两条肽链。这样,天然的胰岛素由于缺少C肽,因而也就缺乏指导肽链折叠的某些所必需的信息。所以当胰岛素变性和还原,随之复性,二硫键的形成是随机的。在这种情况下是不能完全恢复到天然活性的。这并不与氨基酸顺序指导蛋白质折叠的基本原则相矛盾。
3-8解答:①对于密度均一的球状蛋白质来说,随着分子量(即分子大小)增大,其半径(r)也增大。由于表面积=4πr2,体积=4/3πr3,因此
从这个表达式来看,随着蛋白质分子量的增大,它的表面积/体积的比例减小了。即随着蛋白质分子的增大,体积的增大比表面积增大更快。
②由于极性基团的亲水性,大多数分布在球状分子的表面,非极性侧链基团的疏水性,大多数聚集在球状分子的内部.由于随着分子量增大而体积增大,内部空间也增大。因此内部就可以容纳更多的具疏水侧链基团的氨基酸残基。所以随着球状蛋白质分子量的增大,亲水侧链氮基酸残基与疏水侧链氨基酸残基的比例将减小。
3-9解答:①由于2,3-BPG是同脱氧Hb A中心空隙带正电荷的侧链结合,而脱氧Hb F缺少带正电荷的侧链(β链143位的His残基),因此2,3-BPG是同脱氧Hb A的结合比同脱氧Hb F的结合更紧。②2,3-BPG稳定血红蛋白的脱氧形式,增高脱氧血红蛋白的份数。由于Hb F同2,3-BPG亲和力比Hb A低,Hb F受血液中2,3-BPG影响小,分子的氧合形式的份数较大,因此Hb F在任何氧分压下对氧的亲和力都比Hb A大。③在20―40氧分压下,Hb F对氧的亲和力比Hb A大,亲和力的这种差别允许氧从母亲血向胎儿有效转移。
3-10解答:在生理条件下,赖氨酸残基的带增电荷的侧链彼此排斥,不能形成α-螺旋。当它所处环境的pH上升超过它的侧链可界离基团的pK(>10.5)时才能形成α-螺旋。 3-11解答:蛋白质的分子形状影响它在凝胶过滤时的行为。分子形状较长的蛋白质在凝胶过滤时具有类似于分子较大的蛋白的行为。用SDS-PAGE测定的蛋白质分子量应该是比较准确的,因为变形后的蛋白质的迁移速度只取决于它的分子大小。
3-12解答:凝胶过滤分离的蛋白质是处在未变性的状态,如果被测定的蛋白质的分子形状是相同的或者是相似的,所测定的分子量应该是较准确的。SDS-PAGE测定蛋白质的分子量只是根据它们的大小。但这种方法能破坏寡聚蛋白质亚基间的非共价作用力,使亚基解离。在这种情况下,所测定的是亚基的分子量。如果有2-巯基乙醇存在,则能破坏肽链内或肽链间的二硫键。在这种情况下进行SDS-PAGE,所测定的分子量是亚基的分子量(如果亚基间没有二硫键)或者是肽链的分子量(如果亚基是由二硫键连接的几个肽链组成)。根据题中给出的信息,该蛋白质的分子量是200kD,由两个大小相同的亚基(100kD)组成,每个亚基由两条肽链(40kD和60kD)借二硫键连接而成。
3-13解答: 根据组分的百分含量求蛋白质的最低分子量可按下式计算:
细胞色素c的真实分子量=最小分子量×某氨基酸数=684×18=12300. 这一结果与用物理方法测定的结果很接近。
3-14解答:①根据它们的等电点以及它们在pH8.5条件下所带净电荷的多少,很容易鉴定出它们在电泳图谱上的位置(图2-6b)。
②P6与P3具有相同的pI,即是说,在pH8.5的条件下,它们带有等量的净电荷。但P6的分子量仅是P3的一半,它的迁移率是P3的2倍,电泳后它在支持物上位置应比P3更接近于负极(如图2-6b所示)。
(在一定粘度的介质中,在恒压下,带电颗粒的迁移率由电荷与颗粒大小的比例决定,即:μ(迁移率)∝(Q(电荷)/r(大小))。为了在Q/r基础上估计出相对迁移率,可用物质的分子量去除pI-pH,pI-pH视为Q值的一种量度。)
3-15解答:普通聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质时主要是根据各组分的pI的差别。图2-7(A)的结果只呈现单一的带,表明该蛋白质是纯净的。
由于SDS是一种带负电荷的阴离子去垢剂,并且具有长长的疏水性碳氢链。它的这种性质不仅使寡聚蛋白质的亚基拆离,而且还能拆开肽链的折叠结构,并且沿伸展的肽链吸附在上面。这样,吸附在肽链上的带负电荷的SDS分子使肽链带净负电荷,并且吸附的SDS的量与肽链的大小成正比。结果是,不同大小的肽链将含有相同或几乎相同的Q/r值。由于聚丙烯酰胺凝胶基质具有筛分效应,所以,分子较小的肽链将比较大的、但具有相同的Q/r值的肽链迁移得更快。若蛋白质是由单一肽链或共价交联的几条肽链构成,那么在用SDS处理后进行SDS-PAGE,其结果仍是单一的一条带。若蛋白质是由几条肽链非共价结合在一起,在用SDS处理后进行SDS-PAGE,则可能出现两种情况:一种仍是一条带,但其位置发生了变化(迁移得更快),表明该蛋白质是由几条相同的肽链构成,另一种可能出现几条带,则可以认为该蛋白质是由大小不同的几条肽链构成. 图2–7蛋白质的鉴定 图2-7(B)的结果表明该蛋白质是由两种大小不同的肽链借非共
价键结合在一起的寡聚体蛋白质。从图2–7的电泳结果我们可以断定该蛋白质的等电点低于pH8.2。
3-16解答:①DEAE-纤维素是一种常用于蛋白质分离的阴离子交换剂。在分离蛋白质
样品之前,DEAE-纤维素先用较低的离子强度和pH为8的缓冲液平衡,蛋白质样品也溶于同样的缓冲液中。在这样的条件下,DEAE-纤维素大部分解离,并且带固定的正电荷。在这种pH下,蛋白质样品中各组分带净正电荷(但有差异,或带相反性质的电荷),这些带不同电荷的组分与DEAE-纤维素的结合力不同。洗脱液的离子强度影响带电颗粒与交换剂间的结合力。当升高洗脱液的离子强度时,会降低交换剂与被分离组分的静电吸引力。由上所述,该蛋白质混合物各组分被洗脱下来的先后顺序是:a>c>d>b。
②Sephadex是葡聚糖凝胶,它是具有不同交联度的网状结构,其颗粒内部的孔径大小可以通过控制交联剂与葡聚糖的比例来达到.因此它具有筛分效应.用它作为填充料制成层
析柱,可以根据被分离物质的大小进行分离。已有不同型号的葡聚糖凝胶用于不同物质的分离。当蛋白质混合样品随洗脱液向下流动时,比凝胶颗粒孔径大的蛋白质分子不能进入凝胶网格内,被排阻在凝胶颗粒的外部;比凝胶颗粒孔径小的蛋白质分子则能进入到网格内部。其结果是,分子大的蛋白质则随着洗脱液直接从柱上流出,分子比较小的蛋白质则因走了许多?弯路‖而被后洗脱下来。分子愈小,―弯路‖走得愈多,洗出的速度愈慢。根据这一原则,上述蛋白质混合物从SephadexG–50洗脱出的顺序是:b>c>a>d。
3-17解答:用凝胶过滤(即分子排阻层析)法先除去分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质,余留下来的低分子量的含酶的混合物再用离子交换层析法分离,于是就能获得所需要的纯酶。 习题:
1.延胡索酸酶催化延胡索酸水合形成苹果酸,其逆反应苹果酸脱水转变成延胡索酸也能被该酶催化吗?为什么?
2.△G'和△G两者与化学反应的关系是怎样的?
3.借助米-曼氏方程υ=Vmax[S]/(Km+[S])研究底物浓度对酶反应速度影响的一种有用的方法是,在规定的实验条件下检验这个方程。在下述条件下,方程呈什么形式?①当〔S〕=Km时;②当〔S〕>>Km时;③当〔S〕< 4.①为什么kcat / Km比值能用来测定一种酶对它不同底物的优先权?②什么是酶的kcat / Km上限?③ kcat / Km值接近上限的酶常被说成达到“完美催化”。请解释。 5.人类免疫缺于病毒Ⅰ(HIV-Ⅰ) 基因编码一种该病毒装配和成熟所必需的蛋白酶 -1-1 (Mr=21500)。该蛋白酶能催化七肽底物水解,其kcat=1000 s和Km=0.075mol·L。(a) -1 当HIV-Ⅰ蛋白酶的浓度为0.2mg mL时,计算底物水解的Vmax;(b)当七肽的–CO–NH–替换成–CH2–NH–时,所得到的衍生物不能被HIV-Ⅰ蛋白酶水解,而却可以作为该酶一种的 -1 抑制剂。在如(a)所示的条件下,该抑制剂浓度为2.5μmol·L时,Vmax是9.3×10-3 mol·L-1-1 ·s。该抑制作用属于哪种类型? 6.为了确定某酶的催化反应的初速度的底物依赖关系,制备了一系列的l00ml含有不同底物浓度的反应混合物。向每个混合物加入相同量的酶后便开始反应。通过测定每单位时间(分钟)所形成的产物量而获得催化反应的初速度,其结果如下表所示。 表4—2 底物 浓度 初速度 底物浓度 初速度 底物浓度 初速度 (mol/L) (μmol/min) (mol/L) (μmol/min) (mol/L) (μmol/min) 0 ? 1× -6 -6 -5 10 0.08 5×10 0.25 1×10 0.33 1×100.50 -4 0.48 1×10 -3 0.50 1×10 -2 ①把表中的数据绘制成图,在给出的酶量下的Vmax是多少? ②根据米-曼氏方程,用Vmax、υ和〔S〕推演出Km的代数表达式。计算每个反应混合物的Km。 Km值取决于底物浓度吗? ③当底物浓度为0.1mol·L和l×l0mol·L时,计算它们的初速度。 ④反应混合物保温2分钟后确定反应的初速度。当初始底物浓度为1×10mol·L时,计算产物的生成量。在2分钟后底物总量的百分之几被转换? 7.许多酶都表现出类似钟罩形的pH-活性依赖曲线。但是,不同的酶具有不同的活性最高点,即不同的最适pH。请你举例说明pH对酶活性影响的原因。 8.研究某抑制剂对单底物酶催化反应的影响,获得如下表的结果。 -2 -1 -1 -7 -1 ①该抑制剂是竞争性还是非竞争性抑制剂? ②在无抑制剂存在时,该酶促反应的Vmax和Km是多少? ③在有抑制剂存在时,该酶促反应的Vmax和Km是多大? ④该反应的抑制常数(Ki)是多少? 9.十烷双胺((CH3)3N—CH2—(CH2)8—CH2-N(CH3)3),一种用于肌肉松弛的药物,是乙酰胆碱酯酶的可逆的竞争性抑制剂。通过增高乙酰胆碱的浓度可使抑制逆转或解除。十烷双胺共价地同酶结合吗?为什么这种抑制作用可通过增高乙酰胆碱的浓度而被解除? 10.二异丙基氟磷酸(DIFP)可使乙酰胆碱酯酶不可逆失活。但是,当有可逆抑制剂十烷双胺存在时,能延缓该酶的失活。为什么? 11.在底物以及中间物转换态同酶活性部位的结合中涉及哪些作用力?解释为什么底物同酶的紧密结合是于酶的催化无益的,而转换态的紧密结合则是需要的? 12.当胰蛋白酶活性中心的Asp定点突变成Asn后,它的催化反应速度降低10 000倍。为什么? 习题解答 1.解答:酶是生物催化剂,它通过降低进入转换态的活化能而增高反应速度,但不改变反应的平衡位置。由于正向和逆向过程都经相同的转换态,所以两者的速度均可被该酶促进。该反应总的自由能变化不会因有酶的存在而改变。但是,请注意,由于底物和产物所固有的自由能是不同的,因此由底物或产物进入到过渡态所需要的活化能的多少是不相同的。酶加快相反两个过程的速度也是不相同的。如果某过程进入的速度太 慢,实际上这个过程是不能进行的。 2.解答:△G'是某一反应在标准条件的产物与反应物所固有的自由能之差。当△G'是负值时,表明平衡有利于产物。但平衡不受任何催化剂的影响。有利的平衡并不意味着反应物 ? 转变成产物就能自动发生或能快速发生。△G是反应物从基态达到转换态(活化态)所需的能量,即活化能。若反应所需的活化能越低,反应的速度就越快。酶的存在能大大降低反应 0? 所需的活化能。反应的平衡与△G'有关,但反应的速度则与△G有关。 3.解答:①当〔S〕=Km时,υ=Vmax[S]/(Km+[S])=Vmax/2。这个方程可作为Km的物理定义,即Km是初速度达到最大半反应速度所对应的底物浓度。 ②当〔S〕>>Km时,Km+〔S〕可以近似地等于〔S〕。那么此时υ=Vmax。因此,在底物浓度很高的情况下,初速度变成了零级反应,即初速度不依赖于底物浓度,并表现为最大反应速度。 ③当〔S〕< 4.解答:① kcat / Km比值是酶专一性常数或对不同底物的优先权的一种衡量。当两种底物以相同浓度竞争同一种酶的活性部位时,它们转变成产物的速度比值是与它们的kcat / Km比值相等的。由于对每种底物来说,反应速度υ=(kcat / Km)[E][S],而[E]和[S]又是相同的,所以kcat / Km比值大者的底物是酶优先选择的对象。 υ(S1)/υ(S2)=(kcat / Km)1[E][S] /(kcat / Km)2[E][S] 0 0 ++ ② kcat / Km上限大约是10~10s。这是两个不带电荷的分子在生理温度下通过扩散相遇的最快速度。 ③一种酶的催化效率不能超过E和S形成ES复合物的速度,最有效率的酶的kcat / Km 值接近它通过扩散与底物相遇的速度。在接近这个极限速度下,酶催化反应的速度是最快的,因而可以成为有效的催化剂。 5.解答:(a)先计算酶的摩尔浓度,再计算Vmax [E]=0.2gL(1 mol/21500g)=9.3×10 mol·L Vmax=kcat[E]T=1000 s(9.3×10M)=9.3×10 mol·L ·s (b)由于在抑制剂存在下Vmax不变,因此这是一种竞争性抑制。由于该抑制剂在结构上与底物相似,它与底物竞争同酶活性部位结合,因而降低酶的催化活性。 6.解答:①由题中给出的数据所作的图如下图所示。图解表明,当底物浓度升高到1-3-1-3-1 ×10mol·L以上时,初速度不再升高。因此断定,底物浓度超过1×10mol·L时, -1 酶被底物饱和,已达到最大反应速度,即对于该酶量的Vmax是0.50μmol·min。认识到Vmax取决于酶量是重要的,即如果该酶浓度增加,Vmax亦增大。 ②米氏方程可以改写: -1 -6 -3 -1 -1 -1 -6 -1 89 -1 那么在不同的底物浓度下,我们可以得到如下表的数据。重要的结论是,Km是这个具有特定底物的酶的特征性常数,它不取决于底物浓度。我们也能从图4—3获得该Km的值。Km是酶半饱和所需要的底物浓度,并且在半饱和下,初速度是最大反应速度的一半(Vmax /2),这发 -6-1 生在5×10 mol·L的浓度下。 ④当〔S〕=1×10mol·L时,反应初速度是0.50μmol·min -1 (即Vmax)。那么在两分钟内产物的生成量是0.50μmol·min×2min=lμmol。由于100ml反应混合物含有: -2 -1 -1 由于在2分钟后只有0.1%的底物被转化,〔S〕仍然大大地大于Km, -1 因此反应初速度仍是 0.50μmol·min。 7.解答:在酶促反应中,游离酶,底物以及酶底物复合物都可能受到环境pH的改变而影响它们的解离状态。在最适pH范围内,酶活性中心有关基团的解离与底物的解离可能处于最佳结合状态,酶活性中心有关基团的解离能最有效地发挥酸、碱催化效率或增强它们的亲核性或亲电性。 例如胰凝乳蛋白酶的活性中心的“电荷转接系统”,当环境处于中性时,16位的Ile的α-氨基质子化,有利于电荷转接系统的形成,使195位的Ser残基的侧链具有更大的亲核性,有利于对底物的攻击。而在碱性pH下,16位的Ile的α-氨基去质子化,破坏了电荷转接系统,降低了195位Ser残基的亲核性,酶的活性就会降低。 又例如,精氨酸酶的最适pH为9.5—9.9,在该pH范围内,底物精氨酸解离带正电荷,而精氨酸酶的活性部位则解离成带负电荷。这样有利于酶与底物的结合。 - 8.解答:应用双倒数作图法先将题中的数据换算成倒数,得到如下表的结果。 以1/υ对1/[S]作图得到如下图的曲线。 ①从图可以看出,在该抑制剂存在下,Vmax没有改变,而Km增大。表明该抑制剂是竞争性抑制剂。 ②在无制剂存在时,量取纵轴上的截距是1 (L·min·μmol)。根据 纵轴截距=1/Vmax 所以,Vmax=1/纵轴截距=1/1=1μmol·L·min量取横轴的截距是﹣10 (L·mmol)。根据 横轴截距=﹣1/Km 所以,Km=﹣1/横轴截距=﹣1/﹣10=0.1mmol·L -1 -1 -1 -1 -1 - ③由于该抑制剂是属于竞争性的,因此在该抑制剂存在时,Vmax不改变,仍然是1μmol·L1-1 ·min。但是Km因竞争性抑制剂的存在而增大,这种增大还随抑制剂浓度的增加而不断增 -1-1-1 大。在〔I〕为0.5mmol·L时,Km为0.188mmol·L;在〔I〕为1.0mmol·L时,Km为 -1 0.30 mmol·L。 ④在有竞争性抑制剂存在的情况下, 无论〔I〕是0.5、还是1.0mmol·L,在量取相应的横截距后代入上式,都可求出相同的 -1 Ki值。例如,当〔I〕=0.5mmol·L,横轴(X轴)截距为﹣5.0,根据上式, -1 9.解答:几乎在所有情况下,竞争性抑制剂都结合在酶的活性部位上。十烷双胺是一种可逆抑制剂,表明它没有同酶共价结合。过量的乙酰胆碱(底物)通过使平衡向右移动而有效地从酶的活性部位取代了十烷双胺(竞争性抑制剂): 其净效应是无活性的EI复合物转变成ES复合物,后者然后转变成产物并释放出酶。 10.解答:二异丙基氟磷酸需要与乙酰胆碱酯酶活性部位的丝氨酸残基接近并共价结合才能使其失活。当有十烷双胺在酶的活性部位结合时,二异丙基氟磷酸与丝氨酸残基的接近受到限制。但是,十烷双胺的结合是可逆的,处在一种动态状态中;当它从活性部位释放出来时,或是底物(乙酰胆碱)结合到活性部位上,表现出催化活性,或是二异丙基氟磷酸结合到活性部位上而使其失活。在这种情况下,二异丙基氟磷酸迟早会使所有的酶分子失活。因此,十烷双胺只能降低酶失活时速度,即延缓酶的失活。 11.解答:酶-底物(ES)复合物以及酶-转换态(ES)的主要结合力包括电荷与电荷的相互作用、氢键、疏水相互作用和范德华力等。底物同酶的紧密结合形成的ES复合物 ? 处于热力学陷阱,导致活化能增高,使应速度降低。酶同转换态的紧密结合降低了ES复合物的能量,减少活化能,从而使反应速度增高。 12.解答:当胰蛋白酶进行催化反应时,Asp与His的咪唑基之间形成低能障的氢键。由于Asn缺少与His的咪唑基形成氢键的羧基,因此,当Asp定点突变成Asn后,酶的活性会显著降低。 习题: 1.用阳离子交换树脂分离核苷酸时,核苷酸被洗脱的先后顺序是UMP→GMP→CMP→AMP而不是UMP→GMP→AMP→CMP。为什么? 2.在中性pH下,ApGpUpC应带什么电荷?为什么?其净电荷数是多少? 3.一段由1000bp构成的双股DNA,它含有58%(G+C)。该DNA嘧啶残基含量是多少? 4.DNA双螺旋模型的主要特征是,一条链上的碱基与另一条链上的碱基在同一个平面上配对。Watson和Crick提出,腺嘌呤只与胸嘧啶配对,鸟嘌呤只与胞嘧啶配对。出于什么样的结构考虑,使他们确定这样的配对方案? 5.从某种细菌细胞中分离到一种能切断双螺旋DNA的脱氧核糖C-2'—C-3'键的酶。该酶对超螺旋DNA有什么影响? 6.假定一闭合环状双股DNA由100个C和G交替出现的碱基对组成,当把它转移到高盐溶液中时,经受有B-型向Z-型转换。它的缠绕数、连环数以及超螺旋数会发生什么样的变化? ? 7.噬菌体T4在E.coil B株的培养物中很容易繁殖,但在E.coil K株的培养物中很难生存,为什么? 8.蛋白质的每个氨基酸是由三个连续的碱基规定的。编码一个50kD的蛋白质的B-DNA片段的外形长度是多少?假定该片段呈A-DNA形式,计算编码同一蛋白质的基因的外形长度。 9.胰核糖核酸酶的基因最小核苷酸对数是多少?为什么它的基因可能比你回答的核苷酸对数大得多?由于什么原因不能确定它的大小? 10.在碱性条件下使双螺旋DNA部分变性(即双螺旋结构中只有局部区域解链)。为什么碱性条件会引起双股DNA解链?你预测解链区域是富含G—C对还是富含A—T对?为什么? 11.某纯净的DNA制剂在标准条件下测得其Tm为85°C。请计算出该DNA的A+T的百分含量和它的浮力密度。 12.在DNA和RNA中,哪一种在pH11.5对降解具有较大的抗性?而在pH2.5,哪一种对降解具有较大的抗性? 13.从生物中分离的DNA被剪裁成大小均一的片段(约300 kb),加热使其分离成单链,然后冷却,使分开的链退火。请解释为什么大肠杆菌复性是均相过程而人的DNA的复性则是双相的(即较快的复性过程和较慢的复性过程)。 14.同源蛋白质的结构有什么特点?为什么你预期来自不同脊椎动物编码同源蛋白质的 DNA链彼此有杂交的内容? 15.现有两支试管,分别装有E.coli DNA和海胆DNA,但忘了给它们贴上标签。你将怎样进行鉴定? 已知:E.coli DNA:24.7%A; 25.7%C; 26%G; 23.6%T. 总A=T对:48.3%;总G≡C对:51.7%。 海胆:32.8%A;17.3%C;17.7%G;32.1%T. 总A=T对:64.9%;总G≡C对:35%. 16.虽然大多数RNA分子是单股的,但是它们对作用于双股RNA的核糖核酸酶的降解也是敏感的。为什么? 17.为什么没有一种核酸外切酶降解噬菌体θ×174 DNA? 习题解答: 1.解答:用离子交换树脂分离核苷酸主要是根据它们与树脂上相反电荷的静电结合力的 不同以及核苷酸疏水的碱基环与树脂骨架之间非极性吸附力的差异。本来,用阳离子交换树 脂分离这四种核苷酸时,按照它们解离的差异,应该是AMP在CMP之前被洗脱下来。但是,由于嘌岭环比嘧啶环同交换树脂的非极性吸附力大三倍,抵消了它们之间的电荷差异,故出现上面的冼脱顺序。 2.解答:在中性pH条件下,ApGpUpC应带负电荷。因为第一磷酸基在此pH条件 下完全解离而带负电荷,其净电荷数为-3。 3.解答:由于该DNA含有58%(G+C),它应含有42%(A+T)。根据碱基配对规则,每一个A都与相反链上的T配对,A与T的数目应该相等。因此,T的含量是21%,或者含有210个T。 4.解答:DNA分子的Watson-Crick模型是以两条多核苷酸链的糖-磷酸骨架呈有规律的螺旋结构为特征。这种螺旋结构有两个限制:①一条链上的碱基必须与另一条互补链的碱基形成氢键;②使碱基与糖-磷酸骨架相连接的糖苷键必须保持大约1.1nm的间隔。A与T、 G与C的配对符合这种限制。若A与G或G与T配对,其间隔太大,以至不适合这种螺旋(即糖苷键间的间隔大于1.1nm),产生不稳定的膨胀结构,若T与C配对,其间隔太小,若A与 C配对,在空间限制范围内不能形成氢键。只有A与T、G与C互补配对,才能保持其间隔约为 1.1nm,也才能在碱基对之间有效地形成氢键,Watson-Crick螺旋结构才稳定。 5.解答:由于这种酶只作用于双螺旋DNA的脱氧核糖C-2'—C-3'键,不能催化核苷酸间的磷酸二酯键的裂解,故对超螺旋DNA不产生影响。 6.解答:在由B-型向Z-型转换时,B-DNA每个右手螺旋10.5bp转变成Z-DNA的每个左手螺旋12bp。由于右手双螺旋是正向的,因此缠绕数的减少是△T=﹣(100/10.5)+(﹣100/12)=﹣17.9(轮)。它的连环数保持不变(△L=0)。由于没有共价键的断裂,因此它的超螺旋数的变化是△W=17.9轮 7.解答:一种可能的解释是E.coli K株含有识别该病毒DNA的特定的碱基顺序的限制性内切酶,这些酶能催化该病毒DNA降解。细菌本身的DNA则由于这些特定顺序被甲基化而受到保护,免于降解。由于该病毒在B菌株中很容易繁殖,因此B株可能缺少限制性内切酶,或者具有不同专一性的限制性内切酶,即它们不能识别这种病毒DNA。 8.解答:蛋白质中的氨基酸残基的平均分子量大约110。50 kD的蛋白质含有(50 000 D÷110)455个氨基酸。每个氨基酸是由三个连续的碱基编码,编码455个氨基酸需要3×455=1365个碱基(或核苷酸)。B-DNA的每个碱基对的长度是0.34nm,因此它的外形长度是0.34nm /bp×1345bp=0.46μm。在A-DNA中,每个碱基对的长度是0.28nm,它的外形长度是0.28nm /bp×1345bp=0.38μm。 9.解答: 胰核糖核酸酶含有124个氨基酸残基,因此编码它的基因的核苷酸对数至少应有 124×3=372(bp)。这一大小仅仅是从(有活性的)核糖核酸酶的氨基酸残基数确定的。但是,该酶的基因也许含有前导顺序或信号顺序的密码子(这在新产生的蛋白质分子中常常发现有这样的顺序)、多个插入顺序以及其他可能的调节顺序。因此,372bp是一个最小的值,实际的大小可能是它的几倍。 10.答:增高pH会引起核酸某些碱基和所有的磷酸基电离,其净结果是带负电荷的基团 增加。由于同种电荷的相互排斥,使得DNA双螺旋失去稳定而解链。稳定双螺旋结构的作用力之一是碱基对间的氢键,即A=T和G≡C。A=T对只有两个氢键,而G≡C对却有三个氢键。克服G≡C对间的三个氢键比克服A=T对间的两个氢键所需要的力大。因此,富含A=T对的区域解链比富含G≡C对的区域要容易。这种情况与加热引起的DNA变性相似。 11.解答: 由于Tm是在标准条件下测定的,因此可以利用下面的公式计算A+T的百分含量: 浮力密度可用下式计算: 12.解答:在pH11.5时,DNA具有抗性,而RNA则很容易被碱水解。因为在碱性条件下,RNA核糖C‘—2位上的﹣OH的诱导电子的效应,使磷原子带微弱的正电荷,有利于 - 碱(OH)的亲核攻击。因而RNA对碱是敏感的。但在DNA分子中C‘—2位上没有羟基(﹣OH),不能产生邻近基团参与效应,不会形成有利于碱攻击的2‘,3‘-环状中间结构,因而对碱有抗性。 在pH2.5时,RNA具有较大的抗性。因为RNA分子中的C—N不易被酸水解。而DNA在酸性条件下,易变成去嘌呤酸。这种差别是由于戊糖结构差别造成的。戊糖C‘—2位上的羟基存在与否对酸性条件下C—N的稳定性有很大的影响。 13.解答:实际上大肠杆菌几乎全部基因都是以单拷贝存在的,所以每个片段与它的互补链的重新结合以一种较均相过程进行。相反,人的基因组含有许多重复的DNA顺序。许多含有这些顺序的DNA片段找到彼此形成双链区(复性)的速度比单拷贝DNA顺序要快得多。这种单拷贝顺序在人的基因组中也存在,故可以观察到两个不同的复性过程。 14.解答:同源蛋白质,即来自不同物种、但有相同功能的蛋白质,有相同或几乎相同的多 肽链。来自不同物种的这样的肽链的许多相应部位被相同的(不变的)氨基酸占据。显然,编码这样的多肽链的基因在它们的核苷酸顺序中有某些相似性,即在多肽链中不变氨基酸出现在什么位置,编码这些氨基酸的密码子在它们的基因中也出现在相应的部位。因此,也可以预期在它们的基因中有“同源”区。当从这样两种同源生物中分离出的双螺旋DNA 被加热变性、混合,冷却后在两种DNA的同源部位将会形成杂交双螺旋。两种生物的关系越密切,在它们的DNA之间就会出现越多的杂交双螺旋区 15.解答:由于这两个样品的A=T和G≡C对的比例有显著的差别,若忘了给这两个样品贴标签,那么可以通过CsCl密度梯度离心鉴别它们。含G≡C对量高的样品的浮力密度比含A=T对量高的浮力密度大。当在有适当比重的CsCl溶液中离心时,将会给出两条不同位置的带。密度较大的(即距离心底近者)是E.coli DNA。 16.解答:虽然大多数RNA分于是单股的,但它们可通过自身的回折,在那些可以形成氢键的部位形成局部的双螺旋区。在这种双螺旋区内,碱基配对的规则是A与U、G与C。由于存在局部的双螺旋结构,因此,对专一于双股的核糖核酸酶的降解是敏感的。 17.解答:因为核酸外切酶需要作为底物的DNA或RNA具有游离的3‘-末端和5‘-末端,而θ×174 DNA是单股环状分子,没有游离的3‘-末端和5‘-末端。 习题: 1.卵白和卵黄含有蛋白质、糖和脂。如果卵被受精,它就会从单细胞转变成一个复杂的生物。从卵在孵化器中的生态系统考虑,根据该系统以及环境和宇宙的熵的变化,讨论这个不可逆的过程。确信你能十分清楚地界定系统和环境。你是怎样考虑的? 2. 一假想的反应(pH7、25℃、一个大气压): A ←→ B+C 若A的最初浓度是0.2mol/L,在反应达到平衡时,A的浓度只剩下1%,求:①该反应的K'平;②该反应的△G0';③逆反应的△G0' 3.考虑下面的相互转换(25°C), 果糖-6-磷酸 ←→ 葡萄糖-6-磷酸 该反应的K'平为1.97。 ①该反应的△G0'是多少? ②如果把果糖-6-磷酸的浓度调到1.5 mol·L-l,葡萄糖-6-磷酸的浓度调到0.5mol·L-1,△G是多少? ③△G0'和△G'为什么不同? ④在②给出的条件下,如果加入少量的酶加速这种转换,那么达到平衡时△G'将是多少?平衡时果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸的浓度将是多少? 4.计算下面反应在生理条件下的自由能的变化: 磷酸肌酸 + ADP → 肌酸 + ATP 当该反应发生在神经元胞液中时,磷酸肌酸的浓度是4.7mM、肌酸的浓度是1.0mM、ADP浓度是0.20mM和ATP浓度是2.6mM。假定温度是25℃。已知磷酸肌酸水解时的△G0'=–43.0 kJ/mol;ATP合成需要输入30.5 kJ/mol。 32 5.如果把少量的、末端用放射性磷标记的ATP([γ-P]-ATP)加入到酵母抽提液中,在 32 几分钟时间内,大约一半的P放射活性出现在Pi中,但是,ATP的浓度保持不变。请解释。 323232 如果用[β-P]-ATP)代替[γ-P]-ATP做同样的实验,在同样的时间内,P的放射活性不出现在Pi中。为什么? 6.把ATP的水解与热力学不利的反应偶联起来,能显著改变该反应的平衡。①当△G0'= -1 25000J·mol、温度为25℃时,计算能量上不利的生物合成反应A→B的Keq;②当把ATP的水解与反应A→B偶联时,计算该反应的Keq,并把该反应的Keq与①比较;③许多细胞把[ATP]/[ADP]的比例维持在400以上;当[ATP]︰[ADP]为400︰1以及在标准条件下Pi保持恒定时,计算[B]与[A]的比例。并把这个比例与未偶联时的比例进行比较。 7.在标准条件下,在pH7.0,ATP水解的△G0'为–30.5kJ·mol-1。如果ATP是在标准条件下、但在pH5时水解,所释放的自由能是更多还是更少?为什么? 8.在标准条件下,写出下面每对分子自发反应的方向: ① Cyt.f/Cyt.b5 ②延胡索/酸琥珀酸 和CoQ/CoQH2 + ③α-酮戊二酸/异柠檬酸和NAD/NADH +-+ 已知:Cyt.f(Fe3) + e ←→ Cyt.f(Fe2) E0'=0.36 V +-+ Cyt.b5(Fe3) + e ←→ Cyt.b5(Fe2)(微粒体) E0'=0.02 V - 延胡索酸 + 2e ←→ 琥珀酸 E0'=0.031 V CoQ + 2e + 2H ←→ CoQH2 E0'=0.045 V -+ α-酮戊二酸 + CO2 + 2e + 2H ←→ 异柠檬酸 E0'=–0.38 V +-++ NAD + 2e + 2H ←→ NADH + H E0'=–0.32 V 9.下述每对中哪个成员失去电子的倾向大?①苹果酸和琥珀酸;②细胞色素a和细胞色素b。 1.解答:可以把处在发育阶段的小鸡当作一个系统看待;营养物、卵壳以及外部世界当作环境。由这个单细胞转化成一只鸡显著减少了该系统的熵。最初,胚外部的那部分卵(环境)含有复杂的燃料分子(一种低熵状态),当孵化时,其中一些复杂的分子转变成大量的CO2和H2O分子(高熵)。环境熵的增高比小鸡(系统)的熵的减少要大。因此,生命过程是不违反热力学原理的。 2.解答: ①当反应达到平衡时, [A]=0.01×0.2=0.02 (mol/L), [B]=[C]=0.99×0.2=0.198 (mol/L) K'平=([B][C])/{A}=(0.198)×(0.198)/0.02=19.6 0 ②△G'=–2.303RT·log K'平=–2.303×8.315×298×log19.6 =–7.4 kJ·mol/L ③逆反应的△G0'应与正反应的△G0'的数值相等,但符号相反.所以逆反应的△G0'=﹢7.4 kJ·mol/L 3.解答: ①△G0'=–2.303RTlog K'平=–2.303×8.135×298×log1.97=-1.67 kJ·mol/L ②△G'=△G0'+2.303RT log([葡萄糖-6-磷酸]/[ 果糖-6-磷酸]) =﹣1.67+2.303×8.315×298×log(0.5/1.5)=﹣4.4 kJ·mol/L ③在一给定温度下,任何一个反应的△G0'都是一个固定值,而且是在标准条件下(果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸的浓度都是1mol·L-1)定义的。相反,△G是非标准条件下的自由能的变化,它随反应物和产物起始浓度的变化而变化。 ④当反应处在平衡状态时,没有自由能的变化,即△G=0。所以从处于平衡状态的反应中不可能得到能够做功的能量。由于平衡常数大约是2,所以,在平衡时,当有1分子的果糖-6-磷酸存在,就有2分于的葡萄糖-6-磷酸存在。果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸的总浓度是2.0 mol·L-1(1.5+0.5),该混合物的1/3是果糖-6-磷酸,2/3是葡萄糖-6-磷酸。因此, [果糖-6-磷酸]=(2mol/L)1/3=0.67 mol/L [葡萄糖-6-磷酸] =(2mol/L)2/3=1.33 mol/L 4.解答:首先计算标准条件下该反应自由能的变化。根据已知的条件,可以计算该反应的标准自由能的变化是: △G0'=(–43.0 kJ/mol +(30.5 kJ/mol)=–12.5 kJ/mol 在生理条件下, △G'=△G0'+RT ln([肌酸][ATP]/[ 磷酸肌酸][ADP]) -3-3-3 =–12.5 kJ/mol + 2.303 × 8.315 × 298 × log(1.0×10×2.6×10/ 4.7×10× -3 0.2×10) =10 kJ/mol 5.解答:在酵母抽提液中,ATP系统处在动态稳定状态,[ATP]保持恒定,因为ATP消耗的速度等于它的合成速度。ATP的消耗涉及它的末端(γ)磷的释放。由ADP合成ATP涉及这个磷的置换,因此,末端磷经受了快速转换。相反,中间磷(β)只经受相对较慢的转换。 6.解答:①根据在标准条件下自由能变化的公式, -- lnKeq=﹣△G0'/RT=﹣(25000J·mol-1)/(8.315K1mol1)(298)=–10.1 -5 Keq=4.1×10 ②将反应: - A → B △G0'=25 kJ·mol1 与反应: - ATP + H2O → ADP + Pi △G0'=﹣30.5kJ·mol1 偶联时的△G0'是﹢25 +(﹣30.5)=﹣5.5。根据标准自由能变化的公式, lnKeq=﹣△G0'/RT=2.0, Keq=7.5 偶联反应时的Keq比①中反应的Keq大180 000倍。 ③因已知偶联反应的Keq=7.5,因此可以计算当[ATP]︰[ADP]是400︰1以及在标准条 - + 件下Pi保持恒定时,[B]与[A]的比例。 Keq=7.5 =([B][ADP][Pi])/([A][ATP][H2O]) =([B][ADP])/([A][ATP])=[B](1)/[A](400) [B]/[A] =3000︰1 与ATP水解反应偶联使[B]/[A]的比例增大了3000÷(4.1×10-5)=7.3×107 7.解答:ATP水解的总反应式大致是: - ATP4-+H2O→ADP3-+HPO42+H+ - 在标准条件下,ATP4-、ADP3和HPO4-2都是1 mol·L-l,H2O的浓度是55 mol·L-1,并在反应中没有什么变化。在pH7.0时,每摩尔的ATP水解有30.5kJ·mol-1的自由能释放出来。由于H+是反应中产生的,如果H+浓度比较高(pH5.0),平衡会向左移动。因此释放出的自由能减少。 8.解答:电子流动的方向是从具有较负标准还原势的分子流向具有较正标准还原电势的分子: ++++ ① Cyt.b5(Fe2) + Cyt.f(Fe3) → Cyt.b5(Fe3) + Cyt.f(Fe2) ② 琥珀酸 + CoQ → 延胡索酸 + CoQH2 ++ ① ① 异柠檬酸 + NAD → α-酮戊二酸 + NADH + H 9.解答: ①查表可知:草酰乙酸/苹果酸 E'0=﹣0.18 V 延胡索酸/琥珀酸 E'0=﹢0.03 V 在这两个氧化还原对中,苹果酸和琥珀酸都是作为电子的供体。但是,氧化还原对的电势越负,失去电子的倾向越大。因此,苹果酸比琥珀酸具有更大的丢失电子的倾向。 ② 细胞色素a (ox) / 细胞色素a (red) E'0=﹢0.29伏 细胞色素b (ox) / 细胞色素b (red) E'0=﹢0.07伏 这两个氧化还原对相比,细胞色素b的氧化型(ox)与还原型(red)构成的电对具有较负的电 势,因而细胞色素b具有更大的失去电子的倾向。 习题: 14 1.用C标记甘油醛-3-磷酸的一个碳原子,并加入到酵母提取液中。短时间温育之后, 1414 果糖-1,6-二磷酸的C-3和C-4位含有C标记。试问C最初标记在甘油醛-3-磷酸的什么部位上?果糖-1,6-二磷酸的第二个标记从哪儿获得? 2.在肌肉中,醛缩酶催化反应的△G0'=﹢22.6kJ/mol。鉴于此,为什么糖酵解中的醛缩酶催化的反应仍然能向着甘油醛-3-磷酸和磷酸二羟丙酮生成的方向进行? 3.如果把32Pi加入到正在经历糖酵解的无细胞肝脏制剂中,这种标记将会参入到糖酵解的中间物或该途径的产物中吗? 4.为什么某些组织在高浓度氟离子存在下葡萄糖仍能继续产生CO2? 5. 当剧烈运动时,快速的糖酵解提供肌肉收缩所需的ATP。由于乳酸脱氢酶不产生ATP。如果丙酮酸而非乳酸是糖酵解的末端产物,糖酵解会变得更有效吗? 6.已知酵母无细胞抽提物含有酒精发酵所需要的全部酶,把这种抽提物加入到100ml ---- 含有200mmol·L1的葡萄糖、20mmol·L1的ADP、40mmol·Ll的ATP、2mmol·Ll -- 的NADH、2mmol·Ll的NAD+以及20mmol·Ll的Pi介质中,在无氧下保温。 ①假定酒精只要一经形成就从保温介质中移走,那么能形成的最大酒精量是多少(以毫摩尔计)?解释你的回答。 ②一旦介质达到题①中所产生的酒精量后,下述哪种变化最可能允许最大限度地产生酒精?为什么? - (a)使介质中的葡萄糖浓度加倍; (b)加入20mmol·Ll的甘油醛-3-磷酸; - (c)加入20mmol·Ll丙酮酸; (d)加入ATPase。 ③在发生②的变化后,能形成的最大酒精量是多少? 7.①葡萄糖经无氧酵解转变成两分子的乳酸,请在乳酸分子中指出葡萄糖的六个碳原子的位置。②在有氧条件下,丙酮酸可以脱羧生成乙酰CoA和CO2。葡萄糖分子什么位置的碳用14C标记所产生的CO2含有放射性标记? 8.分别计算①葡萄糖、②果糖、③甘露糖和④蔗糖(最初的代谢步骤是:蔗糖+Pi→ 果糖+葡萄糖-1-磷酸;葡萄糖-1-磷酸异构化转变成葡萄糖-6-磷酸)在无氧下净产生的ATP分子数。 9.在氟化物的存在下(必须达到能有效抑制烯醇化酶的浓度),用14C-3标记的葡萄糖合成磷酸戊糖。所形成的磷酸戊糖的什么部位含有放射性标记? ①如果合成仅仅是通过氧化途径,即借助于6-磷酸葡萄糖酸。 ②如果合成进入非氧化途径,即借助于酵解中间物。 10.肿瘤细胞往往缺乏大范围的毛细血管网状系统,且必须在氧供应受限制的条件下运作。请解释为什么肿瘤细胞会吸收更多的葡萄糖和过量产生某些糖酵解酶。 解答: 14 1.解答: C最初标记在甘油醛-3-磷酸的C-1位(醛基碳)。甘油醛-3-磷酸在磷酸丙糖异构酶的催化下,一部分转变成磷酸二羟丙酮: 这样,甘油醛-3-磷酸的C-1位上的放射性标记转变成了磷酸二羟丙酮的C-3位上含放射性标记。在醛缩酶的催化下,甘油醛-3-磷酸和磷酸二羟丙酮缩合成果糖-1,6-二磷酸。结果这样 14 生成的果糖-1,6-磷酸的C-3和C-4位含有C标记: 果糖-1,6-二磷酸的C-3和C-4位的放射性标记分别来自磷酸二羟丙酮的C-3位和甘油醛-3-磷酸的C-1位。 2.解答:在标准条件下,醛缩酶反应的自由能变化(△G0')为﹢22.6kJ/mol。但是,在心肌中,果糖1,6-二磷酸、磷酸二羟丙酮和甘油醛-3-磷酸的浓度不是处于标准浓度(1mM), 0 因此,该反应的实际自由能的变化(△G'为﹣5.9kJ/mol)与△G'很不相同,醛缩酶很容易按糖酵解反应的方向进行,即: 果糖1,6-二磷酸 → 甘油醛-3-磷酸 + 磷酸二羟丙酮 3.解答:在糖酵解反应中,甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化无机磷酸的参入生成1,3-二磷酸甘油酸: ++ 甘油醛-3-磷酸 + NAD + Pi → 1,3-二磷酸甘油酸 + NADH +H 在磷酸甘油酸激酶的催化下,1,3-二磷酸甘油酸中的含放射性标记的32Pi将被转移到ADP上生成ATP: 1,3-二磷酸甘油酸 + ADP → 3-磷酸甘油酸 + ATP 因此,无机32Pi会出现在中间物1,3-二磷酸甘油酸以及该途径的产物ATP上。 4.解答:在高浓度氟离子存在下,糖酵解途径的丙酮酸激酶活性被抑制,柠檬酸循环被阻断,但葡萄糖可进入磷酸戊糖途径被氧化产生CO2。 5.解答:将变得无效。当剧烈运动时,肌肉处在暂时缺氧状态,能量主要通过无氧酵解提供。为了使无氧酵解能持续进行,由甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化产生的NADH必需经乳酸脱 + 氢酶催化,使丙酮酸还原成乳酸,同时使NAD再生,才能使无氧酵解继续运转,从而产生肌肉收缩所需的ATP。因此,如果丙酮酸而非乳酸是糖酵解的末端产物,那么,无氧酵解不能继续运张,ATP的供应将停止。 6.解答:①因为在给定的条件下,只有Pi处于限速浓度,一旦Pi耗尽,发酵就会停止。已知: 葡萄糖 +2Pi + 2ADP → 2分子酒精 + 2CO2 + 2ATP 即每毫摩尔的葡萄糖降解需要2毫摩尔的Pi。所以,能形成的最大酒精量是2毫尔。 ②加入ATPase后能允许酒精量最大限度地产生。因为ATPase能催化ATP水解生成ADP 和Pi。Pi可以通过该酶作用产生。 ③从理论上讲,能形成的最大限度的酒精量是2×200=400毫摩尔。因为介质中的40毫摩尔的ATP被水解,发酵过程中产生的ATP又可被ATPase水解,这样就产生了一个ATP形成(发酵)和水解(ATPase)的循环,Pi可以不断产生,就象发酵过程中的NADH产生与氧化所形成的循环一样。 7.解答: ①葡萄糖的碳原子顺序标数从羰基碳开始,直到末端一级醇羟基,分别以1、2、3、4、5和6表示;葡萄糖经无氧酵解,生成两分子的乳酸。乳酸分子中的羧基碳原子来自原初葡萄糖分子的C-3和C-4,中间碳位的原子源自葡萄糖的C-2和C-5,甲基碳原子来自葡萄糖的C-1和C-6。②丙酮酸脱羧产生的CO2来自丙酮酸的羧基碳,因此,只要用14C标记葡萄糖的C-3或C-4或C-3和C-4可得到含放射性标记的CO2。 8.解答:①每分子葡萄糖在无氧下经糖酵解总共产生4分子的ATP,但第一阶段两次磷酸化反应消耗了2分子的ATP,故净产生2分子的ATP。 ②在肌肉细胞中,果糖在果糖激酶催化下(消耗1分子的ATP)转变成果糖-6-磷酸,后者可直接进入糖酵解途径,净产生2分子的ATP。如果反应发生在肝细胞中,果糖先经磷酸果糖激酶催化转变成果糖-1-磷酸,后者经果糖-1-磷酸醛缩酶作用转变成磷酸二羟丙酮和甘油醛。甘油醛再经甘油醛激酶催化生成甘油醛-3-磷酸。磷酸二羟丙酮和甘油醛-3-磷酸都是糖酵解的中间物,能继续进行糖酵解反应。因此,每分子果糖在肝细胞中经糖酵解同样可净产生2分子的ATP。 ③甘露糖是葡萄糖C-2的差向异构体,己糖激酶能识别甘露糖,将其转变成甘露糖-6- 磷酸。甘露糖-6-磷酸再经甘露糖-6-磷酸异构酶催化生成糖酵解的中间物果糖-6-磷酸。因此,甘露糖在无氧下经糖酵解能净产生2分子的ATP。 ④蔗糖经水解产生一分子的果糖和一分子的葡萄糖。果糖和葡萄糖经糖酵解分别净产生 2分子的ATP。所以一分子的蔗糖经糖酵解净产生4分子的ATP。 9.解答:①磷酸戊糖的C-2位含有14C标记。因为葡萄糖经6-磷酸葡萄糖酸转变成磷酸戊糖是磷酸己糖支路的第一阶段,即氧化脱羧阶段,脱羧部位是原初葡萄糖的C-1位。 ②磷酸戊糖的C-3位以及C-1位和C-2位都含有放射性标记。在此过程中,葡萄糖转变成糖酵解的中间物果糖-6-磷酸(C-3含有标记)和甘油醛-3-磷酸(C-1含有标记,碳位数的转换见第3题)。糖酵解生成的果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸经转酮醇酶和转醛醇酶催化的逆反应,所生成的磷酸戊糖的C-3位以及C-1位和C-2位含有放射性标记 10.解答:若将葡萄糖以无氧酵解的方式代谢为乳酸,每分子的糖所产生的ATP比正常细胞在有氧下代谢葡萄糖产生的ATP少得多,因此,需要更多的葡萄糖经无氧酵解被代谢才能产生细胞所需的足够的ATP,葡萄糖在无氧下转变成乳酸的速度也比在有氧下高出很多。处在缺氧环境下的肿瘤细胞会吸收更多的葡萄糖,也许过量产生某些糖酵解的酶,可以为加强该途径的运转作出必要的补偿。 习题: 1.丙酮酸氧化脱羧反应的最后两步反应并不涉及丙酮酸分子中的任何一个碳原子,但是这两步反应仍然是丙酮酸脱氢酶复合物催化活性所必需的。为什么? 2.在糖酵解和柠檬酸循环中,除琥珀酸脱氢酶催化的反应利用FAD作为电子受体外,其他所有脱氢步骤都利用NAD+作为电子受体。请对此作出解释。 3.丙二酸是琥珀酸脱氢酶催化反应的的一种竞争性抑制剂。解释为什么增高草酰乙酸的浓度能够克服丙二酸的抑制作用。假定这一反应发生在肝脏制剂中。 4.当维持柠檬酸循环中间物适当浓度时,回补反应容许该循环把它的中间物提供给生物合成反应。写出由丙酮酸净合成柠檬酸的反应方程式。 5..乙酰CoA能抑制二氢硫辛酰胺转乙酰基酶(丙酮酸脱氢酶复合物的E2组分)的活性,但它却能激活该酶复合物的丙酮酸脱氢酶激酶组分的活性。乙酰CoA的这两种不同的作用与该酶复合物总的调节是一致的吗?请解释。 6.①丙氨酸降解产生丙酮酸,亮氨酸降解产生乙酰CoA。这两种氨基酸的降解能为柠檬酸循环的中间物库作出补充吗?②储存在动物脂肪组织的三酰甘油是能量的重要来源。脂肪酸降解产生乙酰CoA,后者能激活丙酮酸羧化酶。该酶的激活为什么会有助于从脂肪酸获得能量? 7.磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是一种与动物体内磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶不同的酶。该酶催 化的反应中不需要ATP,也不需要生物素的参与。但是这个酶的活性测定采用的是一种间接的方式,即将该酶的羧化反应与苹果酸脱氢酶催化的反应偶联,这样就使该酶的测定变得容易了。请指出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的这种活性测定的生化基础。 8.把少量的草酰乙酸或苹果酸加入到切碎的鸽子胸肌悬浮液中,刺激该制剂消耗氧。令人惊奇的是,当测定氧消耗量时,其氧的消耗量大约是使加入的草酰乙酸或苹果酸完全氧化所需的氧消耗量的7倍。①为什么草酰乙酸或苹果酸的加入会刺激氧的消耗?②为什么氧的消耗量比加入的草酰乙酸或苹果酸完全氧化所需的氧消耗量大得多? 9.在乙酰CoA(它是丙酮酸羧化酶的一种正调节物)缺乏下,丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化的速度是很低的。如果你刚吃完富含脂肪酸、但低糖类的食物,这种调节特性是如何关闭葡萄糖氧化成CO2和H2O、但却增高脂肪酸衍生的乙酰CoA氧化的速度? 10.红细胞在缺氧下对柠檬酸循环速度有什么影响? 习题: 1.解答:在丙酮酸脱氢酶复合物催化的反应中,氧化型的硫辛酸接受来自焦磷酸硫胺素的一个乙酰基,并被还原为二氢硫辛酸。由于硫辛酸在下次循环中被重新利用,因此它必须重新被氧化。二氢硫辛酸的氧化是由二氢硫辛酸脱氢酶的辅基FAD完成的,而FAD在下次循环中也被利用,它也必须重新被氧化,使NAD+还原为NADH。 2.解答:因为: - 琥珀酸 →延胡索酸 + 2H+ + 2e E0'=﹣0.031 V FAD + 2H+ + 2e → FADH2 E0'=﹢0.03 V 总反应:琥珀酸 + FAD →延胡索酸 + FADH2 △E0'≈0 V △G0'=﹣nF△E0'=﹣2×23062×0=0 但是,若以NAD+作为该反应的电子载体,其情况是: - 琥珀酸 →延胡索酸 + 2H+ + 2e E0'=﹣0.031 V - NAD+ + 2H+ + 2e → NADH + H+ E0'=﹣0.3 15 V 总反应:琥珀酸 + NAD+ →延胡索酸 + NADH + H+ △E0'=﹣0.3 51 V △G0'=﹣nF△E0'=﹣2×23062×(﹣0.3 51 ) =﹢67.3 kJ·mol/L + 若琥珀酸被NAD氧化,则有一个很大正值的△G0',这对该反应是很不利的。但是,琥珀酸若被FAD氧化,其△G0'接近于零。 3.解答:通过加入更多的底物(在该反应中,底物是琥珀酸)可以克服竞争性抑制作用。草酰乙酸之所以能克服丙二酸的抑制作用,是因为它能通过柠檬酸循环转变成琥珀酸。 4.解答:为了合成柠檬酸,丙酮酸必须通过丙酮酸羧化酶催化转变成草酰乙酸: 丙酮酸 + CO2 + ATP + H2O → 草酰乙酸 + ADP + Pi 此外,丙酮酸在丙酮酸脱氢酶复合物催化下,氧化脱羧转变成乙酰CoA: ++ 丙酮酸 + CoASH + NAD → 乙酰CoA + CO2 + NADH + H 在柠檬酸合酶催化下,草酰乙酸与乙酰CoA缩合,生成柠檬酸: 乙酰CoA + 草酰乙酸 → 柠檬酸 + CoASH 所以由丙酮酸净合成柠檬酸的反应是: ++ 2丙酮酸+ATP+NAD+H2O → 柠檬酸+ADP+Pi+NADH+H 5.解答:乙酰CoA对丙酮酸脱氢酶(PDH)复合物两种组分的不同作用都会导致对丙酮酸转变成乙酰CoA反应的抑制。乙酰CoA是直接抑制该酶复合物的E2组分的活性,而乙酰CoA对该酶复合物的E1组分(丙酮酸脱氢酶)的抑制是间接的,这是通过对该酶复合物的丙酮酸脱氢酶激酶组分的激活实现的。丙酮酸脱氢酶激酶催化丙酮酸脱氢酶磷酸化而使其失活。因此,乙酰CoA的这两种不同的作用与该酶复合物总的活性调节是一致的。 6.解答:①丙氨酸降解产生的丙酮酸可以在丙酮酸羧化酶的催化下转变成柠檬酸循环的中间物草酰乙酸。这是哺乳动物的一条主要的回补途径。亮氨酸降解产生的乙酰CoA只能进入柠檬酸循环被降解掉,不能为该循环补充代谢中间物。 ②由于乙酰CoA能激活丙酮酸羧化酶,因而它促进了草酰乙酸直接从丙酮酸产生。于 - 是会有更多的草酰乙酸与脂肪酸降解产生的乙酰CoA缩合,生成柠檬酸。其结果是加快了乙酰CoA经柠檬酸循环被氧化和能量转化的速度,导致更多的ATP由脂肪酸降解产生。 7.解答:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的反应是: 磷酸烯醇式丙酮酸 + CO2 + H2O → 草酰乙酸 + Pi 苹果酸脱氢酶催化的反应是: 草酰乙酸 + NADH → 苹果酸 + NAD+ 从上面的反应可以看出,由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化产生的草酰乙酸可以被苹果酸脱氢酶定量转化成苹果酸,而这一定量转变导致NADH的定量氧化。因此,只要测定NADH在340 nm处的光吸收减少量即可测定出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性。 8.解答:①细胞的呼吸由三个阶段组成:(a)燃料分子降解成乙酰CoA;(b)乙酰CoA进入柠檬酸循环,在该循环中被氧化成CO2,并使NAD+和FAD还原;(c)NADH和FADH2进入电子传递途径,被分子氧所氧化。由于这三个阶段是紧密偶联的,所以氧的消耗是细胞呼吸头两个阶段活性的一种量度。一分子的乙酰CoA进入柠檬酸循环需要一分子的草酰乙酸。由于草酰乙酸其后在循环中重新产生,所以它起了一种催化剂的作用。在该循环中,所有的中间物都起了这种作用。如果该循环的中间物浓度低于使该循环中的酶饱和所需的水平,那么,更多的中间物的加入将加速每种酶反应,从而加速该循环的运转。 ②氧的消耗量比完全氧化加入的草酰乙酸或苹果酸所需要的量要大得多的观察,表明草 酰乙酸或苹果酸在柠檬酸循环中起催化作用。 9.解答: 在肝脏中,脂肪酸的分解代谢增高了乙酰CoA的浓度,它能刺激丙酮酸羧化酶,导致草酰乙酸水平的升高,进而导致加快乙酰CoA进入柠檬酸循环而被氧化的速度。柠檬酸水平的升高抑制了酵解中磷酸果糖激酶的活性,从而关闭了葡萄糖的利用。此外,乙酰CoA浓度的升高抑制了丙酮酸脱氢酶复合物的活性,从而来自酵解产生的丙酮酸的氧化脱羧受到限制。 10.解答:红细胞没有线粒体,不含有柠檬酸循环运转的酶,也不存在以氧为最终电子受体的呼吸链。因此氧的存在与否谈不上有什么影响。 习题: 1.为什么胞液产生的NADH经苹果酸-天冬氨酸穿梭系统跨膜转运进入线粒体所产生的ATP分子数比线粒体本身的NADH所产生的ATP分子数少? 2.大多数脱氢酶对NAD+是专一的,从不同底物上脱下的电子大多数可以集中到同一分子NAD+上,然后以还原型的形式进入呼吸链。但是,线粒体外的NADH必须穿过线粒体内膜才能进入呼吸链被氧化。如果把在C-4用3H标记的NADH加入到含有线粒体和全部胞液酶的鼠肝制剂中,放射性很快出现在线粒体基质中。但是,如果加入在C-7用14C标记的NADH,放射性不会出现在线粒体基质中。关于线粒体外的NADH通过呼吸链被氧化,上述这些观察告诉我们什么样的结论? 3.与电子传递链的其他组分不同,泛醌往往被称为辅酶(CoQ)。它什么样的特征使得它的行为象一种辅酶?泛醌什么部位经受氧化还原?它的类异戊二烯侧链有什么样的功能? 4.有功能的电子转移系统可以用纯化的电子传递链的组分和膜颗粒重新构成。根据下面的每套组分确定最后的电子受体。假定O2存在。 ①NADH、CoQ、复合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ; ②NADH、CoQ、细胞色素c、复合物Ⅱ和Ⅲ; ③琥珀酸、CoQ、细胞色素c、复合物Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ; ④琥珀酸、CoQ、细胞色素c、复合物Ⅱ和Ⅲ。 5.把一种广泛使用的处方止痛药Demerol(地美罗)加入到处在呼吸状态的线粒体悬 + 浮液中,[NADH]/[NAD]和[CoQ]/[CoQH2]的比例增高。哪个部位电子传递复合物被Demerol抑制 6.如果呼吸复合物Ⅱ和Ⅳ在有氧的条件下,在琥珀酸、CoQ和细胞色素c存在下一起保温,将会发生什么样的氧化还原反应?在这一反应系统中,你预期检测到还原型的细胞色素c的量有大的升高吗?为什么? 7.鱼藤酮是一种非常有效的杀虫剂和鱼的毒剂。在分子水平上,它的作用方式是阻止电子从NADH脱氢酶的FMN传递到CoQ上。抗霉素A是CoQH2氧化的强烈抑制剂。 ①为什么昆虫和鱼吸收鱼藤酮后会死亡? ②为什么抗霉素A是动物的一种毒剂? ③假定鱼藤酮和抗霉素A在呼吸链上抑制它们各自部位方面具有同等的效果,那么哪一种是更为有效的毒剂呢? + 8.请叙述由无氧代谢向有氧代谢转变时 [NADH]/[NAD]和[ATP]/[ADP] 发生变化的原因以及由此产生的代谢效应。 9.虽然ATP的合成需要Pi,但ATP合成的速度主要取决于ADP的浓度而不是Pi。为什么? 10.缬氨霉素(Valinomycin)是一种由链霉菌产生的抗菌素。把它加入到活跃呼吸的线粒体中,发生如下几种现象:ATP的产生减少,氧消耗速度增高,热被释放,跨线粒体内膜的pH梯度增高。缬氨霉素是氧化磷酸化的解偶联剂还是抑制剂?请根据该抗菌素对线粒体内膜转运K+的能力予以解释。 11.褐色脂肪是存在于幼年动物颈部和背部的一种脂肪组织,它含有极为众多的线粒体,因而使得这种组织呈褐色的外表。在某些越冬动物和冷适应动物中也能找到褐色脂肪。在褐色脂肪的线粒体中,当NADH被氧化时,每消耗1个氧原于所产生的ATP低于1分子。褐色脂肪组织线粒体的这种低P/O比产生的机制是怎样的?这种低P/O比的生理功能是什么? 习题解答: 1.解答:在苹果酸-天冬氨酸穿梭系统中,胞液草酰乙酸的还原消耗了一个由苹果酸氧化释放到基质中的质子。因此,对于每个被氧化的胞液NADH来说,给质子梯度的贡献减少了一个质子。这就是说,由胞液转移而来的每分子NADH 的电子经电子传递链转移所“泵”出的质子只有9个,比线粒体本身产生的NADH少贡献一个质子。因此,每分子胞液NADH氧化所产生的ATP是2.25ATP而不是2.5ATP。(对此题的回答考虑了穿梭过程中质子的损失。) 2.解答:两种放射性标记的NADH具有如下的结构: 线粒体内膜对NADH是不可通透的,这可通过7-C-NADH不出现在线粒体中的观察而得到支持。但是来自线粒体外的NADH上的还原当量却可以通过苹果酸-天冬氨酸穿梭被转移到线粒体中。在这个穿梭过程中,来自4-3H-NADH上的还原当量(以NADH烟酰胺环C-4位的氧负离子形式)转移给草酰乙酸,后者经苹果酸脱氢酶还原为苹果酸。这样得到的3H-标记的苹果酸跨线粒体内膜被转运。一旦进入到线粒体基质中,3H-氢负离子便转给NAD+,形成有标记的线粒体内的NADH。然后NADH即可通过呼吸链而被氧化。 3.解答:泛醌有许多辅酶特征:它是低分子量物质;它是一种必须从食物中获得的物质;它不是蛋白质,但它是酶促反应(复合物I、Ⅱ和Ⅲ)的辅助因子;它能以游离的或与蛋白质结合的形式出现,它的功能是集中还原当量(象NAD+一样)。泛醌的苯醌部位参与氧化还原反应,能够接受和供出H+和电子。它的长长的类异戊二烯侧链使得其整个分子在膜脂层中是可溶的,因而允许它在半流动的膜中扩散。这一特性是很重要的。因为这使得泛醌能从复合物I或Ⅱ把电子传递到复合物Ⅲ,而这三个复合物都被包埋在线粒体内膜中。 4.解答:①复合物Ⅲ是最后的电子受体。细胞色素c的缺乏阻止了电子进一步通过。②没有电子通过,因为缺乏复合物Ⅰ。③O2是最后的电子受体。④细胞色素c是最终的电子受体。 5.解答:复合物Ⅰ与Demerol相互作用阻碍电子从NADH向CoQ转移。NADH浓度 + 的增高是由于它不能被氧化成NAD。CoQ浓度的升高是由于电子从CoQH2传递给O2,而CoQ则不再还原成CoQH2。 6.解答:当复合物Ⅱ、Ⅳ在题中给定的条件下保温,电子传递只是部分发生,即琥珀酸氧化成延胡素酸,该反应产生的FADH2经复合物Ⅱ传递给CoQ,被还原的CoQ(CoQH2)上的电子不能继续往下传递。 在该反应系统中,还原型的细胞色素c的量不会升高。因为在该反应系统中缺乏复合物Ⅲ(CoQ-细胞色素c氧化还原酶),CoQH2上的电子不能越过复合物Ⅲ直接传递给细胞色素c。这表明在整个呼吸链系统中,电子的传递有着严格的顺序,只能以电势递增的趋势传递,不 14 能越过传递链中间某组分往下传递。 7.解答:①由于鱼藤酮抑制了NADH脱氢酶,阻止电子从FMN传递到CoQ,其结果是降低了ATP产生的速度。如果这一传递部位完全被抑制,ATP不能满足生理上的需要,因而会造成生物死亡。 ②抗霉素A强烈地抑制CoQH2的氧化。由于电于传递与ATP产生是紧密偶联的,因此电子传递的抑制就会对ATP的产生造成抑制。象鱼藤酮一样,抗霉素A也是一种毒剂,因为不能满足生物对ATP的需要。 ③虽然鱼藤酮强烈地抑制NADH脱氢酶,如果电子来源是FADH2,那么电子传递链仍然保留部分的运转。但是,若电子传递链被抗霉素A抑制,电子传递链就会完全停止运转,因为CoQH2的氧化是电子源NADH和FADH2进入呼吸链被氧化的共同步骤。因此,即使鱼藤酮和抗霉素A在它们各自抑制部位上具有相同的抑制效果,但是两者比较,抗霉素A则是更为有效的毒物。 8.解答:由无氧代谢向有氧代谢转变时,容许ATP经由氧化磷酸化产生。ADP的磷酸化 + 增高了[ATP]/[ADP]的比例,进而增高[NADH]/[NAD],因为高的ATP质量作用比降低电子的传递速度。[ATP]和[NADH]的增高抑制它们在糖酵解和柠檬循环中的靶酶,从而降低这些代些过程的强度。 9.解答:在细胞内,Pi的稳态浓度比ADP的稳态浓度高得多。当ADP浓度作为ATP消耗的结果而升高时,Pi的浓度只有很小的变化。因此,Pi不能作为一种调节物。然而ADP却处于限速浓度,ATP合成的速度受ADP浓度的控制。ATP合成的这种控制方式叫做受体控制或呼吸控制。 10.解答:缬氨霉素的加入所产生的效应与解偶联剂的作用是基本一致的。在进行呼吸的线粒体中,当电子传递时,H+质子从基质转移到外侧,产生H+质子梯度和跨膜的电位。用来合成ATP的大部分自由能来自这种电位。缬氨霉素与K+结合形成一种复合物,该复合物穿过线粒体内膜,当一个H+质子通过电子传递而被转移时,一个K+离子亦作相反的转移。结果是膜两侧的正电荷总是平衡的,跨膜的电位亦消失了。于是就导致没有足够的质子推动力推动ATP的合成。换句话说:电子传递和磷酸化作用的偶联被解除了。与ATP合成效率减少相反,电子传递速度显著升高。其结果是H+梯度、氧消耗量以及热量散失都增大。 缬氨霉素是一种专一于K+的离子载体,它增大了线粒体内膜对K+的可渗透性。破坏了跨膜的电位,但未破坏跨膜的pH梯度。解偶联剂,例如2,4-二硝基苯酚,它们能够引起H+的渗漏,不仅破坏了跨膜的电位,而且也破坏了跨膜的pH梯度。 11.解答:褐色脂肪线粒体的低P/O比表明存在着一种天然的解偶联机制,使电子传递与 ATP的合成相分离。电子沿呼吸链传递产生的电化学梯度不能都用来推动ATP的合成,大部分的能量以热的形式散失,用以维持体温。一种生物的热散失是与它的表面积成正比的。幼年动物表面积/体积比例大于成年动物。因此,每单位体重需要产生更多的热来维持它们的体温。褐色脂肪的这种低P/O比表明每产生1分子的ATP需要氧化更多的燃料分子。这种氧化释放出热。 习题: 1.将患有某种肝病的人的糖原样品与Pi、正常的糖原磷酸化酶以及正常的脱支酶一起保温。在这一反应中,所形成的葡萄糖-1-磷酸与葡萄糖的比例是100︰1。该病人最有可能缺乏什么样的酶? 2.肌肉糖原磷酸化酶完全缺乏个体(McArdle's disease,麦卡德尔氏病)由于肌肉痉挛不能强力运动。这种病人的运动将导致细胞内ADP和Pi的增加比正常者高得多,而且在这些病人的肌肉中乳酸不会积累。请解释麦卡德尔氏病这种化学上的不平衡。 3.一分子的膳食葡萄糖完全氧化产生32分子的ATP。若该葡萄糖在它被分解代谢之前以糖原储存,其后又被降解用于氧化产生ATP。计算这一迂回路线所造成的能量损失份额。 4.糖原储积病(GSDs)由于专一性酶的缺乏影响糖原储存和血糖之间的平衡。请指出这类病人下述每种情况的糖原储存量和血糖量:①Von Gierke's((糖原储积病Ⅰ型,或称肝肾型糖原储积病,GSDⅠ)缺乏葡萄糖-6-磷酸酶;②Cori's(糖原储积病Ⅲ型)缺乏淀粉-1,6-葡萄糖苷酶(脱支酶)。 5.在哺乳动物中,生物需要葡萄糖的信号是分泌肾上腺素和胰高血糖素。这两种激素刺激 蛋白激酶的活性。蛋白激酶的激活如何引起糖元降解的加强?又如何影响糖元的合成? 6.许多糖尿病人对胰岛素不作出应答,因为他们的细胞缺乏胰岛素受体。这将怎样影响①进食后即刻循环的葡萄糖的水平和②肌肉细胞中糖原合成的速度? 7.由丙酮酸经糖异生途径转变成葡萄糖的总反应可示如下: 2丙酮酸 + 4ATP + 2GTP + NADH + 2H+ + 4H2O → 葡萄糖 + 2 NAD+ + 4ADP +2GDP + 6Pi -1 △G0'=﹣37.6 kJ·mol 但是,葡萄糖经酵解转变成丙酮酸只净产生2分子的ATP。因此,由丙酮酸合成葡萄糖是一种代价很高的过程。 ①这种高昂代价的生理意义是什么? ②能量的消耗主要用在什么场合? 8.柠檬酸循环什么样的重要产物是由丙酮酸合成葡萄糖所需要的? 9.在进行紧张的运动时,肌糖元降解成丙酮酸,丙酮酸然后被还原为乳酸。在恢复时,乳酸被转移到肝脏,在那里它被氧化成丙酮酸,然后丙酮酸用来合成葡萄糖。丙酮酸的还原和乳酸的氧化都是由同一种酶乳酸脱氢酶催化。请解释为什么代谢物在该酶催化下的流动方向却是相反的? 10.多肽激素胰高血糖素的释放是由于胰脏对低血糖水平作出应答所致。在肝 脏细胞中,胰高血糖素在调节糖酵解和糖异生两个相反途径的活性中起着主要的作用。这种调节作用是通过影响果糖-2,6-二磷酸的浓度实现的。如果胰高血糖素引起果糖-2,6-二磷酸的浓度的降低,将如何导致血糖水平的增高? 习题解答: 1.解答:这种病人缺乏糖原分支酶。正常人的糖原样品被降解时,葡萄糖-1-磷酸与葡萄糖的比例大约是10︰1。葡萄糖-1-磷酸与葡萄糖的高比例表明该病人含有由α(1→4)糖苷键连结的长糖链和很少的由α(1→6)糖苷键连结的分支点。 2.解答:肌肉糖原磷酸化酶的缺乏阻止了糖原转变成葡萄糖。葡萄糖的不足阻止ATP经由糖酵解产生。现存ATP用于肌肉收缩而得不到补充,从而导致ADP和Pi的增加。由于肌肉组织的糖原不能提供可用的葡萄糖,因此没有乳酸的产生。 3.解答:当这1分子的葡萄糖经过糖原的合成和降解,最终净产生得到ATP分子数是31,损失了1分子的ATP,损失份额约为3%。这损失的部分用在了UDP-葡萄糖焦磷酸化酶催化的反应中。 4.解答:①葡萄糖-6-磷酸酶活性(葡萄糖-6-磷酸→葡萄糖+Pi)的缺乏导致细胞内葡萄糖-6-磷酸的积累。葡萄糖-6-磷酸能抑制糖原磷酸化酶的活性并激活糖原合酶的活性,这将阻止肝脏糖原的代谢,其结果是糖原储存增加和肝脏肿大并且血糖水平降低(低血糖症)。②脱支酶的缺乏将导致外层短分支的糖原分子增多。这些分子不能被降解,因此将只有非常少量的糖原降解形成葡萄糖,进而导致血糖水平降低。 5.解答: 这两种激素都能与靶细胞膜上的专一性受体结合,通过G蛋白的介导激活腺苷酸环化酶,导致cAMP水平升高。cAMP使蛋白激酶激活,后者催化磷酸基从ATP转移到磷酸化酶激酶的丝氨酸残基上。被激活的磷酸化酶激酶催化磷酸基从ATP转移到糖元磷酸化酶。糖元磷酸化酶的磷酸化,便使该酶从低活性b形式转变成高活性的a形式。净结果是糖元降解速度增高。 蛋白激酶也能催化糖元合酶的磷酸化(磷酸基从ATP转移至合成酶的丝氨酸残基上)。这种磷酸化使糖元合酶从有活性的a形式转变成低活性的b形式。其净结果是糖元合成的速度降低。从这里我们可以看出,磷酸化作用对糖元磷酸化酶和糖元合酶的活性有相反的影响。 6.解答:①由于细胞缺乏胰岛素受体,不能从循环着的血液中吸收葡萄糖,因而循环着的葡萄糖的水平升高。②胰岛素不能激活肌肉磷蛋白磷酸酶-1的活性,因此糖原的合成不会受到刺激,而且由于细胞缺乏可用的葡萄糖,从而造成糖原的合成极大地减少。 7.解答:①这种高昂代价的生理意义是将能量上不利的反应(糖酵解的逆反应,△ -- G0'=+ 83.6kJ·mol1)转变成能量上有利的反应(糖异生△G0'=﹣37.6 kJ·mol1),从而升高血糖的浓度,或将细胞内生糖物质前体转变成葡萄糖,以糖元的形式贮存起来,达到维持生 理平衡和正常运转的目的。 ②在由丙酮酸转变成葡萄糖的糖异生过程中,丙酮酸不能在丙酮酸激酶的催化下转变成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP),因为该反应在能量上是不可逆的。丙酮酸经过丙酮酸羧化酶以及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的催化,经过一个迂回过程转变成磷酸烯醇式丙酮酸: -1 丙酮酸+CO2+ATP+H2O → 草酰乙酸+ADP+Pi △G0'=﹣2.09 kJ·mol 草酰乙酸+GTP → 磷酸烯醇式丙酮酸+CO2+GDP △G0'=﹢2.93 kJ·mol 丙酮酸+ATP+GTP+H2O → 磷酸烯醇式丙酮酸+ADP+GDP+Pi -1 △G0'=﹢0.64 kJ·mol 这一迂回反应在热力学上是可行的,因为丙酮酸激酶催化的逆反应需要输入31.35 kJ·mol-1自由能。ATP和GTP降解产生的能量输入到了磷酸烯醇式丙酮酸分子中。若以2分子的丙酮酸计,至此已经消耗了2分子ATP和2分子的GTP。 此外,3-磷酸甘油酸转变成1,3-二磷酸甘油酸需要消耗1分子的ATP。这一反应是由磷酸甘油酸激酶催化的。若以2分子的丙酮酸计的话,这里又消耗了2分于的ATP。至此,总共消耗了4分子的ATP和2分子的GTP。 8.解答:由丙酮酸形成葡萄糖需要还原力NADH、以及ATP和GTP。NADH和GTP直接由柠檬酸循环产生,而ATP则可由该循环产生的NADH和FADH2在氧化磷酸化发生时提供。 9.解答:乳酸脱氢酶催化的反应是: 丙酮酸 + NADH + H+ ←→ 乳酸 + NAD+ 在上面的反应中,除了丙酮酸和乳酸外,还有三种其他成员存在,即NADH、H+和NAD+。代谢物流动方向由△G决定,即由所有参加者的各自的浓度决定: △G=△G0'+2.303RTlog([乳酸][ NAD+]/[丙酮酸][ NADH][ H+]) 在紧长活动时,肌肉NADH的浓度高,并且环境是酸性的(因为[H+]也高),这就使得△G比较负,代谢物的流动按丙酮酸还原的方向进行。在恢复时,氧是充足的,肝脏中的NAD+浓度高,并且环境是低酸性的。这些条件有利于肝脏的糖异生作用,降低丙酮酸的浓度。这些浓度的变化使得△G比较正,代谢物的流动是以乳酸氧化的方向进行。 10.解答:果糖-2,6-二磷酸水平的降低导致糖酵解速度降低和糖异生作用的速度的升高。果糖-2,6-二磷酸是糖酵解的磷酸果糖激酶-1的激活剂,降低果糖-2,6-二磷酸的水平将导致糖酵解速度的降低;同时也是糖异生酶果糖-1,6-二磷酸酶的抑制剂。因此,降低果糖-2,6-二磷酸的水平将有利于糖异生作用,增加葡萄糖的合成,从而升高血糖的浓度。 习题: 1.脂肪酸是高度不溶的,对红细胞有毒害作用(裂解红细胞)。脂肪组织中的脂肪经脂肪酶水解产生的脂肪酸经环流的血液运送到靶细胞被氧化利用。 ①当贮存在脂肪组织中的脂肪动用时,其信号是什么? ②该脂肪酶是激素敏感酶吗? ③脂肪酸以什么形式转运到靶细胞? 2.虽然脂肪酸氧化的功能是为ATP的生成提供还原当量,但是,肝脏却不能氧化脂肪酸,除非有ATP存在。为什么? 3.请解释为什么缺乏肉碱-软脂酰转移酶Ⅱ的个体会感到肌肉无力。为什么当饥饿时这种症状更严重?患这种病的个体影响肌糖原的有氧代谢吗? 4.软脂酸完全氧化成CO2和H2O可由下面的总反应表示: 软脂酸 + 23O2 + 129ADP + 29Pi → 16CO2 + 145H2O + 129ATP. 这145分子的H2O是怎样产生的? 5.用14C标记第9位碳的软脂酸在柠檬酸循环正在进行的条件下氧化。14C将出现在乙酰CoA、柠檬酸、丁酰CoA的什么部位?(回答问题时只考虑柠檬酸循环一次。) 6..把甲基碳标记的丙酸加入到肝脏匀浆中,很快产生14C标记的草酰乙酸。请叙述丙酸转变成14C标记的草酰乙酸的过程,并指出14C在草酰乙酸中的位置。 7.柠檬酸转运系统为胞液软脂酸的合成提供乙酰CoA,这一转运系统能为软脂酸的合成提供多少百分比的NADPH? 8.用羧基被14C标记的软脂酸喂养动物,①在生酮状态下, 14C标记将出现在乙酰乙酸的什么部位?②在膜脂合成的条件下,14C标记将出现在二氢鞘氨醇的什么部位? -1 9.业已提出,丙二酸单酰CoA可能是向大脑发送减少胃口效应的一种信号。当喂给老鼠一种浅蓝菌素(cerulenin)的衍生物(称为C75)时,它们的胃口受到抑制,并且迅速失重。已知浅蓝菌素及其衍生物是脂肪酸合酶的有效抑制剂。为什么C75可作为一种潜在的减肥药物。 10.脂肪酸可由乙酰CoA和丙二酸单酰CoA装配成。在纯化的脂肪酸合酶催化的反应 14 中,如果,用C标记乙酰CoA的两个碳原子,并加入过量的丙二酸单酰CoA。结果所合成的软脂酸只有两个碳原子被标记。这两个被标记的碳原子是C-1和C-2还是C-15和C-16?为什么? 11.脂肪酸生物合成的限速步骤是由乙酰CoA羧化酶催化的乙酰COA的羧化反应。只有当乙酰GoA的供应很充足时,该酶的活性才会很高。乙酰CoA的充足供应怎样激活这个酶呢? 12.CO2在脂肪酸的生物合成中是一种必不可少的参加者。CO2的特殊作用是什么?如 14 果把可溶性的肝细胞抽提液与CO2以及脂肪酸合成中所需要的其他组分一起保温,所合成 14 的软脂酸含有C标记吗?为什么? 13.对于软脂酸的生物合成,必须有胞液NADPH的来源。大约一半的NADPH来自胞液中磷酸己糖支路,其余者主要来自(肝脏或脂肪组织)胞液苹果酸酶的作用。苹果酸酶催化下面的反应: 苹果酸 + NADP+ → 丙酮酸 + CO2 + NADPH + H+ 应用该反应和柠檬酸-丙酮酸穿梭证明糖酵解产生的NADH推动脂酸的生物合成。 14.幼年大鼠饲养在缺乏甲硫氨酸的食物中不能健康成长,除非在食物中添加胆碱。为什么? 15. 为什么人及实验动物缺乏胆碱会诱发脂肪肝? 习题解答: 1.解答:①脂肪细胞内的cAMP的水平升高。 ②该脂肪酶是一种激素敏感酶。当肾上腺素、胰高血糖素、促肾上腺皮质激素以及β、α-促脂解激素达到靶细胞(脂肪细胞)的膜表面时,激活腺苷酸环化酶,使ATP转变成环腺苷酸(cAMP),从而导致细胞内cAMP水平升高而激活蛋白激酶。脂肪酶被蛋白激酶磷酸化而激活,使脂肪水解产生脂肪酸。 ③血浆白蛋白是游离脂肪酸的载体。血浆白蛋白是一种很重要的蛋白质,是高溶解性蛋白,分子量约为69 000,由单一肽链组成。该蛋白约占血浆蛋白质的50%。血浆白蛋白与脂肪酸结合成脂蛋白形式。经血液到达各组织后通过扩散使脂肪酸进入细胞而被利用。此外,脂肪酸与白蛋白结合成脂蛋白后可以阻止它形成脂肪酸盐而沉淀下来。 2.解答:脂肪酸要想进入到β-氧化途径。它们首先必须被活化转变成脂酰CoA。这个过程需要输入ATP。 3.解答:肉碱-软脂酰转移酶Ⅱ的缺乏阻止了被活化的脂肪酸正常转运到线粒体内用于β-氧化,用脂肪酸作代谢燃料的肌肉组织因此而不能产生所需的ATP。由于饥饿时没有可用的食物性葡萄糖的提供,因而肌肉无力的症状会更严重。由于糖酵解产生的丙酮酸转运进入线粒体不需要肉碱-软脂酰转移酶Ⅱ,因此,缺乏肉碱-软脂酰转移酶Ⅱ的个体的肌糖原的的代谢不受其影响。 4.解答:一部分H2O分子来自电子传递链中氧的还原反应: C16H32O2 + 23O2 → 16CO2 + 16H2O, 另一部分是ATP的酸酐键形成时释放出来的(注:产生的ATP数按习惯方式计算): 129ADP + 129Pi → 129ATP + 129H2O. 5.解答:软脂酸经过4次β-氧化后,余下的八碳酸的羧基碳含有放射性标记,再经一次β 氧化产生的乙酰-CoA的羧基碳含有标记。含有标记的乙酰-CoA进入柠檬酸循环,使柠檬酸的乙酰基进入部位的羧基含有放射性标记。软脂酸后续继续降解产生的丁酰-CoA没有14C标记。 6.解答:甲基碳标记的丙酸加入到肝脏匀浆后经三种酶(丙酰CoA羧化酶、甲基丙 二酸单酰CoA消旋酶和甲基丙二酸单酰CoA变位酶)催化下转变成琥珀酰CoA。此时琥珀酰CoA的靠近羧基端的次甲基含有14C标记。次甲基含有14C标记的琥珀酰CoA进入柠檬酸循环,产生的草酰乙酸的中间两个碳含有14C标记,但这两个碳分别只占原初标记的50%。 7.解答:软脂酸的合成需要14分子的NADPH。经柠檬酸转运系统从线粒体转运8分子的乙酰CoA到胞液中,可提供8分子的NADPH,它占所需NADPH的57%。 8.解答:①在生酮状态下, 14C标记将出现在乙酰乙酸的两个羰基碳上;②在膜脂合成的条件下,14C标记将出现在二氢鞘氨醇的含羟基的碳上。 9.解答:进食刺激乙酰CoA从糖代谢(糖酵解、丙酮酸氧化)和脂代谢(脂肪酸的氧化)产生。在正常情况下,增高乙酰CoA的浓度导致丙二酸单酰CoA水平的升高(通过乙酰CoA羧化酶反应)。高水平的丙二酸单酰CoA可以起到抑制胃口的作用。C75通过对脂肪酸合酶的抑制,阻止丙二酸单酰CoA用于脂肪酸合成而被移走,从而进一步升高了丙二酸单酰CoA的水平,也进一步降低了胃口。 10.解答:在软脂酸的生物合成中,只需要一分子的乙酰CoA作为“引物”,软脂酸碳链的延长是以每两个碳原子为单位连续地加到羰基末端,每个二碳单位都是来自丙二酸单 14 酰CoA。因此,软脂酸甲基端的两个碳即C-15和C-16含有C标记。 11.解答:当乙酰CoA的供应量很高时,丙酮酸羧化酶被激活,从而可使线粒体内的草酸乙酸的水平升高。于是就增高了柠檬酸循环的活性,随之亦增高了线粒体内的柠檬酸的水平。线粒体内的柠檬酸经特殊的载体转运而进入到胞液中,于是胞液柠檬酸水平亦随之升高。由于柠檬酸是乙酰CoA羧化酶的正调节效应物,因此柠檬酸水平的升高必然会导致脂酸合成速度升高。 12.解答:CO2作为乙酰CoA羧化酶的底物之一参与乙酰CoA的羧化反应。乙酰CoA羧化生成的丙二酸单酰CoA作为二碳单位的供体参与脂肪酸的合成反应。然而合成的软脂酸却不含14C标记。其原因是当丙二酸单酰CoA与乙酰CoA结合到脂肪酸合酶的酰基载体蛋白上时,便发生缩合反应,在缩合反应中,来自14CO2的游离羧基就从丙二酸单酰基上释放出来(见图14-5)。因此,把CO2加到乙酰CoA上起到了在缩合之前激活乙酰CoA的作用。这可以从激活作用只在以ATP水解为代价的前提下才发生来证实。由于CO2在缩合反应中释放出来,所以在所合成的软脂酸分子中不含14C标记(图14-5)。 13.解答: 图14-6给出了对问题的回答 14.解答:大鼠有两条合成磷脂酰胆碱的途径,从头合成和补救途径。从头合成途径需要从 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)转移甲基到磷脂酰乙醇胺上。当食物缺乏甲硫氨酸(一种必需氨基酸) 时,SAM和磷脂酰胆碱的生物合成严重受到损害。另一种途径即补救途径不需要SAM,但需要胆碱。因此,当食物缺乏可利用的甲硫氨酸但有胆碱时,磷脂酰胆碱仍然能合成。 15.解答: 因为磷脂酰胆碱的合成的补救途径需要胆碱。磷脂酰胆碱是在肝脏中合成的,而磷脂酰胆碱是膜和脂蛋白的重要组分。补救途需要1,2-二酰基甘油。如果没有足够的胆碱可利用,那么磷脂酰胆碱的合成受到极大的限制,1,2—二酰基甘油被用来合成三酰甘油,后者不被分泌进入脂蛋白而在肝脏中积累。因此,肝细胞被三酰甘油充塞而成脂肪肝。 习题: 1.大多数转氨酶优先利用α-酮戊二酸作为氨基受体的意义是什么? 2.如果某人的食物富含丙氨酸但缺乏天冬氨酸,他将会显示出天冬氨酸缺乏的症兆吗? 为什么? 3.测定丙氨酸转氨酶的活性的反应系统包括过量而纯净的乳酸脱氢酶和 NADH。在该系统中,丙氨酸消失的速度与分光光度法测定的NADH消失的速度是相等的。该系统是如何运行的?请予以说明。 4。.患严重致命性高血氨的新生儿的肝脏缺乏N-乙酰谷氨酸合酶。用N-氨甲酰谷氨酸喂养这个病孩,他的血氨恢复到正常水平。该酶的缺乏为什么会增高血氨的水平?N-甲酰谷氨酸是怎样减少血氨的水平? 5.为什么高浓度的氨会降低柠檬循环的速度? 6.脑组织中的谷氨酸的浓度大约是10 mmol/L,比其他组织高得多。谷氨酸在脑中的功能是什么?谷氨酸的碳骨架从哪儿来?(注意,对问题的解答不能导致柠檬酸循环的中间物不能减少。) 7.苯丙氨酸最终降解成乙酰乙酸和延胡索酸,因此这个氨基酸是生酮兼生糖氨基酸。但是当缺乏裂解芳香环的酶时,会导致什么现象发生? 8.请写出由下述酶偶联反应合成谷氨酰胺的净方程:①谷氨酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶,②谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶。比较这两个途径对能量和NH4+的需要情况。 9.在培养细胞的介质中加入用15N标记天冬氨酸,15N标记很快出现在多种氨基酸中。请解释所观察到的现象。 10.为什么说谷氨酰胺合成酶是生物体内参与氮代谢的重要的酶之一? 习题解答: 1.解答: 大多数转氨酶催化反应的这一性质能够保证把不同氨基酸上的α-氨基汇集到α-酮戊二酸上生成谷氨酸。谷氨酸或是在天冬氨酸转氨酶的作用下生成天冬氨酸,后者进入尿素循环,参与尿素的合成,或是通过谷氨酸脱氢酶催化脱去氨基,脱下的氨基也参与了尿素的合成。所以,转氨酶催化反应的这一性质的意义是显而易见的,即解决了因转氨基 作用产生的过量氨的去向问题。 2.解答:不会显示出天冬氨酸缺乏的症兆。因为天冬氨酸是一种非必需氨基酸,人体可以通过转氨作用来合成: 谷氨酸+草酰乙酸 ←→ α-酮戊二酸+天冬氨酸 草酰乙酸是天冬氨酸的相应酮酸,是柠檬酸循环的中间物,可由丙酮酸羧化而成,而丙酮酸可由丙氨酸经转氨酶催化产生。所以天冬氨的碳骨架并不缺乏,只需经过转氨反应即可生成。因此不会缺乏天冬氨酸。 3.解答:丙氨酸转氨酶活性测定的这个方法是一种偶联反应试验的例子。在偶联反应中,缓慢的转氨作用的产物丙酮酸很快地被后续反应消耗掉。因此,乳酸脱氢酶催化一种可指示的反应。 丙氨酸+α-酮戊二酸 → 丙酮酸+谷氨酸 ++ 丙酮酸+NADH+H → 乳酸+NAD 由于每使1分子的丙氨酸转氨就要使1分子的NADH消失,因此,丙氨酸消失的速度与NADH消失的速度相等。NADH的消失可通过用分光光度法于340nm观察NADH的消失来监测。 4.解答:N-乙酰谷氨酸合酶的缺乏导致N-乙酰谷氨酸不能合成,N-乙酰谷氨酸是氨甲酰磷酸合成酶1的别构激活剂。氨甲酰磷酸合成酶1是尿素循环中的一种酶,位于肝细胞线粒体内。该酶催化NH4+ - 与HCO3结合生成氨甲酰磷酸。它的低活性将导致NH4+的积累,升高血氨的浓度。N-氨甲酰谷氨酸在结构上与N-乙酰谷氨酸类似,也能激活氨甲酰磷酸合成酶1的活性,促进NH4+的参入,生成氨甲酰磷酸, + 从而达到降低NH4的水平的目的。 5.解答:高浓度的氨将有助于谷氨酸脱氢酶的还原氨基化反应: α-酮戊二酸 + NH4+ + NAD(P)H + H+ → 谷氨酸 + NAD(P) + +H2O 这将减少柠檬酸循环中间物α-酮戊二酸的水平,降低柠檬酸循环的速度。 6.解答:NH4+对脑组织是很毒的,任何一点进入到脑中都必需在谷氨酰胺合成酶的催化下同谷氨酸结合形成中性无毒的谷氨酰胺而解毒。一部分谷氨酰胺然后经血流运输到肝脏,另一部分被用作神经递质或神经递质的前体。谷氨酸的中间前体是α-酮戊二酸,它由葡萄糖转变而成(图15-3)。脑组织对谷氨酸供应的需要是脑组织需要葡萄糖稳定供应的一个原因。 图15-3 7.解答:裂解芳香环的酶是尿黑酸氧化酶(图15-6)。该酶缺乏时,导致尿黑酸积累而产生尿黑酸症。 图15-6 苯丙氨酸和酪氨酸分解代谢 8.解答:① α-酮戊二酸+NH4++NAD(P)H+H+ → 谷氨酸+NAD(P) ++H2O 谷氨酸+NH4++ATP → 谷氨酰胺+ADP+Pi α-酮戊二酸+NH4++NAD(P)H+ATP → 谷氨酰胺+ADP+Pi+NAD(P) ++H2O ② 2 NH4++谷氨酸+2 ATP → 2谷氨酰胺+2 ADP+2 Pi 谷氨酰胺+α-酮戊二酸+NAD(P)H+H+ → 2谷氨酸+NAD(P) + 2 NH4++α-酮戊二酸+NAD(P)H+H++ 2 ATP → 谷氨酰胺+2 ADP+2 Pi +NAD(P) + 谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶的偶联反应比谷氨酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶的偶联反应消耗的ATP多。由于谷氨酰胺合成酶对NH4+的Km比谷氨酸脱氢酶的低得多,因此,当NH4+的水平低时,谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶的偶联反应占优势。当NH4+的浓度受限制时,需要更多的能量花费在氨的同化上。但后一种途径只发生在植物和一些细菌中。 9.解答:天冬氨酸被15N标记的氨基在天冬氨酸转氨酶的催化下转移到α-酮戊二酸上生成谷氨酸。由于转氨反应几乎是接近平衡,而且许多转氨酶都能利用谷氨酸作为氨基的供体,因此,被标记的N很快分布在那些能与谷氨酸进行转氨反应的底物氨基酸中。 10.解答: 谷氨酰胺合成酶催化的反应是: NH3+谷氨酸+ATP→谷氨酰胺+ADP+Pi 这是直接将游离的NH3结合到氨基酸中的两个反应之一。另一个反应由谷氨酸脱氢酶催化。在谷氨酰胺合成酶催化的反应中,NH3以酰胺的形式结合在谷氨酰胺中,而这个酰胺是许多其他含氮化合物的最终氮原子来源。即是说,谷氨酰胺是一种多功能的前体,尤其在植物和细菌中。因此,在细菌中谷氨酰胺合成酶成为多种化合物反馈调节的别构酶就不足为奇了。谷氨酰胺是一种中性无毒分子,在所有生物中,它以它无毒的形式转运和贮存NH3,解除或减轻过量的氨对细胞的毒害。 习题: 1.假定所有底物和辅酶都存在,分别计算IMP、AMP和CTP从头合成所需的ATP数。 2.叶酸辅酶是如何影响核苷酸代谢的? 3.从头合成的嘌呤或嘧啶核苷酸的碱基的什么部位可被下述前体标记?说明被标记的理由。①14C-3标记的丝氨酸;②15N标记的丝氨酸;③14C-2标记的葡萄糖。 4.野生型的E.coli能够合成全部氨基酸,但是某些突变型不能合成某些氨基酸,只有在培养基中加入这些氨基酸才能正常生长。这些突变型叫做氨基酸营养缺陷型。氨基酸除用于合成蛋白质外,也参与其他某些含氮化合物的合成。现有甘氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸等三种营养缺陷型。对于每种缺陷型来说,除蛋白质外,哪些含氮产物不能合成? 5.写出由ADP转变成dADP的总反应。NADPH在这一反应中起什么作用? 6.生长在含少量的14C均匀标记的琥珀酸的培养介质中的细胞,乳清酸的什么部位含 有14C标记? 7.谷氨酰胺的某些类似物不可逆地使与谷氨酰胺结合的酶失活。在这类抑制剂存在下,鉴定那些被积累的核苷酸生物合成中间物。 8.如果将氨甲喋呤(methotrexate)加入到生长细胞的培养基中,能造成对DNA合成的抑制作用吗? 9.为什么说脱氧腺苷对哺乳动物细胞有毒? 10.次黄嘌呤核苷酸(IMP,肌苷酸)在商品上用作助鲜剂。该产品可通过微生物过程利用细菌营养缺陷型 Breribacterium ammoniagenes来生产。该缺陷型需要AMP和GMP才能生长。为什么要用AMP-GMP营养缺陷型而不用野生型的细菌生产肌苷酸? 11.正常细胞在含有胸嘧啶和氨甲蝶呤的介质中培养时会死亡,但胸嘧啶核苷酸合酶缺乏的突变细胞则能存活和生长。请解释。 12.抗菌素重氮乙酰丝氨酸是谷氨酰胺的结构类似物,是催化从谷氨酰胺转移酰胺基到相应受体上的酶的抑制剂。若用重氮乙酰丝氨酸处理活跃合成嘌呤核苷酸的细胞,则会发生什么现象? 习题解答: 1.解答:当合成1分子的IMP时需要消耗7分子ATP;合成1分子的AMP时需要消耗8分子ATP;合成1分子的CTP时需要消耗7分子ATP; 2.解答:在核苷酸代谢中,需要叶酸以四氢叶酸(THF或FH4)作为一碳单为的受体,产生相应的四氢叶酸衍生物。N10-甲酰-四氢叶酸(N10-甲酰-THF或N10-甲酰-FH4)参与嘌呤核苷酸的合成,N5,N10-甲叉-THF参与胸嘧啶核苷酸的合成。 3.解答:嘌呤和嘧啶碱基的各原子来源可示如图所示: ①C-3标记的丝氨酸:C将出现在嘌呤碱基的C-2和C-8位及胸嘧啶碱基的C-5位上的甲基碳。虽然这些部位的碳原子由“甲酸盐”的四氢叶酸衍生物提供,但也可以从丝氨酸转变成甘氨酸的过程中产生的四氢叶酸衍生物提供: 14 14 一碳单位的的四氢叶酸衍生物是可以转换的,因而也就为这些部位的碳原子提供了来源。 ②15N标记的丝氨酸:从上面的反应式中,可以看出,生成的甘氨酸仍含有15N,而甘氨酸的α-氨基氮是嘌呤环N7位的氮原子来源,所以N7位含有放射性标记。 ③14C-2标记的葡萄糖:14C标记将出现在嘌呤碱基的C-5位和嘧啶碱基的C-4、C-5和C-6 位。因为这4个部位的碳原子分别来自甘氨酸和天冬氨酸,而这两个氨基酸的碳骨架均由葡 萄糖提供(图)。 4.解答:嘌呤核苷酸碱基环上的各原子分别来自天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺以及甲酸盐和CO2。因此,凡不能合成天冬氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺的突变型均不能合成嘌呤核苷酸。同样地,嘧啶核苷酸生物合成时,其嘧啶环上的四个原子来自天冬氨酸,而且氨甲酰磷酸合成时亦需要谷氨酰胺。因此,凡不能合成天冬氨酸和谷氨酰胺的突变型也不能合成嘧啶核苷酸。此外,不能合成甘氨酸的突变型也不能合成卟啉化合物。 5.解答: NADPH+H++ADP → NADP++dADP+H2O 在脱氧核苷酸的生物合成中,NADPH作为最初的电子供体,经硫氧还蛋白还原酶和硫氧还蛋白的传递,将电子交给核糖核苷酸还原酶。最后在核糖核苷酸还原酶的催化下,使ADP还原成dADP。在这里,还原剂是NADPH而不是NADH,这与一般的生物合成的情况一样。 14 6.解答: 乳清酸分子中C出现的部位如反应所示(图): 7.解答:抗菌素重氮乙酰丝氨酸(azaserine)及6-重氮-5-氧-正亮氨酸与谷氨酰胺的结构很相似,它们是催化酰胺基从谷氨酰胺转移到相应受体分子上的那些酶的有效抑制剂。在嘌呤核苷酸生物合成中,5-磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶、甲酰甘氨脒核苷酸合成酶和GMP合酶被抑制,造成5-磷酸核糖焦磷酸、甲酰甘氨脒核苷酸和XMP(黄嘌呤核苷酸)的积累。虽然谷氨酰胺也是氨甲酰磷酸合成酶Ⅱ的底物(UMP合成的第一步),但这个酶的其他底物不会造成积累。 8.解答:能。因为氨甲喋呤的结构与四氢叶酸的结构很相似,它作为二氢叶酸还原酶的抑制剂,能阻止二氢叶酸还原为四氢叶酸。于是就阻止了四氢叶酸作为一碳单位载体的作用,因而抑制了DNA前体脱氧胸嘧啶核苷酸以及嘌呤核苷酸的合成。 9.解答:脱氧腺苷抑制核糖核苷酸还原酶活性,阻止DNA合成所需的脱氧核苷酸的合成。 10.解答:野生型细菌产生IMP受AMP和GMP的调节,它们可以关闭嘌呤核苷酸的生物合成。相反,B.ammoniagenes营养缺陷型是IMP过量产生菌(IMP积累)。因为:①IMP不转变成 AMP和GMP(没有反馈抑制);②IMP本身不抑制嘌呤核苷酸从头合成中的第一个酶;③细菌生长需要的AMP和GMP由介质提供,但浓度太低,不能对嘌呤核苷酸从头合成中的第一个酶造成反馈抑制。 11.正常细胞在含有胸嘧啶和氨甲蝶呤的介质中培养时会死亡,但胸嘧啶核苷酸合酶缺乏的突变细胞则能存活和生长。请解释。 11.解答:突变细胞的生长是因为介质含有它们不能合成的胸嘧啶,但是正常细胞能继续合成它们自身的胸嘧啶,从而能将它们有限提供的四氢叶酸转(THF)变成二氢叶酸(DHF)。氨甲蝶呤抑制二氢叶酸还原酶的活性,使得THF不能重新产生。如果不能为核苷酸和氨基酸的合成提供THF,则会造成细胞死亡。 12.抗菌素重氮乙酰丝氨酸是谷氨酰胺的结构类似物,是催化从谷氨酰胺转移酰胺基到相应受体上的酶的抑制剂。若用重氮乙酰丝氨酸处理活跃合成嘌呤核苷酸的细胞,则会发生什么现象? 12.解答: 在嘌呤核苷酸的从头合成途径中,有两种酶5-磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶和甲酰甘氨脒核苷酸合成酶催化的反应都涉及到从谷氨酰胺上转移酰胺到相应受体分子上,故这两种酶均可被抑制。于是就导致5-磷酸核糖焦磷酸的积累以及少量的甲酰甘氨核苷酸积累。其原因是该抑制剂能共价地结合到这类酶的催化部位的氨基酸残基的侧链上。 习题: 1.把生长在含15NH4Cl介质中的E.coli转移到含14NH4Cl的介质中生长三代(总数增加了8倍)。重DNA(15N-14N)在此时相对于轻的DNA(14N-14N)的摩尔比是多少? 2.Cairns在实验中为了跟踪DNA的复制过程,只使用了3H(氚)标记的胸嘧啶核苷。 ①为什么只使用3H标记的胸嘧啶核苷而不使用3H标记的腺苷或鸟苷?②放射性的胸苷是怎样参入到DNA中去的?③为什么使用3H而不使用32P作标记? 3.从E.coli染色体的基因图可知各种基因的位置。出现在处于复制状态的染色体中的基因拷贝数(相对基因频率)可通过杂交实验测定。当DNA快速合成时,有关基因的频率取决于该基因在基因图中的位置。某些有关基因出现的频率以及推测出的相对位置如表19-1所示。根据该信息,当E.coli K-12染色体复制时,确定复制起始和终止的大致位置。 表19-1 在E.coli K-12染色体快速合成的条件下, 有关基因出现的频率以及推测出的相对位置 有关基因的频率 基因 位置 有关基因的频率 基因 位置 1.3 Lac 8 1.8 xyl 79 1.0 trp 27.5 2.0 ilv 83 1.1 his 44 1.7 arg 88 1.2 CysC 59 4.按平均计,E.coli约40分钟完成一次复制。已知E.coli的外形长度约1.4 mm,复制的方式是定点起始双向进行。 ①计算E.coli复制时,每个复制叉解链的速度(轮/min)有多大? ②实验表明,在某些条件下,E.coli每20分钟即可完成一次世代。此时复制叉以多大的速度向前移动?解释你的回答。 ③如果染色体保持完整,那么整个DNA分子的复制叉头部也必须以这个速度旋转,即会引入正的超螺旋。为了保持正常的复制速度,这个问题如何解决? 5.Komberg和他的同事利用E.coli可溶性提取液与dATP、dTTP、dGTP和dCTP混合物一起保温。所有这四种前体的α-位磷原于都用32P中标记。一段时间后,用三氯醋酸处理保温混合物,并收集沉淀。从存在于沉淀中的放射性量确定前体参入到DNA中去的程度。 ①用三氯醋酸处理保温混合物化学基础是什么? ②若有一个前体从保温混合物中省去,实际上没有在沉淀中发现放射性。为什么? ③如果只有dTTP被标记,32P会参入到DNA中去吗?请解释。 ④如果32P是标记在前体的β-位或γ-位磷原子上,会发现有放射性参入吗?请解释。 6.为什么没有发现完全缺乏PolⅠ5'→3'外切酶活性的突变株? 7.在DNA的测序反应中,只是利用Klenow 片段而不是整个大肠杆菌的PolⅠ。为什么? 8.DNA的复制起始是一个很复杂的过程,涉及许多酶和蛋白质因子,SSB蛋白是其中一种。SSB蛋白与DNA相互作用的性质是什么? 9.冈崎片段的合成需要引物。在后随链的合成中需要不断地合成冈崎片段。什么样的因素能沿5'→3'方向模板链有规则间隔地引发RNA引物合成? 10.请预期大肠杆菌下述基因的缺失是否是致死的:①dnaB;②polA;③ssb;④recA. 11.为什么细胞继紫外光照射后使其暴露于可见光,比细胞用紫外光照射后保存在暗处有更大的存活率? 12.为什么需要两种不同的DNA聚合酶复制大肠杆菌染色体? 习题解答: 1.解答:这个实验是Meselson-Stahl实验的延续,它证明E.coil的复制是半保留的。按照半保留复制机制,在该实验条件下,第一代全是重DNA(15N-14N),第二代应有一半是 14 重DNA,第三代应有三分之一是重DNA,即重DNA相对于轻DNA(N-14N)的摩尔比为 0.33。 2.解答:①因为胸嘧啶碱基只出现在DNA分子中,而不出现在RNA分子中。所以,使用3H标记的胸嘧啶核苷(简称胸苷)跟踪DNA的复制过程是很专一的。(胸嘧啶 3 或胸苷容易穿过完整的E.coli细胞)。而H标记的腺苷或鸟苷不仅出现在DNA中,而且也会参入到RNA中。这样就使被标记的化合物成分复杂化,不能对实验作出正确的判断。 ②胸嘧啶核苷在胸嘧啶核苷激酶、核苷单磷酸激酶以及核苷二磷酸激酶的催化下转变成脱氧胸嘧啶核苷三磷酸: *胸苷+ATP → d*TMP+ADP d*TMP+ATP → d*TDP+ADP d*TDP+ATP → d*TTP+ADP 在聚合酶的催化下,d*TTP以d*TMP的形式参入到生长着的DNA链中: (dNMP)n+d*TTP → (dNMP)n﹣d*TMP+PPi ③由于各种核苷酸上的磷酸基在酶的催化下很容易转移,因而使得这种标记在跟踪DNA的生物合成过程没有专一性,提供不出准确的实验结果,不能作出正确的判断。 3.解答:在环状染色体的双向复制中,假定前一轮复制没完成时,新的一轮复制就已经开始。那么离起点越近的基因,它的相对频率在新的染色体中就越高。当DNA合成很快时,靠近复制起点的基因的相对频率可能是靠近复制终点的基因的二倍。因此,起始点必定靠近那些有最高相对频率的基因。在本例中,起始点位于靠近位置83的ilv基因处,终止位置靠近位置27.5的trp基因处。 4.解答: ① (1.4×106)/(3.4×40×2)=(1.4×106)/272=5147轮/min ②在所有营养条件下,在固定的温度下,复制叉移动的速度保持相当的恒定。因此,当E. coli每20分钟完成一次分裂时,复制叉仍以5147轮/分钟(或51470bp/分钟)的速度向前移动。但是,DNA复制的速度是可以改变的,因为DNA复制的总速度由OriC起始的频率决定。当E.coli在营养丰富的培养基中生长时,为了加快复制,当第一轮复制进行到一半时,第二轮复制便在子代起始区(点)上又开始了。由于复制是在两个复制叉上同时进行的,所以第二轮复制的起始,导致产生了四个新的复制叉,加上第一轮复制产生的两个复制叉,总共存在六个复制叉。这就导致多复制叉染色体(multiforked chromosome)的形成(如图17-2所示)。注意,一个多复制叉染色体至少含有4个OriC拷贝。第一轮复制完成(约40分钟)并分裂成两个子细胞时,每个子细胞所含的染色体已经复制了一半,其后每个子代细胞完成一次分裂就只需20分钟。 ③为了保持正常的复制速度,就必须有某种机制将解链产生的正的超螺旋解除。已知拓扑异构酶(E.coli中是DNA gyrases)能在靠近复制叉的头部使一条链瞬间断开。这样,当解链时,只有完整DNA双螺旋的一短片段需要转动。断开的链以完整的单链作为转轴,旋转几圈将正的超螺旋解除之后,断裂处重新接上。复制叉可以继续向前移动。 图19-1 5.解答:①这个方法的化学基础是加入三氯醋酸使DNA沉淀,游离的脱氧核苷酸保留在上清液中。DNA在酸性溶液中磷酸基质子化导致其溶解性降低。 ②32P参入到DNA中是新DNA合成的结果。DNA的合成需要四种核苷酸前体都存在,缺少其中任何一种都不能合成DNA。因此在省去一种前体的情况下,是没有放射性前体出现在DNA中的。 ③如果只有dTTP被标记,仍然有32P参入到DNA中。因为DNA合成需要的其他三种前体仍然存在,只是α-磷原子没有32P标记而已。 ④如果32P不是在α-磷原子位置,是不会有放射性32P参入的。因为DNA聚合酶催化磷酸二酯键形成时,β-和γ-位的磷原子以焦磷酸的形式除去,不出现在DNA分子的磷酸二酯键中。 6.解答:PolⅠ5'→3'外切酶活性是DNA复制所必需的,该活性用于RNA引物的切除,所留下的缺口被DNA填补。该活性的缺乏是致死的。 7.解答:Klenow 片段不具有5'→3'外切酶活性,它可以保证所有被复制的DNA链有相同的5'端,这是根据片段的长度设计测序的需要。 8.解答:SSB蛋白即单股DNA结合蛋白,也叫做螺旋去稳定蛋白,它能同单股DNA紧密结合,而且这种结合还具有协同作用。DNA不是一种静态结构,暂时的、局部的股的分开不断发生,并且可以发生在复制叉的头部。因此,SSB蛋白协同结合到暂时的单股区,实际上是阻止了链的重新结合,降低了DNA的解链温度。换句话说,它帮助了DNA分开成组成股。 9.解答:RNA从DNA模板转录合成可以从称作启动子的DNA部位上开始。但是,在移动着的复制叉,细胞提供了一种可移动启动子或引物体(primosome) 引发RNA引物的合成。引物体能沿5'→3'方向的模板移动,并能在有规则的间隔处起动RNA引物合成的起始。引物体是由多种蛋白质构成的复合物,包括PriA、PriB、PriC、dnaB、dnaC、DnaT蛋白以及引物酶等。在消耗ATP的情况下,它能沿DNA链移动,识别适当的、有规则的间隔顺序,并引导引物酶的结合,允许RNA引物合成的起始。 10.解答:①dnaB编码解螺旋酶DnaB,该蛋白起着DNA链解链的作用。它的缺失是致死的。②polA编码PolⅠ,该酶的缺失导致RNA引物不能切除。因此,该酶的缺失是致死的。③ssb编码单股DNA结合蛋白(SSB),该蛋白可以阻止分开的单股重新结合(退火),SSB的缺失也是致死的。④recA编码RecA蛋白,该蛋白在一般性重组和SOS反应中发挥作用,它的缺失是有害的但不是致死的。 11.解答:紫外光能使DNA损伤,引起胸嘧啶残基二聚化。修复胸嘧啶二聚体的机制之一是由DNA光解酶(photolyase)催化的酶促光激活。这种酶能利用可见光的能量裂解二聚体和修复DNA。因此,当细胞被紫外光照射后转移到可见光下比在暗处能更好的修复DNA。 12.解答:当大肠杆菌染色体复制时,DNA聚合酶Ⅲ是催化前导股和后随股合成的复制体的组分,DNA的复制需要复制体继续沿复制叉移动,这样将会离RNA引物更远。因此,后随股短的RNA引物的切除需要DNA聚合酶Ⅰ。 习题: 1.DNA能与它转录的RNA杂交。但是,为什么E.coli DNA能与所有已知的E.coli RNA 杂交的部分不超过整个DNA的50%? 1.解答:因为E.coli双股DNA中只有一条链上的信息被转抄到RNA上。换句话说,E.coli DNA只有一条链作为转录的模板。可被转录的链称为模板链(有时也称为反义链,antisense strand,因为它与编码链的序列相反),不被转录的链称为编码链(又称为有义链,sense strand)。 2.比较E.coli RNA聚合酶和DNA聚合酶Ⅲ。 2.解答:①结构与功能比较:RNA聚合酶由α、β、β'和ζ亚基组成,有全酶(α2ββ'ζ)和核心酶(α2ββ')之分;全酶催化转录的起始,并发动RNA链的合成,核心酶催化RNA链的延长。DNA聚合酶Ⅲ由α、ε、θ、η、γ、δ和β亚基组成,也有全酶和核心酶之分;DNA新链的合成由DNA聚合酶Ⅲ全酶催化,但不能发动DNA新链的合成,核心酶活性很低,只是一种分离形式。 ②对底物、模板和引物的要求:RNA聚合酶的底物是4种rNTP,需要DNA模板,但不需要引物,DNA聚合酶Ⅲ的底物是4种dNTP,同样需要DNA模板,需要RNA作引物,引发DNA新链的合成。 ③合成方向及方式比较:RNA聚合酶催化新链合成的方向是5'→3',是按不对称方式进 行合成的,DNA聚合酶Ⅲ催化新链合成的方向也是5'→3',但是按反向对称方式进行合成的。 2+2+ ④对金属离子的需要:两者对Zn和Mg都需要。 3.RNA合成的起始不是随机地发生在DNA模板的任一部位,而是发生在DNA的叫做启动子(promoter)的位置。启动子什么样的结构特征有利于RNA聚合酶对结构基因的转录起始? 3.解答:通过对各种原核生物启动子顺序的研究,发现在启动子区存在两个相当守恒的顺序。即在转录起始密码子前(上游)–10和–35区分别有TATAAT和TTGACA的恒定顺序,前者叫做Pribnow box。这就是说启动子富含特征性的A-T碱基对,为RNA聚合酶全酶的识别与结合并起动转录创造了有利条件。 在真核生物中,某些启动子的顺序也已经测定。如同与原核生物启动子一样,于起始点前–25和–75区也存在相应恒定的核苷酸顺序。前者一致的顺序为TATA,叫做Hogness box。在真核生物中,还存在另外一种长度可变的顺序。该顺序强烈影响启动子的活性,促进转录的起始。这种顺序叫做促进子(enhancer),一般位于相应启动子的上游。 4.请解释为什么在一个真核生物基因的–50区插入5 bp DNA片段会减小RNA聚合酶Ⅱ转录起始的速度,而且比在同一部位插入10 bp所造成的影响更大。 4.解答:RNA聚合酶Ⅱ的启动子要素包括–27序列(TATA盒)以及–50区和–100区之间的顺序。插入10 bp将把启动子这些要素分开一轮DNA螺旋的距离,从而减少转录起始所需蛋白质的结合。虽然对转录会造成影响,但是蛋白质结合部位仍然处在螺旋的同一侧,不会造成很显著的影响。插入5 bp(半轮螺旋)则把蛋白质结合部位移到螺旋相反的位置,严重影响蛋白质的结合,使其更难以起动转录。 5.在转录单位的末端存在着依赖ρ因子或不依赖于ρ因子的终止信号,转录进行到此便终止。①ρ因子是一种什么样的物质?它起什么作用?②终止信号特殊的结构与终止有什么关系?5.解答:①ρ因子是一种参与转录终止的蛋白质因子,是一种分子量为200 000的四聚体蛋白。ρ因子存在与否对合成RNA链的长短影响很大,它能辨别DNA上特殊的终止信号,促进RNA产物和RNA聚合酶从模板上释放出来,从而使RNA合成准确的终止。 ②不依赖于ρ因子的信号位于基因的末端,在模板链3'-端的一段胸嘧啶残基之前,以富含G-C的茎-环(stem-and-loop)结构为特征,使转录生成的RNA终端形成发夹结构,从而使RNA聚合酶核心酶和合成的RNA与模板的结合力减弱而释放出来。因此,该终止信号是一种强终止子,不需要ρ因子的参与。依赖ρ的终止信号以双重对称区富含G-C为特征,但其后没有一段胸嘧啶残基。该终止信号只有在ρ因子存在下才被RNA聚合酶识别。因此,它是一个弱终止子。 6.细菌RNA聚合酶以每秒钟70nt的速度使RNA延长,每个转录复合物覆盖70bp的DNA。①一个6000bp的基因每分钟能产生的RNA分子数最多是多少?②在同样时间能同该基因结合的转录复合物数最多是多少?假定转录复合物密集装配在该基因上。 6.解答:①由于转录的速度是每秒钟70nt,每个转录复合物(即RNA聚合酶)覆盖70bp的DNA,因此,当转录复合物同该基因结合并进行转录时,第一分子RNA的合成需要6000nt/70nt=86秒钟。由于转录复合物密集结合在该基因上,在该时间范围内,其后每分子的RNA聚合酶每秒钟完成一次转录并离开DNA模板。每分钟可产生超过60个 RNA分子。②由于每个转录复合物覆盖70bp,在同一时间能同该基因结合的转录复合物数最多是:6000bp/(70bp/转录复合物)=86转录复合物。 7.放线菌素D对原核生物和真核生物转录都有抑制作用吗?能区分这两种类型生物转录的抑制剂有哪些? 7.解答:由于放线菌素D是一种模板抑制剂,能嵌入DNA双螺旋的G-C碱基对之间,将DNA的两条链紧紧的“固定”,不能使其分开而作为模板。因而对两种类型生物的转录均有抑制作用。 利福平和利链菌素(Streptolydigin)只能同细菌RNA聚合酶结合,抑制该酶的活性(两者均能同β-亚基结合,但前者只能抑制RNA合成的起始,后者虽然能抑制起始,但主要是抑制延长)。α-鹅膏草碱只能与真核生物RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ结合,抑制其活性,前者只需低浓度,而后者则需较高的浓度。利用这样的抑制剂能区分这两种类型生物的RNA聚合酶。 8.与DNA聚合酶不一样,RNA聚合酶没有校对活性。请解释为什么缺乏校对活性对细胞是无害的。 8.解答:RNA聚合酶缺乏校对活性使得转录的错误率比DNA复制的错误率高。但是所合成的有缺陷的RNA分子不可能影响细胞的生存力,因为从一个给定基因所合成的RNA 大多数拷贝是正常的,有缺陷的蛋白质只占所合成蛋白质总数很小的百分比,而且转录时产生的错误很快被消除,因为大多数RNA分子的半寿期很短。 9.DNA的大部分顺序被转录成mRNA,然而细胞内的mRNA量却比rRNA和tRNA量少,为什么? 9.解答:因为编码rRNA和tRNA的基因高水平转录,而且这些基因的拷贝数较多,以及生成的rRNA和tRNA相对比较稳定。但编码mRNA的基因一般都是单拷贝的,生成的mRNA的半衰期短。所以,细胞内的mRNA的含量在这三种RNA中最少。 10.当把β-[32P]-ATP与真核生物细胞抽提液(该抽提液能进行RNA的转录和加工)一起温育时,该标记将出现在mRNA分子上吗? 10.解答:32P只出现在mRNA分子的5'-端。mRNA分子5'-端的第一个残基通常是ATP,由于RNA合成的方向是5'→3',当核苷三磷酸加入到正在合成的RNA的3'端时,这个新加入核苷酸的β-位和γ-位的磷酸基以焦磷酸的形式释放出去。当mRNA分子的5'-端形成甲基化的“帽”结构时,只有起始残基γ-位的磷酸基被除去。β-位含放射性标记的磷酸基被保留,并接受来自GTP的GMP基。 11.磷酸丙糖异构酶基因一处内含子的缺失把分支部位移向离3'-剪接受体序列7核苷酸处的新位置。这一缺失对该基因的剪接有影响吗? 11.解答:有影响。一旦U2 snRNP结合到分支部位,它将堵塞U5 snRNP同3'-剪接受体的结合,干扰剪接;而且这种缺失除去了同3'-剪接部位结合所需的大部分连续的嘧啶。这两种因素将阻止mRNA的正确加工,所得到的异常的RNA不能正确的翻译。 12.由于某病毒的感染,抑制了真核生物细胞snRNA的加工。请解释为什么这有利于病毒基因在宿主细胞中的表达。 12.解答:snRNA的加工被抑制干扰了mRNA的剪接,从而使得宿主mRNA不能被翻译,宿主核糖体只用于病毒蛋白质的合成。 13.大肠杆菌基因组大约是4600kb,含有大约4000个基因。哺乳动物基因组大约是3×106kb,至少含有约50 000个基因。大肠杆菌平均基因长度是1000bp。①计算大肠杆菌DNA不被转录的所占的分数。②虽然许多哺乳动物的基因比细菌的基因长,但大多数哺乳动物的基因产物与细菌基因产物的大小相同。计算哺乳动物基因组外显子DNA所占的百分数。 13.解答:①由于大肠杆菌平均基因长度是1000bp,4000个基因所占的DNA长度是4000 kb。因此不被转录的DNA长度所占的所占的分数是:(4600 kb-4000 kb )/4000 kb=0.15=15%.。②由于大多数哺乳动物的基因产物与细菌基因产物的大小相同,一个典型的哺乳动物基因外显子DNA的长度也是1000bp。哺乳动物基因组外显子DNA的总长度是:50 000×1000 bp=50 000 kb。因此哺乳动物基因组外显子DNA所占的百分数是:5×104/3×106=0.017=1.7%.,余下98%是由内含子和其他序列构成。 14.有许多方法允许你把一个完整的真核生物基因导入原核生物细胞。你预期这个基因(例如磷酸丙糖异构酶基因)能被原核生物RNA聚合酶适度转录吗?反过来,如果把一个完整的原核生物基因导入到真核生物细胞,其情形又是怎样的? 14.解答:不能被转录。真核生物基因的启动子不可能含有允许原核生物RNA聚合酶在正确位置准确起始转录的顺序。反过来也是一样,原核生物基因的启动子不可能含有允许RNA聚合酶Ⅱ在正确位置准确起始转录的顺序。当然,如果经过适当改造,前者使其只含有原核生物的启动子或者后者只含有真核生物的启动子启动相应的RNA聚合酶进行转录,可能会得到相应的转录产物。 15.请解释为什么核糖残基O2'-甲基化保护rRNA免遭RNases降解? 15.解答:RNase水解涉及2',3'-环磷酸中间物的形成。核糖O2'-甲基化使核糖2'-OH的缺失,不能形成这样的环状中间物。于是,有这种修饰的rRNA具有抗RNase的能力。 1.单一核苷酸的缺失能因插入4 nt序列而恢复所中断的编码蛋白质基因的功能吗? 2.E.coli无细胞系统能够利用外源的mRNA合成蛋白质。现将三种不同的多聚核苷酸(poly-A、poly-U、poly-C)作为蛋白质合成的模板分别加入到无细胞系统中,并加入ATP、GTP和氨基酸,其中的赖氨酸用14C标记。然后测定14C参入到多肽链中的量,获得如表19-1的结果。为什么poly-A的加入会导致高14C参入到肽链中?若用14C标记的脯氨酸加入到同样的系统中,哪种多核苷酸会产生广泛的参入? 表19-1 加入的多聚核苷酸 14C的参入量(cpm/min) 无 60 poly-A 880 poly-U 58 poly-C 65 3.尽管不同生物的DNA的(A+T)/(G+C)比例变化很大,但是各种生物的氨基酸比例却没有相应大的变化。通过摆动假说如何解释这种观察? 4.一给定的mRNA顺序,如果阅读框已被确定,它将只编码一种多肽的氨基酸顺序。从一蛋白质例如细胞色素c的已知氨基酸顺序,你是否认为编码该蛋白质的氨基酸顺序的信使RNA只有唯一一种吗?为什么? 5.在某一基因的DNA编码链内,密码子ATA突变成ATG。继DNA复制之后,多肽链产物将会出现什么变化? 6..哪些氨基酸可被这样一些密码子编码,即这些密码子可通过单一点突变就可以转变成琥珀(amber)密码子(即终止密码子)? 7.在某些种类的细菌中,密码子GUG起始蛋白质合成,因为完整的蛋白质在它的N-末端总含有甲硫氨酸。起始tRNA是怎样与密码子GUG进行碱基配对?这种配对现象与摆动性有关吗? 8.当异亮氨酰-tRNAIle合成酶与异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)等摩尔混合物一起保温时,大约每100个活化的E﹣(Ile-AMP)就会有一个活化的E﹣(Val-AMP)出现。根据这一点,人们预期,在异亮氨酸参入到蛋白质的过程中,大约每参入100个异亮氨酸,其错误参入(缬氨酸)的频率是1。但是,事实上,实验观察到的错误频率大约比这一频率低35倍。即大约每3500个异亮氨酸残基中出现1个缬氨酸的参入。请对此提出解释。 9.蛋白质合成的起始需要IF-1、IF-2和IF-3等三种起始因子。这三种起始因子是什么类型的生物分子?它们在蛋白质合成起始过程中起什么作用? 10.梭链孢酸(fusidic acid)能阻止EF-G·GDP从核糖体上解离下来,但它不阻止GTP进到EF-G中,也不阻止GTP水解成GDP。假设Leu-Gly-tRNA占据P部位,把梭链孢酸和与下一个密码子相应的aa-tRNA加进去。蛋白质的合成哪一步被阻止?产物是什么以及位于核糖体的什么部位? 11.tRNA对于多肽的合成是绝对需要的。请列举5种不同的、能与tRNA结合或相互作用的细胞组分。 12.列出由U和G随机构成的核苷酸聚合体中所有可能的密码子。哪些氨基酸可以被这种RNA编码? 1.解答:4 nt序列的插入增加了一个密码子并使其后的密码子顺序因增多一个碱基而使其阅读框发生改变。缺失一个核苷酸的阅读框也能会得到适度恢复,但是,基因的功能是不能恢复的。这是因为4 nt的插入使功能上关键氨基酸的密码子中断;或者4 nt的插入产生一个能破坏蛋白质结构的氨基酸的密码子;或者4 nt的插入可能使该基因过早产生一个终止密码子;或者一个核苷酸的缺失发生在远离插入的4 nt,即使阅读框能恢复,但由于插入点和缺失点间分开太远,被改变的密码子太多。 2.解答:外源多聚核苷酸可作为指导蛋白质合成的模板。当14C标记的赖氨酸高脉冲地参入到poly-A指导合成的肽链中时,表明AAA是赖氨酸的三联体密码,而 UUU或CCC都不是赖氨酸的三联体密码,因为它们不能指导合成由赖氨酸构成的肽链。由于CCC是脯氨酸的密码子,因此,可以预期,poly-C的加入会导致14C标记的脯氨酸大量地参入到肽链中去。 3.解答:如果一个氨基酸有多个密码子(简并),那么可变的碱基出现在摆动位置上,即第 三个碱基。前面两个碱基(XY)是高度专一的,第三个碱基可以被取替换。事实上,几乎所有氨基酸的密码子的三联体组成能用下面的符号表示: XYA(或G) 或者 XYU(或C) 注意,摆动位置上的嘌呤总是被另一种嘌呤取代,嘧啶亦是如此。因此,虽然摆动位置上的变化改变了(A+T)/(G+C)比例,但密码子仍保持了对那一种氨基酸的专一。 4.解答:蛋白质的氨基酸顺序受它的mRNA的碱基顺序严格规定,因此进而受它的基因 的碱基顺序严格控制。除甲硫氨酸和色氨酸外的所有氨基酸都有一种以上的密码子。因此,虽然一种密码子只能规定唯一一种氨基酸,但是任何一种氨基酸都可能被一种或几种密码子编码。要想推导出编码已知氨基酸顺序的蛋白质的唯一一种mRNA是不可能的。例如ACA-AAA-CAU-GGU-只能编码Thr-Lys-His-Gly。但是,该氨基酸顺序也可以由AUU-AAG-CAC-GGG编码。 5.解答:DNA的编码链的核苷酸顺序与mRNA的顺序相同,只是由T代替了U。因此, mRNA的该密码子将由AUA变成了AUG,于是就会导致亮氨酸残基被甲硫氨酸残基取代。 6.解答:琥珀突变产生于下面任何一种点突变: XAG、UXG或UAX→UAG XAG密码子编码Gln、Lys和Glu;UXG密码子编码Leu、Ser和Trp;UAX密码子(这里不是终止密码子)只规定Tyr。因此,编码这些氨基酸的密码子可能遭受点突变转变成UAG。 7.解答:起始tRNA的反密码子与GUG配对是通过密码子5'位核苷酸和反密码子3'位的核苷酸之间所形成非标准的G/U碱基对实现的。这种非标准配对与反密码子的摆动性无关,因为反密码子的5'位是摆动位置: 起始tRNA的反密码子 3'—U A C—5' ︱︱︱ mRNA的密码子 5'—G U G—3' 8.解答:当错误的氨基酸仍结合在异亮氨酰-tRNA合成酶的活性部位时,酶本身能识别这 个错误的氨酰腺苷酸E﹣(Val-AMP),并能水解它。这样,在缬氨酸和异亮氨酸之间的识别出现两次。这就导致错误的频率大大减少,实际上的错误频率大约只有1/100×1/35=1/3500。 9.解答:所有这三种因子都是蛋白质。在细胞内的Mg2+浓度下,70S核糖体是不会解离 的。但30S亚基与mRNA结合之前必须从70S核糖体上解离下来,即与50S亚基分离。这一分离过程可被IF-3所促进。一旦30S亚基游离出来,IF-3即与它紧密地结合。它的结合部位靠近16S rRNA的3'-OH端,有助于识别mRNA起始密码于AUG前的非翻译区的前导顺序。 IF-2的功能是:在GTP的存在下,与fMet-tRNAfMet形成一种复合物,促使fMet-tRNAfMet 结合到30S亚基上,然后在IF-1的促进下正确地结合在mRNA的起始密码子上。当fMet-tRNAfMet结合后,IF-3即从复合物上解离下来,使30S与50S亚基的结合部位暴露出来。50S亚基同30S复合物的结合,使GTP水解,促进IF-1和IF-2释放出来。70S起始复合物的形成,便具备了肽链延伸的条件。 10.解答:产物是Leu-Gly-aa-tRNA,它占据着核糖体的P部位。因为肽键的形成以及移位反应能发生。但由于梭链孢酸阻止了EF-G·GDP从A部位上解离下来,因而就阻止了下一个一个氨酰-RNA进入到A部位。 11.解答:①氨酰-tRNA合成酶,它能同tRNA结合并催化tRNA的氨酰化;②细菌IF-2和真核生物eIF-2,它们能同起始氨酰-tRNA结合,并在翻译起始是将其插入到核糖体的P部位;③细菌EF-Tu和真核生物eEF-1α, 它们能同携带氨基酸的tRNA结合,并在肽链延长时将其卸下到核糖体A部位;④核糖体,它是由rRNA和蛋白质构成的分子很大的复合体,含有同tRNA专一结合的A部位和P部位;⑤mRNA,它能通过密码子与反密码子间形成的氢键彼此相互识别。 12.解答:可能的密码子是:UUU、UUG、UGU、GUU、UGG、GUG、GGU、GGG。这些密码子分别编码Phe、Leu、Cys、Val、Trp和Gly。 1.为什么操纵子的基因组织有利于对细菌基因组未鉴定的开放阅读框(ORFs)功能的揭示? 2.为什么lac操纵子结构基因的表达通常处在被阻遏的状态,而trp操纵子的结构基因的表达通常处在消阻遏的状态? 3.为什么在有葡萄糖存在下与乳糖代谢有关酶的合成被有效的阻遏? 4.在lac操纵子中,①lac操纵基因的突变、②lacI基因的突变和③启动子的突变对基因表达的可能影响。 5.E.coli CAP同它相应的乳糖操纵子部位的结合受cAMP的影响,阻遏蛋白的结合受到别乳糖的影响。细胞内的cAMP的浓度受细胞外的葡萄糖浓度的影响,别乳糖受乳糖的影响。请考虑下面三种情况:①把E.coli放置在富含葡萄糖的介质中培养,②把E.coil放入到富含乳糖的介质中培养,③把E.coli放入到含乳糖和葡萄糖的介质中培养。对于上述每种情况,预计(a)对细胞内的cAMP和别乳糖的影响;(b)对CAP和阻遏蛋白质同乳糖操纵子结合的影响;(c)对β-半糖苷酶产生的影响。 6.为什么lac Z基因缺损的大肠杆菌细胞在葡萄糖缺乏下加入乳糖之后半乳糖苷酶活性降低? 7.请预测前导肽顺序的去除对trp操纵子调节的影响。 8.弱化作用的发生需要一个前导区的存在。请预测下述变化对trp操纵子的影响:①整个前导区缺失;②编码前导肽的顺序缺失;③前导区一个AUG发生突变。 9.当E.coli细胞生长在以葡萄糖为唯一碳源的介质中时,突然加入色氨酸,细胞继续生长,每30 min分裂一次。如果①trp mRNA是稳定的(只是很缓慢地降解),②trp mRNA迅速降解,但色氨酸合酶是稳定的,③trp mRNA和色氨酸合酶两者都快速降解,请描述色氨酸合酶活性水平的变化。 10.请解释为什么自然选择对RNA的不稳定性有利。 习题解答: 1.解答:由于编码功能上相关的蛋白质基因往往以操纵子的形式出现,因此,一个操纵子中的一个或几个基因的鉴定有利于推测其余基因的功能。 2.解答:细菌通常优先利用葡萄糖作为碳源,且葡萄糖也是最通用的一种碳源。在有葡萄糖存在的条件下合成与乳糖代谢有关的酶则是一种浪费。因此在有葡萄糖存在的情况下,编码与乳糖代谢有关的酶的基因总是处在被阻遏的状态。只有当以乳糖作唯一碳源时,乳糖的别构形式别乳糖起到一种诱导剂的作用,诱导与乳糖代谢有关酶的表达。因此lac操纵子是酶合成被诱导的例子。 色氨酸是合成蛋白质的的前体,随时都需要。因此,编码与色氨酸合成有关的酶的基因通常处在消阻遏的状态,此时阻遏物处在无活性状态。只有当trp操纵子的结构基因表达的产物催化色氨酸合成过量的情况下,色氨酸作为一种辅阻遏物激活阻遏蛋白,使其结合到操纵基因上,阻抑结构基因的继续表达。所以,trp操纵子是酶合成阻遏的例子。 3.解答:lac启动子相对可分为两部分,即RNA聚合酶结合部位和CRP-cAMP结合部位。CRP(或CAP,叫做分解代谢物基因活化蛋白)-cAMP结合部位富含G·C bp。当CRP-cAMP结合在该部位时,能促近链的分离而有利于RNA聚合酶催化结构基因的转录。但在有葡萄糖存在下,葡萄糖的某种分解代谢物能抑制细菌腺苷酸环化酶的活性,激活磷酸二酯酶,于是 cAMP水解转变成AMP,由此不能得到足够浓度的CRP-cAMP去起动RNA聚合酶对结构基因的转录。于是与乳糖代谢有关酶的表达被有效的抑制。只有当以乳糖为唯一碳源时,才不会存在葡萄糖阻遏的现象,CRP-cAMP水平升高,促进RNA聚合酶对结构基因的转录,从而有利于与乳糖代谢有关酶的合成。 4.解答:①操纵子组成性表达。在操纵基因所发生的大多数突变都会导致阻遏物同操纵基因的结合力显著减弱或失去结合的能力。②或是组成性表达,如同在①中所说的那样;或是持续表达,如果突变破坏了同乳糖和相关的化合物结合的能力,如同像诱导剂那样。③或是增强或是减弱操纵子的表达,取决于突变是否使启动子变得更强或是更弱。 5.解答:①在丰富的葡萄糖存在下,cAMP的细胞内水平是很低的。由于别乳糖是由乳糖产生,因此别乳糖的水平低,并且不受葡萄糖浓度的影响。在cAMP缺乏的情况下,CAP不同启动子部位结合,RNA聚合酶也不能结合到它的进入部位.此外,阻遏蛋白结合到操纵基因上。由于在这样的条件下,别乳糖的浓度很低,因此乳糖操纵子的结构基因不被转录,β-半乳糖苷酶也不会产生。 ②在丰富的乳糖存在下,细胞内的别乳糖的水平显著升高,因为乳糖可被异构化为别乳 糖。在葡萄糖的缺乏下,细胞内的cAMP的水平升高。高水平的别乳糖导致无活性的别乳糖-阻遏蛋白复合物形成,于是这个复合物便从操纵基因上释放出来。此外,高水平的cAMP导致有活性的cAMP-CAP复合物形成。这个复合物可以结合到启动子部位上,允许RNA聚合酶进入。在这些条件下,与乳糖代谢有关的基因被转录,β-半乳糖苷酶产生。 ③在丰富的葡萄糖和乳糖都同时存在下,细胞内的别乳糖水平很高,但cAMP的水平很低。如同②所述,高水平的别乳糖引起阻遏物从操纵基因部位上释放出来,但低水平的cAMP引起CAP从启动子部位上释放出来。在这样的情况下,RNA聚合酶不能进入,尽管阻遏物被解除,但与乳糖代谢有关的基因不被转录。因此,β-半乳糖苷酶不会产生。 6.解答:Z基因编码的产物是β-半乳糖苷酶。lac Z基因的缺损导致β-半乳糖苷酶不能正常产生,因而不能促使乳糖转变成它的异构体别乳糖(β-半乳糖苷酶有时也能催化乳糖发生糖基移位反应生成别乳糖)。因此,lac酶(包括β-半乳糖苷透过酶)都不能合成。 7.解答:前导肽顺序是由弱化基因5'-段的一段顺序(顺序1)编码的。弱化基因存在于trp L内,它的转录产物含有4个互补的片段,它们能形成1,2-茎环和3,4-茎环。由于3,4-茎环及其后面连续的UUU?(类似不依赖于ρ因子的转录终止信号)是一种有效的转录终止信号。因此转录就会在此部位终止。如果顺序1缺乏,不能形成1,2-茎环,则导致2,3-茎环的形成。2,3-茎环阻止了3,4-茎环的形成,转录因此而继续进入到trp操纵子余下部分。在这样的情况下,trp操纵子只受到阻遏物的调节。 8.解答:①如果整个前导区缺失,弱化作用则是不可能的,转录只是单纯由trp阻遏物控制。trp操纵子转录的总速度会增高。②如果编码前导肽的顺序缺失,转录也只由trp阻遏物控制。编码前导肽的顺序缺失,则没有片段1的形成,从而允许形成稳定的2,3茎环(发夹)结构。由于既没有停顿部位(1,2茎环)的形成,也没有终止子(3,4茎环)的形成,因此,已起动的trp操纵子的转录将继续进行。③如果前导区不含AUG,trp操纵子则难以起动转录,由于起始密码子的缺乏,前导肽的合成不会发生,1,2茎环和3,4茎环几乎总处在形成的状态,从而导致转录的终止。 9.解答:①尽管有色氨酸的存在,色氨酸合酶保持高水平;②色氨酸合酶仍保持高水平;③色氨酸合酶水平迅速降低,避免色氨酸浪费性合成。 10.解答:RNA对体内降解的敏感性产生这样一种可能,即通过调整mRNA降解的速度来调节基因的表达。这是自然选择的结果。如果mRNA是稳定的,它也许继续指导翻译,即使细胞不再需要该基因编码的蛋白质,从而造成极大的浪费。
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