昆虫分类学课程论文

中国农业科学院

昆虫分类学课程论文

课程名称: 昆虫分类学 学 期：班 级: 13级硕士8班 学 号: 82101132313 姓 名: 袁 向 东

2014年4月

分子生物学技术和昆虫分类学中应用

摘要：随着生物技术的迅猛发展，分子生物学技术已越来越多地被应用在昆虫的分类学研究中。本文概述

了分子生物学技术在昆虫分类以及遗传进化方面的应用，并且认为分子生物学技术扩展了其在昆虫分类学中的应用范围，该技术的成功应用，极大地提高了昆虫分类学研究的水平，并且随着技术手段的不断进步有着更为广阔的应用前景。

关键字：分子生物技术；昆虫分类学；技术应用

昆虫分类学是研究昆虫的命名、鉴定、描述及其系统发育和进化的科学。它不仅是昆虫学的一个重要分支，而且是昆虫学其他所有分支学科的基础。如果不先对昆虫进行科学的分类，就无法以科学的方式研究昆虫，从而影响到昆虫学其他分支学科研究结果的客观性、可比性和重复性。因此，对昆虫分类学的研究具有重要的现实意义。

传统昆虫分类学主要从昆虫形态特征如外部形传统昆虫分类学主要从昆虫形态特征如外部形态和外生殖器来进行分类鉴别，这是进行昆虫分类的主要方法。但形态分类的方法在较低的分类阶元中有着较大的局限性[1]，如一些近缘种或姊妹种中，比较难确定它们的分类学界线。近年来，分子生物学技术得到了快速发展，并同传统分类学方法相结合，使昆虫分类学研究具有更广阔的前景。由于物种的进化本质上是的进化，因而分子分类学可以在DNA水平更精确地甚至定量地分析物种的进化速度、遗传距离以及由此推断系统关系。近年来，DNA分类法有了很大的发展，越来越受到人们的重视，已成为传统形态分类方法的重要补充。到20世纪80年代末，分子生物学技术正式开始应用于昆虫系统学研究中，并且迅速发展。这些生物技术包括核酸序列分析、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、分子杂交技术、同工酶电泳技术、单链构象多态性(SSCP)及双链构象多态性(DSCP)技术等在鞘翅目昆虫分类学研究中的应用。

一、 分子生物学技术在昆虫分类方面的应用

昆虫的分类鉴定，相当程度上带有人为因素，所产生的问题都是传统形态学方法难以解决的。利用适当的分子生物学方法与传统形态学相结合，是目前国内外许多昆虫研究者所关注的焦点。目前而言，有以下几种技术较为常用。

1.1同工酶电泳技术

由于同工酶是基因的产物，能直接反映基因的异同，易于观察研究，目前已作为一种生

化遗传标志广泛地应用于发育生物学、群体遗传学、系统分类学等各个领域。通过物种同工酶的研究，可以推测物种在基因水平的不同，进而可以推测其血缘关系和进化地位。自20世纪70年代中期以来，应用电泳技术进行昆虫同工酶的研究日益普遍，涉及的昆虫类群有蜉蝣目、蜚蠊目、直翅目、同翅目、半翅目、虱目、双翅目、蚤目、鳞翅目、膜翅目等。在鞘翅目昆虫中，多见于天牛科、瓢甲科、叶甲科。唐桦等通过酯酶同工酶电泳发现光肩星天牛和黄斑星天牛在酯酶带上差异甚微，认为这2种天牛应归属于同1个种[5]。张迎春等分析了瓢虫科2属5种的酯酶同工酶，结果显示属间的酶谱有显著差别，在属内具有某些共性。每个种都具有自己特有的谱型，彼此易于区分。聚类分析显示5个种亲缘关系的远近，与形态分类结果一致。聂传朋等分别于2005年和2007年对叶甲科昆虫酯酶同工酶进行研究，结果表明利用酯酶同工酶分类与传统分类结果基本一致。说明以酯酶同工酶作为研究手段来进行叶甲类昆虫亚科以下阶元的分类是可行的，同时也说明它们酯酶同工酶酶谱的差异和其分类地位是一致的。

1.2核酸序列分析技术

核酸序列分析技术包括DNA的序列分析和RNA的序列分析DNA核苷酸序列的测定常用双脱氧法和化学法，现在双脱氧法DNA列分析已经成为普通实验室可以测定的常规手段且实验手段获得了很大改进由于DNA测序多为重复性的操作DNA。人们在不断地探索各种自动化的途径目前DNA序列分析已能部分地自动化，大大提高了测序效率和精确度在昆虫学领域的应用范围也扩大了，由于一般测序的DNA片段都比较长，因此不可能通过一次测定反应获得所需要的全序列，必须对待测的DNA片段进行亚克隆。将一个完整的DNA片段分成若干个较小的DNA片段，并在适当的载体上得到扩增，借助计算机分析各亚克隆片段之间的重叠序列据此排出前后次序，从而获得整个DNA片段的核苷酸顺序最初的DNA序列分析应用碱基特异性核酸酶法进行。随着DNA序列分析方法的出现该方法显得费时且很不方便，现在RNA分子的核苷酸序列分析也采用了一些DNA核苷酸顺序测定的技术和方法[2]。

目前在昆虫分子进化和分子系统学领域，应用核酸序列分析技术测定昆虫特定DNA和RNA核苷酸序列以比较不同昆虫类群个体的核苷酸顺序(同源核酸据此推断不同昆虫类群之间的演化关系建立符合自然发育的分子系统谱系是昆虫系统发育方面的研究方向，在种内或近缘种的系统发育关系确定方面通常用进化较快的mt核苷酸片段$而对于科、属等高级阶元的系统发育研究中通常用进化较慢的rDNA和rRNA核苷酸片段。

1.3 RFLP技术

限制性片段长度多态性(RFLP)是指用限制性内切酶处理不同的DNA，产生不同长度的限制性片段所呈现的多态现象。可根据酶切图谱，计算类群之间的遗传距离，构建系统树，此方法既可以进行近缘种及种内群体间的比较，同时也可以进行远缘物种的比较，主要用于构建基因组连锁图谱及确定物种间的亲缘关系[3]。由于RFLP技术存在许多局限性：现有的限制性内切酶不可能检出所有的核苷酸改变、酶切所产生的不同长度的酶切片段所能提供的多态信息量有限等，目前在鞘翅目昆虫分类研究中的应用不多，国内主要应用于双翅目、膜翅目等昆虫的快速鉴定。

1.4分子杂交技术

分子杂交是将少量变性的核酸固定在固体支持膜上，用专一性检测互补核酸序列的标记探针与样品进行杂交，再通过反射自显影或酶标颜色反应进行检测。分子杂交的关键是制备特异性强、灵敏度高、具有高比活的探针，目前应用较多的是地高辛和生物素等非放射性标记探针。Lorite等利用原位杂交对叶甲科的微卫星进行了研究。由于分子杂交技术要求对研究类群的遗传背景有一定了解，且该技术相对复杂和昂贵，故在鞘翅目的分类研究中应用并不广泛。

1.5 RAPD技术

随机扩增多态性DNA(RAPD)技术在PCR的基础上，利用随机合成的寡聚核苷酸序列为引物(一般为10个nt)，分别与DNA的2条单链结合，在DNA聚合酶的作用下，对基因组特定区域进行PCR扩增。由于不同物种基因组中与引物相匹配的碱基序列的空间位置和数量都可能不同，所以扩增产物的大小也有可能不同，即扩增片段DNA的多态性反应了基因组DNA相应区域的多态性。此方法的优点是快速简便、反应灵敏，对遗传背景不清楚的材料也能可应用。目前已经广泛应用于同翅目、蜻蜓目、等翅目、直翅目、双翅目、鳞翅目、膜翅目等昆虫的分类研究中。其中在鞘翅目的分类研究中应用最多。安榆林等利用RAPD技术对采自中国和美国光肩星天牛8个地理种群进行遗传关系分析，发现美国的和中网的光肩星天牛种群的样本之间存在显著差异，遗传关系较远。随后，他们又对更多的采自中国、美国和韩国各地的光肩星天牛进行RAPD聚类分析，研究结果与前一结果一致。李志强等利用RAPD技术证实辽宁省不同地域稻水象甲存在遗传差异，并分析了这一差异性对追溯稻水象甲传播过程和开展其传播蔓延控制的意义。张迎春等利用RAPD技术对瓢虫科的6

个种进行亲缘关系分析，该结果与形态学分类结果一致。Scataglini等利用RAPD对来自不同国家的墨西哥棉铃象甲进行系统发育分析，其系统树显示了不同种群的亲缘关系的远近，从而揭示了南美洲是先于棉花的粗放耕作而自然发生的，它们的爆发可能是和耕地的增加相联系的。Taberner等利用RAPD技术分析了糖料作物害虫鞘翅目象甲科的种群遗传特性，并对各个种群之间的关系进行分析，明确了西班牙南部种群间的生态和进化关系[4]。

1.6 SSCP和DSCP技术

单链构象多态性(SSCP)技术的原理是基于序列不同的DNA单链片段，其空间构象亦有所不同，当其在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，其电泳的位置亦发生变化而表现出不同序列单链电泳迁移率的差异，据此判断有无突变或多态性存在。该方法对检测基因的单个碱基置换或短核苷酸片段的插入或缺失的筛查提供了有效而快速的手段。双链构象多态性(DSCP)技术的原理和SSCP基本相似，由于突变引起DNA双螺旋构象不同，从而在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度发生变化。SSCP技术已被广泛应用于人体医学、畜牧学、植物病理学、昆虫和线虫分类学等研究领域。Boge等采用SsCP技术对步甲属进行了种的鉴定[6]，Sedlimair等也应用泛素基因SSCP技术研究了步甲亚属的进化关系。随着分子生物学的迅猛发展，以及核酸序列分析、RFIJ技术、RAPD技术、分子杂交技术、同工酶电泳技术、SSCP以及DSCP等分子生物学技术在昆虫分类研究中的应用和有益探索，或是解决了传统分类中所存在的学术疑难问题，或是验证了传统分类所得出的结论，已显示出其应有的优势和广阔的发展前景。然而分子生物学技术在昆虫研究中的应用时间毕竟不长，还存在不少问题。首先是目的基因或DNA片段的选择，如何在庞大的昆虫DNA文库中选择最有利于昆虫分类、最能反映其进化关系的基因或DNA片段，仍存在较大难度。其次是用不同的目的基因或DNA片段对同一昆虫进行研究，可能会得到不同的结果。再次是分析软件或程序包的应用，目前有大量的分子生物学分析软件，不同的软件或程序包有许多不同的假设和参数，研究者采用不同的分析软件或采用同一软件而设置不同的参数，同样的数据可能会得到不同的结果。

1.7分子生物学技术在昆虫分类鉴定研究中的优点

1.7.1所需DNA量少

由于昆虫个体较小，很难获得足够的DNA样品，且昆虫的研究材料多为标本，DNA降解非常严重，要取得足够的DNA样品，同时又要保证标本的基本完整性，非损伤性取样DNA序列分析是一种以毛发、皮张和陈旧标本等为材料，利用PCR扩增目的片段，进行DNA序

列分析的方法，它所需DNA量非常少。

1.7.2快速、准确

大多数昆虫在不同的发育阶段，形态结构变化很大；不同地理分布的同种昆虫，形态也有差异，因此根据形态学直接进行昆虫鉴定有时会比较困难，特别是昆虫亲缘关系较近物种的早期阶段，形态非常相似，使我们很难对其进行快速、准确的鉴定，这时从DNA水平进行鉴定无疑是目前一种很好的方法[7]。

二、 分子生物学技术在昆虫遗传变异和进化方面的应用

检测和描述种内各种群的遗传结构及变异状况，探讨物种的形成与分化的内在机理。内容包括自然地理种群及社会性昆虫的社会种群研究。通常采用的方法有RAPD ,RFLP ,SSCP和DSCP，而DNA序列测定用于种群研究较少。此方面的研究有:Chapco等采用RAPI对蝗虫种群的研究; Kambhampti等、Ballinger Grabtree等采用RAPI检测按蚊的亚种及种群变异;陈燕茹等采用RAPI分析果蝇的地理种群变异;土文等、贾振宇等用mt DNA的RFLP方法分析果蝇的自然种群;Martinez等研究mtDNA在蚜虫地理种群内的变异; McLain等分析按蚊地理种群中rDNA NTS片段的变异; Pnterka等采用RAPD PCB分析蚜虫种群的遗传变异; Atkinson等采用mt DNA的DSCP方法分析社会性昆虫种群的遗传变异（图1）。

图1 棉铃虫性信息素腺体脂肪酰基还原酶与其同源蛋白氨基酸序列的多重联配

系统发育分析是系统学研究的热点，通过分子系统发育研究，对传统分类有疑问的类群或形态分类不能解决的类群的系统发育进行分析和探讨（图2）

，也可对传统的分类系统进

行验证。分子系统发育研究采用的数据通常是DNA序列，RFLP数据也可用于低级阶元的系统发育分析。目前已有许多类群进行了分子系统发育分析，从种级至目级阶元都有研究。分子系统学研究结果与传统的分类系统及形态支序分析的结果有的相一致，但有的却很矛盾，如Camp-bell等Dohlen等根据18S rDNA片段序列构建的分子系统树证明:同翅目并非为一个单系群，而是一个平行进化的类群。Chalwatzis等、Whiting等根据18S和28S rDNA的序列分析，证明捻翅目与双翅目亲缘关系较近，而与鞘翅目关系却较远，而传统分类学一直认为捻翅目与鞘翅目关系较近，有的学者并把它作为鞘翅目中的一个总科。这样，分子数据与形态数据结果不统一，在现有研究水平下很难说哪种方法得出的结论更可靠，目前较为折中的办法是把分子性状和形态性状综合起来分析[8]。

图2不同昆虫性信息素腺体脂肪酰基还原酶蛋白氨基酸的系统发育树

分子进化的研究目的是构建基因或DNA分子的进化树，并探索生物大分子的进化机制和特征。这类研究卞要集中在亲缘关系比较明确的类群或高级阶元类群之间进行，研究对象以rDNA及mt DNA为主要研究对象。

2.1 rDNA在昆虫进化方面的应用

r DNA是编码核糖体RNA的基因，是一类中度重复的DNA序列，以串联多拷贝形存在于染色体DNA中，每个重复单位由非转录间隔区(norr transcribed spacer, NTS)、转录间隔区( internal transcribed spacer, ITS)。3种RNA(18S ,5.8S ,28S rRNA)基因编码区组成rDNA 3个区域的DNA进化速率各有不同，编码区总的来说，进化速率很慢，非常保守，适合于构建生命系统树的基部分支，但编码区内，又可分为高度保守区、保守区、可变区和高变区，这些不同的区域，适合于不同阶元类群的系统发育研究;转录间隔区为中度保守，适合于推断5-10年左右的进化事件;非转录间隔区则进化速度较快，适合于种间关系的研究。由于rDNA是生物界普遍存在的遗传结构，具有多拷贝性及上述种种优点，因而在个体及群体内有较好的均一性，少量样品能有效代表其来源群体的rDNA的变异情况[11]。因此，rDNA

已

成为生物系统进化研究中一个非常有用的分子标记。

自Hillis最先将rDNA用于系统发育分析之后，rDNA在不少昆虫类群的系统进化和分类研究中已得到广泛的应用。其中，编码18S和28S rRNA的基因片段用于系统发育研究较多，常用于科级以上水平的系统发育分析,高可变区序列也可用于属级或种级水平的系统发育关系研究。编码5. 8S rRNA的基因片段由于太短，一般很少单独使用。Wesson等首先开始蚊子的ITS片段比较研究，其后Campbell等将ITS片段用于膜翅b金小蜂科复合种的系统发育分析, Porter等及Paskewitz等分别将ITS片段用于双翅目按蚊科复合种的系统发育分析中, Kuperus等用ITS进行蝗科蚌蜕亚科的系统发育关系分析。

2.2 mtDNA在昆虫进化方面的应用

线粒体DNA( mitochondrial DNA mtDNA)为双链闭环分子，昆虫的线粒体DNA大小为15. 4-16. 3kb左右，其中含有编码2个核糖体RNA(12S rRNA人16S rRNA) ,22个tRNA ,1个细胞色素b，3个细胞色素氧化,6个NADH降解和2个ATP酶的基因[9]。由于线粒体DNA在分子进化中有许多独特的优越性:mt DNA的提取类似于质粒，相对于核基因的分离较为容易，基因组小，具高拷贝数目;基因组中不含间隔区和内含子，重复序列，在遗传过程中不发生基因重组、倒位、易位等突变;遗传过程中遵守严格的母系遗传方式，从而避免了双亲遗传方式引起的随机性;而目，虽然线粒体基因组的基因排列顺序高度保守，结构稳定，但mtDNA序列的取代速率却比核DNA高5-10倍，因此，由于以上结构和进化上的特点，mtDNA已成为研究进化的贡要材料[9]。最先用mt DNA的基因对昆虫纲10个进行了系统发育分析，其后不少学者采用mtDNA对昆虫不同阶元类群进行了系统发育分析，研究范围从种内种群之间至高级阶元之间的系统发育分析均有。通常用于系统发育分析的基因是16S rRNA ，其它基因也有应用，尤其是控制区(A- T丰富区)已开始受到重视。

2.3DNAfp(DNA指纹图谱)

1985年Jiffreys等将人肌红蛋白位点所获得的33bp核心序列作为探针研究个体，产生的DNA图谱因个体而异，就像人的指纹。这种具有个体差异和种属差异的DNA图谱称DNA指纹图谱。这种方法所检测的对象是DNA序列中串联重复的序列单位。动物个体的DNA指纹图谱中的每一个带除了偶然发现的突变外[12]，都可以从其父母双方的DNA指纹中找到，因而DNAfp特别适用双亲判断、个体识别、群体及种间关系的研究。

由于缺乏完整的理论依据来预测迁移率和序列对应的构想关系，DNAfp技术目前仍属经

验总结阶段，在植物应用中应用已经较多，相对而言，在昆虫学方面研究不多，但也有成功的例子：张爱兵等对中国松毛属8个种和亚种通过建立DNAfp对他们的亲缘关系进行了有力论证。

2.4 其他基因在昆虫进化方面的应用

利用rDNA或mtDNA基因进行系统学研究，拥有技术条件优势，并有适用于分类学大范围使用的PCB保守引物可利用，还有前人研究的大量数据也可利用，因此，大多数分子系统发育研究都采用rDNA或mtDNA的基因。但两者也有不足:mtDNA由于碱基组成的偏爱及沉默位点(silent sites)的多替代，所以mtDNA较少用于较高级阶元的系统发育分析;而rDNA基因则排序较为困难。因此，有的学者试图子找能更好地用于昆虫分子系统学研究的新基因c编码核蛋白的基因(Nuclear protein coding genes)具有易于排定、能明确确定迅速进化位点，而目在选择适当进化速率的适合某一系统学问题的基因上具有灵活性，因此目前已经有一些编码核蛋白的基因被应用于昆虫的系统发育分析中[10]。Soto-Adames等用葡萄糖，6-磷酸脱氢酶基因(glucose 6-phosphate dehydrogenase gene, G6pdh)研究12种昆虫，结果表明Gbpdh基因用于属或目级水平的系统发育研究是很有用的，但不能用于近缘种的系统发育分析。而Begum却用Gbpdh研究果蝇的地理种群分化。Russo等用乙醇脱氢酶基因(alcohol dehydrogenase gene, Adh)研究果蝇及其相关属的系统发育分析。 Cho等Mitchell等用延长因子基因分析鳞翅目夜蛾类的系统发育。Danforth等研究蜜蜂了EF- la,认为它是一个用于昆虫系统发育分析的很好的基因。Friedlander等将磷酸烯醇内酮酸梭激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase)基因用于鳞翅b高级阶元的系统发育分析。综上所述，编码核蛋白的基因用于昆虫高级阶元的系统发育是很有效的[10]。

三、展望

昆虫分类学是一门综合性学科，是随着人类认识和利用昆虫的不断深入而发展起来的。现代昆虫系统学不仅仅是把生物类群的外部形态作为建立分类系统的资料来源"而是尽可能地利用解剖学、细胞学、遗传学、生态学、生物地理学、生物化学、分子生物学等学科的知识和手段，因此，昆虫系统学已经发展成为一门多学科相互交叉渗透的综合性学科。

分子生物学技术具有简便快捷的特点，而且其灵敏程度很高，能够对整个基因组作地毯式的多态分析。同时，技术还可以和其它相技术结合，这样就在很大程度上扩展了分子生物学技术在昆虫分类学研究中的应用范围并使之得到了极大的发展。分子生物学技术的成功应

用，极大地提高了昆虫分类学研究的水平，在揭示昆虫的系统发育关系、保护昆虫的生物多样性、合理利用昆虫资源、害虫的综合治理等方面都起到了重要作用。综上所述，分子生物学技术在昆虫分类学研究中的应用前景巨大，并将随着技术手段的不断完善变得更加广阔。 参考文献

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致谢

在昆虫分类学实习过程中，我组和雷老师等一路同行，在这一路上深切感受到雷老师治学严谨，学识渊博，思想深邃，观察事物明察秋毫，身体力行，是德高为师，学髙为范的真实写照。

在实习期间雷老师多次亲切关怀和询问捕虫情况，并给出具有指导性的建议和帮助。雷老师全身心投入工作的忘我精神，对我产生了很深的影响，是我毕生效仿的榜样。在此课程论文完成之际谨向雷老师表示诚挚的谢意和崇高的敬意！

在此实习过程中，身边同学也给予了极大的帮助，尤其是课代表为了这次实习做出了很大的努力，在此一并感谢！最后再一次感谢雷老师，对本学期教学和课程实习的完成付出的巨大心血，并对我将来的学习生活给予了极大关怀和指导。对此，我深表感谢，最后祝愿雷老师身体健康、工作顺利、阖家欢乐。

袁向东

2014年4月29日

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/87oi.html