GC-MS在代谢组学方面的应用前沿

GC-MS在代谢组学方面的应用前沿

一、 GC-MS在代谢组学方面的核心技术简介

代谢组学是近年来发展起来的系统生物学分支， 旨在揭示生物体受外界剌激后， 体液、细胞及组织等生物样品中内源性代谢物的变化规律。气相色谱质谱联用技术（GC-MS）具有较高的分辨率和检测灵敏度，并且配有标准谱图库，可以方便地鉴别代谢组分，因而在代谢组学中应用广泛。代谢组学主要的分析手段有两种，一种是核磁共振技术，另一种就是色谱-质谱技术，核磁共振技术好处有很多，例如样品制备简单、对样品没有破坏性等，但是也有核磁共振技术对应的缺点，核磁共振技术灵敏度比较低。色谱-质谱技术包括气质联用、液质联用、毛细管电泳-质谱联用技术等等。但气相色谱-质谱技术最为成熟主要因为代谢物有标准的图库，可以方便对代谢组分进行定性鉴别，在代谢组学中应用广泛。 1、 衍生化技术

代谢组学研究的多数是血液、尿液、组织等样本，这些样本挥发性低，为了提高分离度我们必须要将样品进行衍生化处理。主要采用的衍生化方法包括硅烷化反应、酰化作用、烷基化作用及酯化反应。其中硅烷化是将含有质子性基团的化合物与硅烷化试剂形成挥发性的硅烷衍生物。 2、 分析鉴定方法

生物样品中代谢物的种类和数量繁多，对色谱柱温要求较高，我们在实际操作过程中经常用不同的分析方法，例如升温程序。采用GC-MS开展代谢组学的研究优势之一就是又较成熟的代谢物标准谱图库坚定代谢产物。目前最大的3个GC-MS化合物数据库分别是Wiley库（含40万种化合物的谱图信息）、NIST库（含20万种化合物的谱图信息）以及Palisade库（综合上述两个库并添加了一些其他化合物信息，约为60万种化合物的谱图信息）。NIST谱图库是应用最广泛的库。

二、 阅读文献

本篇文献是选取于2014年ACS上的一遍关于代谢组学的文章。文章名称为“用核磁共振

氢谱及气相色谱-质谱联用的方法共同阐述乳头抽吸液的代谢组学研究”。

1、文章背景情况简介：本文首先介绍了乳头抽吸液的大致研究情况，乳头抽吸液( nipple aspirate fluid,NAF ) 是由乳腺导管上皮和腺泡上皮细胞代谢分泌的物质, 其成分的改变能反映乳腺细胞生化代谢和功能状态自NAF被发现以来, 国外学者对其细胞和生物化学成分进行了10余年的探索,文章的导入部分着重介绍了NAF的细胞成分、化学成分级肿瘤生物标记物。随着现代分子生物学的发展和应用, 对NAF中的细胞成分不再仅仅从形态的“ 异形度” 方面进行描述, 更是从分子水平上进行了更为深人的探讨。结果发现,NAF中细胞成分的基因变化与乳腺疾病的发生有关。但是, 由于NAF中获得的细胞成分较少, 难以鉴别肿瘤细胞等原因, 细胞学研究的效果至今尚未肯定。目前NAF中已相继发现10 余种物质, 包括免疫球蛋白等; 脂质、胆固醇、乳糖、激素。NAF中的生物化学成分大多在血液中也可检测出, 但由于N A F在乳腺导管内经过长时间反复浓缩, 所以其含有的生物化学成分具有较高的浓度, 常常是相应血液或尿液浓度的10倍以上。NAF在某些科研领域一直被作为乳腺疾病的检测标记物，希望从中了解乳腺疾病的自然发展史, 揭示其发生发展的机制, 从而进一步为乳腺疾病的预防、诊断和治疗提供直接依据。

2、文章的创新点：这篇文章最好的地方在于用了新的分析方法对NAF进行分析，对于NAF的分析在之前都没有用过NMR和GC-MS技术，更没有两种技术共同鉴定的报道。这篇文章的样本来自于4个绝经前期的女性和四个绝经后期的女性。通过NMR和GC-MS技术，一共有38

种代谢产物被确定。其中包括氨基酸、有机酸、脂肪酸、糖类。在代谢组学方面的研究，用GC-MS分析NAF在不同的提取物和不同的分析天数时有很高的重现性。总体上来看，有31种代谢物的在统计学中的变差系数低于20%。通过GC-MS分析，对于NAF有8种特异性的代谢产物，对于血浆来说有19种特异性的代谢产物，而24种是共享的代谢产物。对于这24种共同的代谢产物，本篇文章对绝经前期和绝经后期的妇女中NAF和血浆的相关性做了研究，发现除了乳酸之外没有什么相关性，其中乳酸呈显著的负相关（R2 = 0.57; P = 0.03），本文的研究结果表明NAF的代谢完全有别于血浆的代谢，这也为将来乳腺癌发病的风险性研究和干预性的生物反应标记有一定的贡献。这篇文章很好的诠释了两种分析方法的不用与有缺点，并且对于血浆和NAF的分析也做了很好的对比。 3、本文的具体工作：

（1）蛋白组学的研究：由于NAF中含有大量的蛋白质，因此这篇文章试图努力的描述与NAF有关的蛋白质。并且在质谱方面几乎没有关于NAF的蛋白质标记物发现的报道。我们用的是SELDI-TOF-MS，在对比23个患有乳腺癌的患者和5个正常志愿者的NAF中，发现有17种可能的蛋白质的峰，它们出现了过度表达。在用ICAT-MS检测中我们发现，在这同一组中我们对比患有肿瘤的患者的样本和不受肿瘤影响的健康志愿者的样本中有39种特异性的蛋白表达。此外，Sauter等人的研究发现，在未来的临床试验中，用SELDI-TOF-MS检测NAF中的蛋白质的分子量可以用来预测乳腺癌的发病情况。然而，这些发现没有被重复利用，然而再NAF的蛋白组学的研究过程中也没有起到促进乳腺癌标记物进入临床医学的研究范围中。 然而现在有相当大的一部分代谢组学的研究人员致力于研究血浆和血清在乳腺癌的风险预测发现和生物标记的应用方面的内容。然而，在作者的所知范围内，还没有报道过对于NAF代谢组学的研究。文章的结果表明了NMR和GC-MS对NAF的研究可行性，这篇文章的工作也是挑战了新的高度，表明了蛋白组学的生物流体与蛋白质的研究类似，并且揭示对比了NAF的代谢有别于血浆样品的代谢。

（2）本文GC-MS的应用：用GC-MS和NMR鉴定NAF，其中有38个代谢物。用GC-MS鉴定出27个化合物，可见GC-MS的强大。用GC-MS鉴定出的化合物中其中有8种是NAF特有的代谢物，有19种是血浆特有的代谢物，24种是共有的代谢物。随后附表将GC-MS中鉴定出来的NAF和血浆中的代谢物进行对比分析。这其中包括对比从绝经前期的妇女样本和绝经后期的妇女提取出来的NAF和血浆样品。这细节的分析就不阐述了。GC-MS具有很高的灵敏度，这对于样本的分析有很大的帮助。

对于样品的水溶性部分进入GC-MS的检测甲氧化/硅烷化的需要两步的衍生化反应。在减压干燥之前加入用13C标记的葡萄糖(20μL, 1 mM)，用13C标记的丝氨酸(20μL, 1 mM)，和十四烷酸(10μL, 1.5 mg/mL)共同作为内标物质。干燥的样品首先在20微升的无水吡啶中用20mg/ml的甲氧基盐酸盐溶液进行甲氧化并在保持温度30摄氏度的情况下反应90分钟。之后样品再进行甲硅烷基化，方法是加入80微升甲基三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺（其中含有1%的三甲基氯硅烷），恒温37摄氏度反应30分钟。衍生化后加入溶有氟联苯无水吡啶(10μL, 1 mM)作为标准物质，然后将样品转移到玻璃样品瓶中。

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