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第四章 菌种选育 1

菌种选育

应用微生物遗传和变异理论，用人工方法(或自然)造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程 。 ? 菌 种选育的目的是为了不断提高发酵工业产品的产量和质量，增加新产品和适应工艺改革的要求。 ? 菌种选育的方向是选育“吃粗粮”、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。 2

自然选育 诱变育种

杂交育种 (有性、准性) 原生质体融合育种

基因工程育种 （详后） 3

一、自然选育

在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育。

自发突变(spontaneous mutation)，也称自然突变，指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味着这种突变是没有原因的。

一般认为引起自然突变有两个原因：即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。 多因素低剂量的诱变效应是指自然突变实际上是由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，例如充满宇宙空间的各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物质（如过氧化氢等） 4

自然突变两种情况：

生产上所不希望的：菌种的衰退和生产质量下 降 对生产有益的： 生产性能提高 5

制备单孢子（单细胞）悬液

适当稀释

在固体平板上分离

挑取部分单菌落进行生产能力测定

经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株 自然选育的一般程序： 6

自然选育简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量等目的。

自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度提高。

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二、 诱变育种 ? 诱变育种就是人为地利用物理或化学等因素，使诱变 对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选 获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。 ? 诱变育种不仅可以提高菌种的生产能力，且可改进产品 质量、扩大品种和简化生产工艺。 ? 目 前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来的。以青霉素为例，1943年开始生产时的效价仅为40U/ml，通过多次诱变育种现已达50000-100000U/ml。

虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目前广泛使用的育种手段。 8

一）诱变育种的一般步骤 诱 变 育 种 的 工 作 程 序 9

1、出发菌株的选择 选择时注意以下几点：

1）选择对诱变剂敏感性强、变异幅度大的菌株作为出发菌株。 2）最好选用已经过生产选育的自发突变菌株。

3）采用具有有利性状的菌株作为亲本，如生长速度快，营养要求低等。

4）由于有些菌株在发生某一变异后会对其它诱变因素的敏感性提高，故有时可考虑选择已发生其它变异的菌株作为出发菌株。例如，在金霉素生产菌的诱变中，失去（黄色）色素的变异菌株作为出发菌株则产量会不断提高。 10

2、单细胞（或单孢子）悬液制备

一般均采用生理状态一致的单细胞或单孢子悬液进行诱变处理。 因为

1）分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂 2）可避免长出不纯的菌落。 ? 处理前，细胞应尽可能达到同步生长状态 ? 细胞菌龄一般在对数期， ? 霉菌的菌丝一般是多核的，所以对霉菌的处理一般应采用孢子悬浮液。 11

若在处理前细胞进行前培养，则变异率可大大提高。 同步化前培养的具体做法：

接种培养24h的斜面入50ml基本培养基中，37oC振荡培养16h，然后在6oC放置1h，以得到同步生长和分裂。将菌体离心并悬浮于营养丰富的前培养基中，37oC振荡培养30-50min。立即降至2oC保藏10min，再离心洗涤两次，悬浮于冷生理盐水中。经分散、过滤、调整细胞密度，制备成菌悬液，供处理用。 12

3、诱变剂及使用剂量的选择

凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素，统称诱变剂。 如紫外线、X-射线、?-射线、快中子、超声波等 硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍 (NTG)、 亚硝酸(NA)、氮芥(NM)、羟胺、ICR类等

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剂 量

确定诱变剂后，诱变剂剂量的选择也是育种工作的一个关键问题。 ? 对 一般微生物而言，诱变率往往随诱变剂剂量的增高而增高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率下降。 ? 目 前的处理剂量已从以前采用的死亡率90-99.9%降低到70-80%，甚至更低的剂量，特别是对于经过一再诱变的高产菌株。 ? 剂量似乎也不宜过低，因为在使用高剂量诱变时，除个别核被诱发变异外，还可以使其它的核破坏致死，最终能形成较纯的变异菌落；另外，高剂量可能引起遗传物质的巨大损伤，产生回复突变少，促使变异后菌株的稳定。

凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合适剂量。 14

处 理 方 法 15

诱变剂的复合处理及其协同效应 16

4、诱变处理后的后培养

表型迟延现象 生理性 分离性 ? 遗 传物质经诱变处理后发生的突变，必须经复制才能表现出来。 ? 研 究表明，诱变后的一小时内必须进行新的蛋白质合成，这个变异才有效。 ? 因 此必须在完全培养基中进行培养才能稳定变异，使菌株表现出高的突变频率。 17

A 不经液体后培养 B 经液体后培养 18

5、变异菌株的筛选

由于经诱变处理后提高产量的变异株仍属少数，所以必须经过大量的筛选工作，才能得到需要的菌株。

初筛 和 复筛 19

在初筛过程中，一般采用观察初筛菌落在平板上的生理效应所呈现的变色圈、透明圈、生长圈或抑菌圈的大小来进行初步测定。 初 筛

要求迅速地从大量菌株中挑选出较好的一些菌，主要应着眼于尽量扩大挑选范围。 例如，测定突变株淀粉酶活力，可把待测菌株的培养液以相同大小和条件浸泡的滤纸片点植于淀粉平板上，经培养后滴加碘液再仔细观察并测定其透明圈的大小。 20

部分微生物菌株经过诱变处理后，变异菌株的菌落形态与生理特性、生产性能变化有一定的相关性，可在初筛时加以利用。

赤霉素产生菌 色素 暗红加深，产量上升 红霉素产生菌 有颜色 产量下降 21

复 筛

在初筛缩小了的范围中选出产量最高的1-2个菌株，主要着眼于在接近生产条件的情况

下精确地测定出菌株的生产性状。

复筛一般是将初筛所得到的菌株接种到三角瓶中做摇瓶培养，然后对其培养液进行定量分析测试。 22

经诱变后，菌种的性能有可能发生各种各样的变异，如营养缺陷、抗性突变、形态变异、生长温度变异等，这些变异均可用各种方法筛选出来. 二）几种重要突变株的筛选 23

1、营养缺陷型菌株的筛选 ◆ 育种标记

氨基酸、核苷酸生产菌株 等 ◆ 影印培养法 夹层培养法

逐个检出法 等 24

影印培养法检出营养缺陷型 25

夹层培养法检出营养缺陷型 26

点植法检出营养缺陷型 27

2、抗性突变株的筛选 ◆ 育种标记

◆ 提高某代谢产物的产量

如 抗氯霉素的解烃棒杆菌突变株比亲株产生的棒杆菌素高3倍。（氯霉素是棒杆菌素的结构类似物）

又如，蜡状芽孢杆菌的抗利福平无芽孢突变株的?-淀粉酶产量提高了7倍。 28

◆ 筛选检出抗药性突变株可用梯度培养皿法 29

3、温度敏感突变型筛选

TS（Ts; ts）突变株 （temperature-sensitive mutant） ? 指仅在某个温度范围内显示与野生型不同表型的突变型。

高温敏感突变型：在某个温度以上显示出和野生型不同表型。 低温敏感突变型：在某个温度以下显示出与野生型不同表型。 ? 如果发生这类突变的基因控制的特性是生长繁殖不可缺少 的，那么就会形成条件致死突变型。 ? 温 度敏感突变型（高温）是最常用的一类条件致死突变型 基因功能研究、育种 30

许可温度(permissive temperature) 保持原来正常性状的温度 限制性温度(restrictive temperature〉

非许可温度 (non-permissive temperature)

显现突变型性状的温度

TS突变株 在许可温度下能正常生长，其表型和野生型没有区别；在非许可温度下不能生长或微弱生长，表性与野生型不同。 31

原因: ? TS突变株的一种重要酶蛋白（例如 DNA 聚合酶、氨基酸活化酶等）在某种温度下呈现活性，而在另一种温度下却是钝化的。

? 原因是由于这些酶蛋白的肽链中更换了几个氨基酸，从而降低了原有的抗热性。

? TS突变株在代谢过程中的各个环节，如核酸合成、蛋白质合成、细胞膜或细胞分裂过程中，某种酶的合成或功能由温度所控制

例如，有些大肠杆菌菌株可生长在 37 ℃下，但不能在 42 ℃生长； T4 噬菌体的几个突变株在 25 ℃下有感染力，而在 37 ℃下则失去感染力等。 32

菌悬液涂布在完全培养基上，置于许可温度下培养 影印到一个完全培养基和两个基本培养基平板上 取基本培养基一皿为一组，置于许可温度下培养；

另取完全培养基和基本培养基各一皿，置于非许可温度下培养 33 34

在许可温度的基本培养基上生长，而非许可温度的基本培养基和完全培养基上都不生长； 根据菌落生长情况，可分两大类：

1）非必需基因突变形成的温度敏感突变株

在许可温度下的基本培养基上生长，非许可温度的基本培养基上不生长而在完全培养基上生长。是一类突变引起失去单一酶但可以补偿功能的TS突变株。 2）必需基因突变引起TS突变株

在许可与非许可温度下基本培养基和完全培养基上全部生长，则为野生型菌株。 35

4、抗反馈调节突变株的筛选 →酶的活性 →酶的合成

调节基因或操纵基因发生突变， 使产生的阻遏蛋白不再能和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因

结构基因突变，使变构酶不再具有结合终产物的能力，但仍具有催化活性 36

通常抗反馈抑制和抗反馈阻遏突变株是通过 抗结构类似物突变的方法筛选出来的

◆ 结构类似物与末端产物结构相似，能与阻遏蛋白或变构酶结合，阻止产物的合成，引起反馈调节作用；但不能代替末端产物参与生物合成

◆ 抗结构类似物突变株即使在结构类似物存在下，仍可合成末端产物 37

5、组成型突变株的筛选

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