酵母表达系统步骤

更新时间：2023-10-02 03:25:01 阅读量：综合文库文档下载

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毕赤酵母表达系统步骤

（参考Invitrogen公司说明书）：

一、 pPICZαA、B、C质粒以及DH5α菌株的保存

1 取0.5μl pPICZα A、B、C质粒，热击转化DH5α，在低盐LB（含有25μg/ml Zeocin）的平板上37℃培养过夜。 2 挑取转化子，甘油保存。二、载体构建

1 将目的基因构建到pPICZα载体上，转化DH5α，用Zeocin筛选转化子。

2 提质粒酶切鉴定或PCR鉴定 3 载体测序

测序可用α-Factor引物或5’AOX1引物，3’AOX1引物三、线性化DNA

1 提取足够量的质粒DNA（一次转化至少需要5-10μg质粒） 2 酶切线性化10μg构建好的载体，同时酶切空载体做对照，根据载体选择线性化酶切位点（样品分管酶切），pPICZα载体在5’AOX1区域有三个酶切位点可选择：SacI、PmeI、BstXI 3 取1-2μl酶切产物跑电泳，确定是否酶切完全； 4 过柱纯化线性化质粒（用50μl EB洗脱）；四、线性化DNA的去磷酸化处理线性化质粒 43μl CIAP Buffer 5μl

CIAP酶 2μl

四、总体积为50μl的样品37℃ 1h，过柱纯化，用30μl ddH2O洗脱；五、感受态细胞的制备

实验前准备：无抗性YPD平板一个、无抗生素液体YPD培养基，100μg/ml Zeocin YPD 平板和液体、50ml离心管两个、500ml预冷的无菌水、20ml 1M 山梨醇（灭菌预冷的），0.2cm预冷的电击杯；

1 YPD平板划线培养菌，30℃培养2-3d；

2 50ml三角瓶中，加入5ml YPD，挑取酵母单菌落，30℃培养过夜； 3 吸取0.5ml菌液，加入至含有200ml新鲜YPD的1L三角瓶中，30℃，225rpm/min培养至OD值1.3-1.5； 4 1500g，4℃离心5min收集菌体； 5 40ml冰预冷的无菌水重悬沉淀； 6 1500g，4℃,5min； 7 30ml无菌水重悬； 8 1500g，4℃,5min； 9 10ml 1M 山梨醇重悬； 10 1500g，4℃,5min；

11 加入1ml山梨醇，重悬冰上放置，直接做转化，或加入灭菌甘油每管80ul分装，冻存于-80℃(长时间保存会影响转化效率)；六、电击转化

1 5-10μg线性化DNA（20μl<）与80ul上述感受态细胞混合，转移

至预冷的0.2cm电击杯中（点击条件：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω，电击时间为4～10msec）； 2 冰上放置5min

3 电击（按生产厂商提供的适合酵母用的参数）

4 迅速加入1ml预冷的1M 山梨醇，转移至1.5ml EP管中 5 30℃静置培养1-2h

（如果要增加存活率，获得更多的转化克隆，可在30℃静置培养1h后，加入1mlYPD培养基，30℃ 200rpm培养1h后取部分涂布与不同浓度抗生素的平板）

6 取50、100、200ul分别涂布于含有Zeocin的YPD平板，30℃培养2-10 d至有菌落出现；

7 如果要筛选多拷贝转化子，将转化克隆混合在一起，涂布在Zeocin浓度为500、1000、2000μg/ml的YPD平板，培养2-3d。七、筛选鉴定 1 菌液PCR鉴定

（1）英俊Invitrogen说明书方法：取10ul菌液在1.5ml离心管中，

加入5μul溶菌酶，30℃ 10min，将产物转移至-80℃ 30min，或者浸入液氮1min，取2-5ul直接做PCR检测。

（2）煮沸冻融法：1ml菌液12000rpm离心2min，收集菌体，500μl

PBS重悬两次，100μl无菌水溶解，沸水浴10min，-80℃冷冻10min，再沸水浴10min后立即涡旋震荡1min，12000rpm离心2min取上清做PCR。