年产6000吨木聚糖酶发酵车间的设计

年产6000吨木聚糖酶发酵车间的设计

作 者 姓 名 李斌 专 业 生物技术及应用 指导教师姓名 张大伟

目 录

摘 要 …………………………………………………………………1 ABSTRACT ……………………………………………………………2 第一章 绪论 ……………………………………………………3

1.1木聚糖酶简介 ………………………………………………………3 1.1.1木聚糖酶的理化性质 ……………………………………………3 1.1.2木聚糖酶的生产简史 ……………………………………………4 1.1.3木聚糖酶用途 ……………………………………………………4 1.1.4木聚糖酶产业发展现状 …………………………………………5 1.2巴斯德毕赤酵母简介 ………………………………………………6 1.2.1巴斯德毕赤酵母表达系统 ………………………………………6 1.2.2巴斯德毕赤酵母的优缺点 ………………………………………6 1.2.3前景展望 …………………………………………………………7

第二章 木聚糖酶发酵机理……………………………………7

2.1重组巴斯德毕赤酵母发酵合成木聚糖酶的代谢途径 ………………7 2.1.1甘油代谢途径 ……………………………………………………7 2.1.2甲醇代谢途径……………………………………………………9 2.2巴斯德毕赤酵母发酵生产木聚糖酶过程中的主要影响因素 ………11 2.2.1碳源的影响………………………………………………………11 2.2.2氮源的影响………………………………………………………11 2.2.3基础盐和PTM1微量盐的影响…………………………………… 11 2.2.4添加其它物质,降低蛋白酶降解…………………………………12 2.2.5pH的影响…………………………………………………………12 2.2.6温度的影响………………………………………………………12 2.2.7溶氧浓度(DO )的影响………………………………………… 13 2.2.8诱导前菌体密度( CWPT I )与比生长速率(μPT I )的影响……13

第三章 木聚糖酶发酵的工艺流程 …………………………13

3.1高效分泌木聚糖酶的毕赤酵母工程菌株的获得……………………13

3.1.1材料 …………………………………………………………… 13 3.1.2黑曲霉木聚糖酶cDNA 的获得 ………………………………… 13 3.1.3表达载体VMAN－pPIC9K 的构建……………………………… 13 3.1.4重组菌株VMAN－pPIC9K－GS115 的获得和高酶活菌株的筛选…13 3.1.5重组毕赤酵母的扩大培养……………………………………… 13 3.2重组巴斯德毕赤酵母工程菌发酵生产木聚糖酶………………… 14 3.2.1原料 …………………………………………………………… 14 3.2.2重组菌株的液体发酵…………………………………………… 15 3.2.3发酵工序………………………………………………………… 15 3.3发酵液后处理获得木聚糖酶……………………………………… 16 3.3.1离心……………………………………………………………… 16 3.3.2干燥……………………………………………………………… 17 3.4工艺流程…………………………………………………………… 17 3.5产品的工艺要求 ……………………………………………………18 3.5.1产品的规格与使用方法 …………………………………………18 3.5.2产品的包装与储运 ………………………………………………18 3.5.3常用饲料原料中木聚糖量 ………………………………………18

第四章 工艺计算 ……………………………………………19

4.1物料衡算 ………………………………………………………19 4.1.1原料的物料衡算………………………………………………19 4.2热量衡算…………………………………………………………20 4.3冷却水水耗………………………………………………………20

第五章 设备的设计与选型…………………………………21

5.1输送设备的设计计算 ……………………………………………21 5.2发酵设备的设计及选型……………………………………………23 5.2.1发酵罐的设计计算………………………………………………23 5.2.2种子罐的设计……………………………………………………26 5.3发酵车间相关设备的型号一览表 ………………………………26

第六章 发酵车间的布置设计 ……………………………29

6.1概述………………………………………………………………29

6.2生产车间工艺布置的原则……………………………………………29 6.2.1车间布置设计的依据………………………………………………29 6.2.2生产车间工艺布置的原则…………………………………………30 6.3发酵车间的设计……………………………………………………31 6.4管路的设计…………………………………………………………32

第七章 总平面布置与建筑说明……………………………33

7.1设计依据和范围……………………………………………………33 7.1.1设计依据…………………………………………………………33 7.2厂址……………………………………………………………………33 7.2.1厂址地理位置………………………………………………………33 7.2.2厂区基本条件………………………………………………………33 7.3总厂平面设计…………………………………………………………33 7.3.1平面设计原则………………………………………………………34 7.3.2平面的总体布置的设计方案………………………………………34 7.3.3工厂出入口布置特征………………………………………………35 7.3.4厂区设计…………………………………………………………35 7.3.5坐标系统…………………………………………………………35 7.3.6厂区划分要求……………………………………………………35 7.4建筑物得布置位置…………………………………………………36 参考文献…………………………………………………………………37 致谢……………………………………………………………………38

摘 要

木聚糖酶(β-1,4-D-Xylanase, EC3.2.1.78)是一类能够水解β-1,4-糖苷键的半纤维素酶，已广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、采油等诸多领域。

本设计以一株高效表达木聚糖酶的重组毕赤酵母为发酵菌株,对年产6000吨木聚糖酶的发酵车间进行设计。发酵工艺采用连续补料培养工艺，选用2个0.8m3一级种子罐和2个8 m3二级种子罐，采用2个80m3发酵罐，发酵罐直径3100 mm。发酵罐罐体厚度设计是6.5mm，制作材料采用1Cr18Ni9Ti耐酸不锈钢。本设计根据确定的工艺流程进行了物料衡算，并绘制了全厂工艺流程图、全厂总平面布置图及三级发酵罐的装配图。

关键词：木聚糖酶 高密度发酵 补料培养 发酵罐

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ABSTRACT

xylanase (β-1 ,4-D-xylanase , EC3.2.1.78) are a class can hydrolyze β-1 ,4-glycosidic bond hemicellulase, its role in xylan substrate grapes , xylan, galactoxylan and galactoxylan such as grape xylan more widely distributed in nature, most are renewable resources. hemicellulose resources as the major products of deep processing, β-xylanase has been widely applied In food, medicine, feed, paper, oil and many other fields.

In this study, using RT-PCR, selection was highly expressed xylanase secreted Pichia pastoris strain MAN22, and the liquid fermentation. Temperature control during fermentation 30 ° C, by adjusting the stirring rate to the dissolved oxygen concentration was maintained at 30%, mainly in methanol as carbon source, nitrogen source, ammonia did, by adding ammonia flow control pH ≈ 5.5, make every 12 h Add a Methanol, post-fermentation to add 5% (NH4) 2 SO4, NH4 + levels were maintained to 150mmol / L or more (2 g / L or so). Seeds with two 0.6m3 and two 6 m3 tank and two second seed containers, with two 60m3 fermenter, the fermentation tank diameter of 3100m. Fermentation Tanks thickness design is 6.5mm, made of stainless steel materials used 1Cr18Ni9Ti acid. Selected according to the design of β-xylanase production process and the design of computing devices, according to the requirements of the mission statement drawn flow chart of the whole plant, whole plant general layout plans and β-xylanase fermentation tank assembly Fig.

Key words: xylanase ; High density fermentation; seed pot; fermentation pot

第一章 绪论

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1.1木聚糖酶简介 1.1.1木聚糖酶的理化性质

木聚糖酶（Xylanase）[EC 3.2.1.8]是指将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，是木聚糖降解酶系中最关键的酶。主要包括外切?-1，4-木聚糖酶，内切?-1，4-木聚糖酶和?-木糖苷酶。其中外切?-1，4-木聚糖酶[EC3.2.1.92]是以单个木糖为切割单位，它作用于木聚糖的非还原性末端，使反应体系的还原性不断增加。内切?-1，4-木聚糖酶[EC3.2.1.8]是从木聚糖主链的内部切割?-1，4糖苷键，使木聚糖溶液的黏度迅速降低，鉴于其特殊功能，内切?-1，4-木聚糖酶多用于食品行业。?-木糖苷酶[EC3.2.1.37]主要作用是切割低聚木糖和木二糖，有助于木聚糖彻底降解为木糖。该酶通过水解低聚木糖的末端来催化释放木糖残基。

不同来源的木聚糖酶在组成和催化性质上各不相同，但它们的理化性质有相似的地方。大多数微生物木聚糖酶为单亚基蛋白，分子量8～145kDa，等电点pI值3～10，最适作用温度为40～75℃。根据对几十种内切?-1，4-木聚糖酶的分子量和等电点进行统计分析后发现，70%的酸性?-1，4-木聚糖酶分子量在30kDa以上，而碱性?-1，4-木聚糖酶分子量则多在30kDa以下。木聚糖酶 中?-木糖苷酶有单聚体、二聚体或四聚体等组成形式，分子量为26～360kDa，pI值为3.3～7.3。其它一些特异性酶，如α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶多以单体形式存在，也有二聚体、四聚体、六聚体和八聚体等形式，分子量为53～495kDa，pI值为2.5～9.3 ；α-葡萄糖醛酸苷酶的分子量一般都大于100kDa，而pI值都小于4.0。

粘度：木聚糖酶在水中溶解后变成有粘性的溶液，使消化道中食糜的粘稠度增加。木聚糖在低溶度时，因与水分子直接互作而增加了食糜的粘度。随着木聚糖溶度的增加，分子本身相互作用，从而缠绕成网状结构，这种作用过程的相互作用极大时，可能会变成凝胶。

表面活性：木聚糖的表面带有负电荷，在溶液中趋于与其他物质表面结合。在饲料消化时，多糖可以与肠道中的饲料颗粒表面、脂类微团表面及多糖-蛋白质复合物表面相结合。

持水性：由于木聚糖具有高的持水性，这在木聚糖溶度较高时变得尤其显著，因为此时可以形成凝胶。这些效应能根本上改变消化物的物理特性，从而改变肠道的生理机能，即增强对肠蠕动的抵抗力。

离子、小分子与木聚糖的结合：除了阳离子与一些木聚糖中带负电基团结合外，木聚糖的立体结构也使它与离子发生螯合作用事实上，阳离子能在木聚糖分子间形成离子桥，这将大大影响其粘度和凝胶的形成特性。小分子通过疏水键的相互作用，也可能与多糖发生微弱的结合。

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1.1.2木聚糖生产简史

木聚糖酶的研究始于20世纪60年代。目前国际上研究工作主要集中在对微生物木聚糖酶的诱导与调节机理研究，以及酶的提纯、鉴定方法，木聚糖酶基因分子的克隆和表达 等。而我国对木聚糖酶的研究主要集中在产木聚糖酶优良菌株的筛选和驯化、木聚糖酶的纯化和理化性质的研究等方面。

当前，木聚糖酶主要通过真菌、细菌等微生物发酵生产获得。根据发酵工艺的不同，可分为固体发酵和液体发酵两种。这两种发酵方式各有其优缺点：固体发酵所用培养基相对便宜，主要以农副产品为主。且操作设备简单，整个生产过程中无废物产生，不存在环境污染问题，产率较高。易于在中、小企业推广应用，目前国内木聚糖酶生产主要采用固体发酵方式。但固体发酵同时也存在不易控制，酶系复杂，纤维素等酶含量高，难以精酶化等缺点；相比较而言，液体发酵由于是在液态环境中进行，菌体、底物、产物（包括热）均易于扩散，使得发酵能够在均质或拟均质条件下进行。该方法便于在生产过程中进行实时检测、控制，易于扩大生产规模。同时，由于液体输送方便，便于机械化操作，产品也易于提取精制。液态发酵工艺的缺点主要是对设备有一定要求及生产成本较高，技术要求也较为严格。但随着生物技术的发展和木聚糖酶广泛应用，采用液体发酵生产木聚糖酶将成为今后发展方向。

1.1.3木聚糖酶的用途

从上世纪60年代开始，随着木聚糖酶研究的不断深入，其应用领域也不断扩大，在造纸、食品、饲料、纺织、医药、环境和能源等行业被广泛应用，前景十分看好。

在造纸行业中的应用：木聚糖酶在造纸工业中的重要作用体现在其取代了有毒化学物质，通过酶法预处理可以回收造纸行业中有用的副产物等方面。造纸工业中通过木聚糖酶的使用，缩短了纸浆的处理时间，增加了纤维的分离度，使氯气等化学漂白剂更好地渗透到纸浆里，从而大大减少了化学漂白剂的用量并且使漂白效果得以提高。木聚糖酶在造纸工业中还应用于废纸脱墨这一重要环节，不仅使脱墨工艺变得容易，而且减少了化学药品的用量。

木聚糖酶应用于纸浆生物漂白工艺过程，减少了氯气用量，减少致癌物质的排放，减轻环境污染，显著改善了纸浆的滤过性、脆性，增加了纤维的分离度、纸浆漂白度，降低了生产能耗，降低了生产成本，其诸多优点不断在造纸工业中显现出来。

在食品行业中的应用：木聚糖酶在食品行业中的应用主要体现在将天然半纤维素分解后得到低聚木糖这一环节。在面包的生产中，1/3的水分是面团中的戊聚糖吸收的，戊聚糖的高吸水性对面团和面包的质量有明显的影响。在新鲜蔬菜、水果加工成婴儿食品、膏状物、干燥蔬菜粉末和速溶食品时，营养物质通常被一层

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坚硬的半纤维素、果胶等物质组成的细胞壁所包围，如果对其用含有纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶的酶制剂来处理，就可在比较温和条件下使组织柔化，使细胞破壁，将有效物质充分提取出来。与此同时也降低了提取液的粘度，使生产过程中的浓缩、干燥效率成倍提高，相应降低生产成本。

其他应用：据报道，木聚糖酶可与其它酶共同参与使植物降解为戊糖、己糖，再用其它菌株发酵生产乙醇。也有报道发现能把植物纤维直接转化为乙醇的一些菌，如Thermbacteroides acetoethylicus, Clotridium thermosaccharolyticum。另据报道，木聚糖酶在去污洗涤，医药制造，以及在果实成熟、种子萌发、真菌的寄生及植物的抗性等诸多生理过程中都有着重要的应用。

1.1.4木聚糖酶产业发展现状

我国对木聚糖酶的研究主要集中在产木聚糖酶优良菌株的筛选和驯化、木聚糖酶的纯化和理化性质的研究等方面。

当前，木聚糖酶主要通过真菌、细菌等微生物发酵生产获得。根据发酵工艺的不同，可分为固体发酵和液体发酵两种。这两种发酵方式各有其优缺点：固体发酵所用培养基相对便宜，主要以农副产品为主。且操作设备简单，整个生产过程中无废物产生，不存在环境污染问题，产率较高。易于在中、小企业推广应用，目前国内木聚糖酶生产主要采用固体发酵方式。但固体发酵同时也存在不易控制，酶系复杂，纤维素等酶含量高，难以精酶化等缺点；相比较而言，液体发酵由于是在液态环境中进行，菌体、底物、产物（包括热）均易于扩散，使得发酵能够在均质或拟均质条件下进行。该方法便于在生产过程中进行实时检测、控制，易于扩大生产规模。同时，由于液体输送方便，便于机械化操作，产品也易于提取精制。液态发酵工艺的缺点主要是对设备有一定要求及生产成本较高，技术要求也较为严格。但随着生物技术的发展和木聚糖酶广泛应用，采用液体发酵生产木聚糖酶将成为今后发展方向。

与国外相比，国内在木聚糖酶方面的研究起步较晚，主要集中于海枣曲霉、黑曲霉、木霉菌、青霉菌等真核微生物和短小芽孢杆菌、串珠链孢菌、链霉菌、环状芽孢杆菌、碱性假单胞菌等原核微生物木聚糖酶的研究。目前为止，国内学者报道对木聚糖酶的研究基本上还仅限于对产木聚糖酶天然优良菌株的筛选、酶的纯化和一些酶学性质研究方面，只克隆了少数木聚糖酶基因[27]。由于木聚糖酶具有重要的应用价值以及在生物工程技术的重要地位，现在己经有越来越多的科研人员致力于木聚糖酶的开发研究，如高产菌株的选育、工程菌的构建、优化培养条件、无纤维素酶污染的木聚糖酶等。

1.2巴斯德毕赤酵母简介

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1.2.1巴斯德毕赤酵母表达系统

巴斯德毕赤酵母属子囊菌类,为单倍体,由于在其细胞的过氧化物酶体中含有

甲醇代谢途径所必需的酶,如醇氧化酶(alcohol oxidase ,AOX) 、过氧化氢酶、二羟丙酮合成酶等 ,所以可利用甲醇作为唯一碳源和能源。由于巴斯德毕赤酵母能够在简单培养基上高密度发酵生长,所以它最初是作为一种工业的甲醇营养型酵母,主要用来生产单细胞蛋白质。

1.2.2巴斯德毕赤酵母的优缺点

经过二十多年的研究和应用发现,巴斯德毕赤酵母具有以下主要优点:

(1)具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一；

(2)表达效率高,其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90%以上,有利于目的蛋白的分离纯化；

(3)在简单合成培养基中可实现高密度培养；

(4)表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合； (5)由于该酵母可以以甲醇为唯一碳源和能源,而绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源,可以减少污染。 它也具有以下缺点: (1)发酵周期长

(2)甲醇易燃易爆有毒，存在一定的危险性 (3)筛选高产菌株需用的药物价格比较昂贵 (4)培养基和培养条件不成熟

1.2.3前景展望

巴斯德毕赤酵母是单细胞低等真核生物, 它既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性, 同时又具有适于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统, 还能分泌外源蛋白到培养液中, 利于纯化。近几十年来, 巴斯德毕赤酵母表达系统发展成为一个较为理想的蛋白表达系统。它具有外源目的蛋白表达量高、基因遗传稳定和分泌效率高等优点, 并具有甲醇精确调控的强启动子—醇氧化酶启动子( PAOX )及日臻成熟的高密度发酵工艺, 是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一, 越来越受到人们的重视, 被国内外广泛应用于大量生产外源真核或其他结构较为复杂的原核蛋白。目前, 已经有500多种外源蛋白在该系统中进行了高效表达。

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第二章 木聚糖酶发酵机理

2.1重组巴斯德毕赤酵母发酵合成木聚糖酶的代谢途径

相对而言，对毕氏酵母的报道比较少且多为非结构模型。由于非结构模型多

采用经验的 Monod 模型描述菌体发酵动力学，在表达菌体干重浓度和蛋白方面精度较差。考虑到面包酵母和毕氏酵母在代谢行为和菌体形态多方面有很大的相似性，因此面包酵母的很多研究成果可以为毕氏酵母所借鉴。本章以 Bellgardt（1983）建立的面包酵母动力学模型为基础，借鉴文献所报道的甘油和甲醇的代谢途径，对毕氏酵母发酵动力学建模。

甘油的主要代谢途径包括磷酸化、糖酵解、三羧酸循环和呼吸链。在甲醇期，甲醇首先被氧化为甲醛，甲醛随后进入分解代谢与合成代谢两个途径。在分解代谢中，甲醛被氧化为甲酸盐和二氧化碳，并以电子NADH的形式释放能量。合成代谢途径与甘油期类似，也包括磷酸化、糖酵解和三羧酸循环等过程。

2.1.1甘油代谢途径

细胞外的甘油进入细胞内部，首先被甘油激酶磷酸化为三磷酸甘油 G3P（Glycerol3-phosphate）。G3P 在三磷酸甘油脱氢酶的作用下被氧化为磷酸二羟丙酮。经过糖酵解过程，磷酸二羟丙酮被分解成丙酮酸（PYR）。丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的作用下被氧化为乙酰辅酶 A（Acetyl-CoA）。通常在没有任何反应限制下，乙酰辅酶 A 直接进入三羧酸循环（TCAcycle），在此过程中会有大量细胞物质合成（如氨基酸、核酸等），同时伴随电子载体（NADH）和能量（ATP）的转换。在代谢过程中，如果溶氧或者丙酮酸脱羧反应速率受到限制，代谢将会进入乙醇发酵途径。此时，丙酮酸在丙酮酸脱羧酶的作用下生成乙醛（Acetaldehyde），乙醛在醇脱氢酶的作用下生成乙醇。而当上述限制解除后，乙醇又可作为基质被利用，这时，乙醇首先被氧化为乙醛，乙醛进而被氧化为乙酸盐，最后转化为乙酰辅酶 A 进入 TCA 循环。伴随着甘油的代谢途径，也有呼吸链的作用。呼吸链的主要作用是为细胞的生长和维持提供能量。关于甘油期内细胞的合成代谢，在此假定细胞物质小部分由 G3P 转化生成，其余大部分在 TCA 循环中生成。乙醇的生成和消耗过程见图 2.1 中的点框，三羧酸循环和呼吸链分别见图 2.1 中的虚线框。

图 2.1 给出了简化的甘油在毕氏酵母细胞内部代谢途径。

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图2.1毕赤酵母甘油代谢途径

其中甘油转化为三磷酸甘油：

（2-1）

G3P 的糖酵解方程（2-2）以及G3P 合成细胞物质的方程（2-3）如下：

（2-2）

（2-3）

视发酵罐内溶氧水平或者丙酮酸脱羧反应速率是否受到限制，丙酮酸可能直接进入三羧酸循环或者进入乙醇发酵支链。在我们的实验中，溶氧浓度一直保持在 30％以上，所以溶氧不受限；同时实时测量表明发酵罐内乙醇浓度在 0～0.5 g l-1较低的范围内，为此出于模型的简化，本文忽略乙醇的发酵途径，即去掉图2.1中点框部分，认为丙酮酸直接进入三羧酸循环：

（2-4） （2-5）

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(2-6)

其中（2-5）是 TCA 循环的简化方程，（2-6）描述了三羧酸循环过程中细胞物质的生成。

呼吸链中提供大量的能量转换，见下式：

（2-7）

甘油代谢过程中产生的 ATP 一部分用于细胞生长过程的能量消耗，另一部分用于细胞自身生命的维持，甘油代谢过程中，细胞物质主要在 G3P 糖酵解过程和三羧酸循环中合成。

2.1.2甲醇代谢途径

图 2.2 是简化的甲醇期甲醇的代谢途径，甲醇首先被醇氧化酶（AOX）氧化成甲醛和过氧化氢。甲醛随后进入两条代谢途径，小部分进入分解代谢，大部分进入合成代谢。在分解代谢中，甲醛首先被甲醛脱氢酶（FLD1p）氧化为甲酸盐，并进一步被甲酸盐脱氢酶（FDH）氧化为二氧化碳，同时以电子 NADH 的形式释放能量，同时也避免了细胞内部甲醇积累过多而产生毒害作用（Sibirny et al., 1990）。在合成代谢中，甲醛在二羟基丙酮合成酶的作用下与 5 磷木棉糖结合生成三磷酸甘油醛（GAP），GAP 随后进入糖酵解和 TCA 循环。本文假定甲醇期的细胞物质主要从 GAP 和 TCA 循环中转化合成。消耗的甲醇进入分解代谢的比例为 φ。对于 φ 的大小，文献报道结论不一。Veenhuis et al.（1983）认为，甲醇代谢过程所需的能量主要来自分解代谢，因此进入分解代谢途径的甲醛较多；而 Sibirny et al.（1990）认为，分解代谢的作用主要是保护细胞不因大量的甲醇残留而中毒的，代谢过程中需要的能量主要来自合成代谢，故进入合成代谢途径的甲醛较多。由于碳源主要是在合成代谢途径中消耗的，大量的能量应来自于合成代谢。在本文的实验中，甲醇期比生长速率的控制在较低水平（0.003-0.0085 h-1），甲醇的残留浓度几乎为零，因此不需要进行过多的分解代谢以避免较高浓度的甲醇残留，故此本文φ 值设定在较低的0.25。不可否认，φ 的取值未必精确，还需要进一步的实验结果来修正。幸运地是，φ 引起的误差可以由模型中的其它参数来弥补。

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图2.2 毕赤酵母甲醇代谢途径

在此可以列出甲醇期的化学计量平衡方程： 甲醇首先被氧化为甲醛：

（2-8）

甲醛在分解代谢中被氧化为甲酸欲，最终转变为二氧化碳：

(2-9)

甲醛在合成代谢过程中被磷酸化。击要指出的是，生成1摩尔的GAP击要消耗3摩尔的甲醛(Lin Cereghino and Cregg, 2000: Lueers et al., 1998)。

（2-10）

GAP酵解生成内酮酸以及合成细胞物质的方程分别见下式：

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（2-11）

（2-12）

内酮酸被氧化为乙酞辅酶A

甲醇期乙酞辅酶A以后的代谢途径以及呼吸链中的代谢途径与甘油期相同，前面有所介绍，这不过多重复，主要反应有：

（2-4） （2-5）

(2-6)

同前所述。

2.2巴斯德毕赤酵母发酵生产木聚糖酶过程中的主要影响因素 2.2.1碳源的影响

甘油是菌体生长阶段普遍采用的碳源,通过补料加入培养基,其浓度过低或

过高会限制或抑制菌体生长,因此,需要优化初始甘油浓度,选择有效的补料方式。葡萄糖也可作为碳源,虽效果不如甘油,但性价比却优于甘油, 以葡萄糖代替甘油将有利于工业化生产。

甲醇是诱导表达阶段的碳源,其浓度(CMeOH )和补料方式是关键。CMeOH过低,会限制菌体生长和诱导强度; CMeOH过高,则对菌体产生毒性。甲醇最佳浓度一般在0. 5% ～3% ( v/v) ,但有些蛋白高于3%],因此,不同蛋白的最佳浓度不同,需通过实验并结合补料策略确定。CMeOH通过补料调节并保持恒定,其检测控制方法有溶氧反馈控制、甲醇离线控制和在线控制,而甲醇在线控制最优。

2.2.2氮源的影响

氨水常作为氮源,并用于调节pH,其释放的NH4浓度对菌体生长、蛋白表达和降解有重要影响。浓度过低,限制菌体生长,并增加蛋白的降解;浓度过高,虽可减少蛋白降解,却会抑制菌体生长和蛋白表达。因此, NH4+浓度需要优化,并采用恒浓度或变浓度法调控。谢静莉等在发酵后期添加(NH4 ) 2 SO4 ,使NH4+浓度维持在150mmol/L以上,蛋白表达量提高58. 8%。采用变浓度法调控NH4+浓度后,既促进菌体生长,提高表达量,又降低蛋白酶降解。

2.2.3基础盐和PTM1微量盐的影响

在表达分泌蛋白时,需降低基础盐浓度。基础盐。浓度过高,会导致菌体死亡,

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并增加蛋白酶释放,增加蛋白降解。Surribas等以电导率反映基础盐浓度,将初始电导率降为30% ,并在诱导过程维持在20%后,菌体死亡率下降。Zhao等将基础盐浓度降为1 /4时,诱导前后菌体死亡率分别降低83. 3%和48. 6% ～59. 2% ,菌体密度增加25% , HAS2IFN2α2b表达量提高92. 0% ,并保持恒定。PTM1 微量盐溶液成分过于复杂,不能高温灭菌,易形成沉淀且价格较高,不利于大规模发酵,可用低浓度的酵母抽提物来替代PTM1 微量盐,简化工艺,也可用麦芽汁来替代,性价比可大幅提高,即简化工艺又降低成本,有利于工业化生产。

2.2.4添加其它物质,降低蛋白酶降解

在培养基中添加VitC、VitE可以减少菌体死亡,减少蛋白酶的分泌;添加蛋白胨或酪蛋白水解物等底物,竞争性抑制蛋白酶活性;添加蛋白酶抑制剂或EDTA,抑制蛋白酶活性, 它们都能降低蛋白酶降解。Xiao等[添加VitC并维持在4～10mmol /L后,菌体死亡率降低65. 4% ,水蛭素降解程度降低30. 2% ,完整蛋白的表达量提高56. 8%。Zhao等在诱导前添加2%大豆胨后, HAS2IFN2α2b只有极轻微的降解。Ayed等添加酪蛋白水解物并维持在0. 1%或EDTA 并维持在10mmol /L后,均能阻止h IFNα2b 的降解,前者使产物保持恒定,后者使表达量提高65%。

2.2.5pH的影响

pH对菌体生长和诱导表达都会产生影响,尤其是诱导时的pH,不仅会影响蛋白表达量和活性,而且会通过影响蛋白酶活性,来改变蛋白的降解程度。如当pH由3升至7时, rHSA的降解逐渐减少。因此,必须选择合适的pH,一般在3. 0～7. 0,而且在不同阶段,应选择不同pH,采用变pH发酵。pH一般是通过补加氨水来调节,若NH4+浓度过高,则改为补加碱来调节。

2.2.6温度的影响

温度升高,有利于生长代谢和蛋白表达,但温度过高反而会使菌体过早

衰老,发酵周期缩短,降低蛋白表达量和活性。因此,必须选择合适的温度,而且在不同阶段,应选择不同的温度,采用变温发酵。菌体生长最适温度为30℃,诱导表达的最适温度应降低,常为20-28℃,尤其是分泌蛋白,低温更有利于表达。

低温可以降低折叠压力,有利于新生肽链的正确折叠;降低菌体死亡率,减少蛋白酶分泌,降低蛋白酶活性;提高AOX酶活性和转录水平,还可以提高蛋白稳定性。

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2.2.7溶氧浓度(DO )的影响

高密度发酵需要消耗大量的氧气,尤其是在甲醇诱导阶段,供氧往往成为限制性因子。若供氧不足,不仅会抑制菌体呼吸作用,限制菌体生长繁殖,而且会积累甲醇及其代谢产物甲醛和过氧化氢,对菌体产生毒害,降低蛋白表达量。因此,必须保证足够的供氧,一般DO≥20% ～30% , DO也不能太高,超过60% ,细胞就会发生氧中毒。

2.2.8诱导前菌体密度( CWPT I )与比生长速率(μPT I )的影响

CWPTI和μPTI分别反映菌体生物量和生理状态,提高CWPTI和μPTI均能有效提高蛋白表达量。提高CWPTI可以提高诱导阶段的生物量,并使更多的甲醇转向蛋白合成，,从而提高表达量;提高μPTI可以增强菌体翻译效率,转入诱导时,可迅速合成酶系代谢甲醇,快速表达出蛋白, 提高比生产速率和表达量。

第三章 木聚糖酶发酵的工艺流程

3.1高效分泌木聚糖酶的毕赤酵母工程菌株的获得

运用RT－PCR 从黑曲霉AN070902 中克隆木聚糖酶cDNA 片段，与载体pPIC9K 相连，构建重组载体VMAN－pPIC9K，电转化毕赤酵母GS115，筛选产酶最高菌株进行液体发酵。在该项设计中，高效产酶菌株由工厂准备并储存。

3.1.1材料

3.1.2黑曲霉木聚糖酶cDNA 的获得 3.1.3表达载体VMAN－pPIC9K 的构建

3.1.4重组菌株VMAN－pPIC9K－GS115 的获得和高酶活菌株的筛选3.1.5重组毕赤酵母的扩大培养

将可以分泌木聚糖酶的重组毕赤酵母加入到大型种子罐中进行扩大

培养，种子罐操作。

(1)温度控制：30±1℃。

(2)(NH4)2S04：添加量：5Kg/m3。 (3)罐压：0.05MPa。

(4)通风控制：O～6h，36～40m3/h；7～11h，渐增至72m3/h；12～15h，渐增至144m3/h；16～19h，180m3/h；20～24h，280～288m3/h：24h后，360m3/h；

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加大风量，可使菌体生长速率加快，但菌体呼吸强度和杂菌生成量可能增加。

(5)培养时间：36h。本设计一级种子罐培养时间为20h，二级种子罐培养时间为16小时。

(6)搅拌速率：220r/min

3.2重组巴斯德毕赤酵母工程菌发酵生产木聚糖酶 3.2.1原料

（1）原料的选择

1、选来源丰富、质量好、且便于储存运输的原料； 2、因地制宜，就近取材，尽量降低成本； 3、符合生产工艺要求； （2）菌种:

根据实际需要，本次设计用到的重组巴斯德毕赤酵母基因工程菌由本实验室构建（如上所述）并保藏。

（3）培养基及所需溶液:

YPDs/Zeoein:1og/L酵母膏、Zog/L蛋白陈、209/L葡萄糖、log/L琼脂、100mg/LZeoein。

YPD:10岁L酵母膏、20留L蛋白陈，20留L葡萄糖、10留L琼脂。

BMGY:1og/L酵母膏、Zog/L蛋白陈、20g/L葡萄糖、Zog/L琼脂、 0.05mol几磷酸钾缓冲液，pH=6.0， 13.4g/LYNB，4xl04g/L生物素、20g/L甘油、o.05moFL

L一eys。

基础盐溶液(FM21):CaS0422H20 1.5; KOH 6.5; MgS0427Hz0 19.5; K2S04 23.8; H3P04 85% 3.5%(v/v)。

微量元素溶液(PTM1):ZnC12 2; FeS0427H20 6.5; H3B03 0.002;MnSO42H20 0.3;H2S04 96% 0.2% (v/v);CuS0425H2O 0.6; KI 0.01;biotin 80 ug l-1。

种子培养基:甘油10; peptone 20; yeast extract 10; KH2P04 1.2; Na2HP04 2.29;(NH4)S04 1;MgS0427H20 1;FeS0427Hz0 0.25。

甘油期间歇发酵培养基:甘油40; biotin 80 ug l-1; H3P04 85% 2% (v/v)和-定量的FM21和PTM 1。

甘油期流加发酵培养基:50% (V/V)的甘油配以一定量的FM21和TM l 。 甲醇期流加发酵培养基:100%的甲醇配以一定量的FM21和PTM l 。

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蛋白陈、酵母膏购自OXOID公司;其它试剂均为国产或进口分析纯试剂。

3.2.2重组菌株的液体发酵

菌体在种子罐中培养后，然后以10%的接种量进行补料-分批发酵，发酵罐的总体积为60m3，工作体积为48m3。发酵过程采用了Invitrogen Corporation的发酵规范（Carlsbad, CA, USA, 2002），整个发酵过程分为甘油期和甲醇期两个阶段。甘油期以甘油为唯一碳源，目的是细胞高密度培养，发酵温度为30℃；甲醇期以甲醇为唯一碳源，以生成目标蛋白为目的。甘油期又分为甘油间歇期(16-20 h)和甘油流加期(14-18 h)，甲醇期分为甲醇诱导期(5-10 h)和产物生成期(140-160 h)。发酵全程通过调节搅拌速率使溶氧浓度维持在30%左右，溶氧电极为INPRO6100/120/T/N（Mettler-Toledo, Switzerland）；通过流加氨水控制pH≈5.5，pH电极为405-DPAS-SC-K8S/120（Mettler-Toledo, Switzerland）。甘油、甲醇和氨水的流加均使用校正好的蠕动泵（Watson 101）进行流加。

3.2.3发酵工序

1、无菌空气的制备：利用溶解于溶液中的氧，其来源则是通过压缩机提供的压缩空气。自然界的空气是带尘和细菌的空气，且通过压缩机压缩和管道输送，增加了水、油污、金属屑等杂物，因此进入发酵罐的空气，必须是通过适当的方法处理后的干净、无菌空气。

2、灭菌工序 技术工艺条件：

(1)种子罐:空罐 120℃，30min； (2)发酵罐：空罐 120℃，30min；

(3)接种管道、料管：2.5～3.0kgf/cm2,120℃,20min。 (4)总空气管道：120～150℃，2.5～3.0kgf/cm2,1h,每月一次。

(5)无菌室：每周甲醛消毒一次，每天药物消毒一次，每次使用前用紫外灯消毒20min。

(6)注意随时用漂白粉或其他药物维持环境不污染。 3、发酵罐操作： (1)温度：30±1℃。

(2)接种量：1:10(每10m3发酵罐对应1m3种子罐)。 (3)罐压：O.05MPa(表压)。

(4)风量控制：0～18h，0.08v.v.m；18～30h，0.1v.v.m；30h，0.12v.v.m。

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(5)搅拌转速：220r/min

(6)pH控制：3-7，一般最佳为5.5。 (7)容氧：30%以上

(8)发酵周期：50h， 比现有周期短80小时。

(9)发酵过程控制：每 12 h 补加一次甲醇，碳源：1.0％的甲醇混合 0.1％的甘油，氮源：常以氨水做氮源，发酵后期添加5％(NH4 ) 2 SO4 ,使NH4+浓度维持在150mmol/L以上(2 g/ L 左右)， 补料：流加50%的甘油、PTM盐、液氨等，

过程中细胞浓度达到220-250 g/L。 底物流加方法：

在诱导初始阶段, 细胞处于由甘油代谢向甲醇代谢的过渡适应期, 甲醇比消耗速率不断增加。当细胞完全适应甲醇环境后, 处于非生长状态下的毕赤酵母甲醇比消耗速率维持恒定。在这个阶段, 底物的流加策略主要有直接添加甲醇及流加甘油和甲醇混合物两种方式。

大量的研究表明, 流加甘油和甲醇混合物更有利于外源蛋白的高效表达。事实上, 高密度补料? 批式发酵过程中, 在诱导初期, 流加甘油和甲醇的混合底物而不单独流加甲醇的话, 菌体就不会由于甲醇的积累而中毒。此外, K atakura等研究表明, 在毕赤酵母高密度补料- 批式发酵过程中, 在过渡阶段流加甘油/甲醇混合底物有助于菌体更快地进行甲醇代谢 。因此, 使用甘油和甲醇的混合底物比只使用甲醇作为唯一碳源的底物能更快地诱导醇氧化酶和更快地适应细胞的代谢活动。因为甘油通过提供能量和甲醇代谢酶类所需的构件有助于甲醇代谢酶类的表达, 从而避免甲醇对菌体的毒害作用。

5.甲醇流加的方法

甲醇传感器在线检测控制甲醇的流加：

通过在线检测甲醇浓度控制甲醇的流加, 由于传感器灵敏度高, 响应时间短, 因此能有效地控制甲醇的流加速率, 使甲醇的浓度维持恒定, 同时有效地解决甲醇抑制时实现恒化培养问题, 是目前为止最好的一种检测甲醇浓度的方法。

3.3发酵液后处理获得木聚糖酶 3.3.1离心

离心沉降设备有瓶式离心机、管式离心机、多室式离心机和碟片式离心机。用于分离生物化学产品的离心机通常为碟片式离心机。本设计采用喷嘴排渣

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的碟片式离心机，具有坚硬的外壳，底部突出，与外壳铸在一起，壳上由圆锥形盖，由螺母紧固在外壳上，壳由高速旋转的倒锥形转鼓带动，其内设有数十片锥角为60~120°的锥形碟片,可进行连续离心。

碟片用0.8mm的不锈钢制成，碟片之间的间隙为0.5~2.5mm。在转鼓直径最大处，装有孔径为0.5~3.2mm的喷嘴，一般为2~24个，由于排渣的含液量较高，具有流动性，故喷嘴排渣的碟片式离心机可进行发酵液的浓缩。转鼓直径可达900mm，最大处理量为300m3/h。

根据现有型号，选用JMDJ211VC-03C离心机，处理量为10~15t/h，分离因数9000，动力22KW。

3.3.2干燥

按照热能传递给湿物料的方式，干燥方法可分为直接干燥，间接干燥和

介电加热干燥。对于一般的发酵车间采用的是直接干燥的方式，本设计采用的是喷雾干燥器发酵液干燥为固体颗粒。通过利用喷雾器将发酵液喷成雾状，形成具有较大表面积的分散微粒同热空气发生强烈的热交换，迅速排除本身的水分，在短时间内获得干燥。

1.雾化器的选择 将料液分散为雾滴的雾化器是喷雾干燥器的关键部件，常用的三种雾化器是气流式雾化器、压力式雾化器和旋转式雾化器。本设计中发酵液属于一般溶液，压力为低压，产品为微细固体，应采用旋转式雾化器。

2.开放式喷雾干燥系统 干燥介质在整个系统中只使用一次就排入大气中，不在循环使用。

3.雾滴和热风的接触方式为并流式 由于所生产的酶为热敏性物质，应经量降低发酵液的温度，采用并流式使得最热的热风与湿含量最大的雾滴接触，因而湿份迅速蒸发，雾滴表面温度接近空气的湿球温度，同时热空气湿度也显著降低，因此从雾滴到干燥成品的整个历程中，物料的温度不高，这对于热敏性的酶的干燥特别有利。

3.4工艺流程

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清洗废水 清洗废水 清洗废水 处理后进污水池

菌种 摇瓶 培养 一级种子罐放大培养 二级种子罐放大培发酵罐发酵 发酵液 蒸汽、空气、水、酵母粉、蛋白胨、甲醇、液氨等原料 固体 产品 筛分 半成品 分级 喷雾干燥塔 储罐 离心 热空气

图3-1 木聚糖酶酶简易生产工艺流程图

3.5产品的相关要求 3.5.1产品的规格与使用方法

表3-2 产品的规格与使用方法

产品规格 液体 固体 酶活（U/g） 80000 150000 使用方法 可单独使用，实际生产中，请根据饲料配方在每吨配合饲料中添加酶活5000U/g的本品50g；与其他酶制剂配合使用，效果更加明显。 3.5.2产品的包装与储运

25kg复合袋包装，原包装、25℃以下、密封条件下可保存12个月，储存中应避免日晒、雨淋、高温、高湿。而一般液体产品保存是在40℃条件下保存30天酶活存留率达91.3% 。

3.5.3常用饲料原料中木聚糖含量

木聚糖是植物性饲料原料中分布最广、含量最高的一类半纤维素，是饲料中非淀粉多糖的一种，普遍存在于植物饲料中，但以粕类，特别是豆粕中含量较高

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（表3-2）；一些非常规粕类，如棕榈粕、椰子粕中含量更高，达25%-35%。具体如下：

表3-2 常用饲料原料中木聚糖含量

饲料原料 豆粕（44%） 棕榈粕 椰子粕 葵花粕 高粱 米糠 木聚糖含量 1.5-1.8 2.5-3.0 25-35 0.56 0.10 0.33 饲料原料 去皮豆粕（44%） 菜籽粕 棉粕 花生粕 小麦 芝麻粕 木聚糖含量（%） 1.1-1.3 0.48 0.37 0.52 0.11 3-4

第四章 工艺计算

4.1物料衡算 4.1.1原料的物料衡算

设计任务：年产6000吨木聚糖酶发酵车间的设计 工艺确定的工艺参数：

菌种培养时间36h，种子培养温度30°C，发酵罐发酵时间50h，发酵罐操作周期为96小时，发酵温度28°C。

重组毕赤酵母可获得的发酵水平为50000U/mL、经后处理得到的木聚糖酶活性为50000U/g、木聚糖酶的收率按80%，发酵罐中的比重取1.045，年工作日为280天。

年产6000吨固体木聚糖酶的收率按80%计算，则一年所需发酵液中酶活为50000U/g木聚糖酶为6000/0.8=7500t

则一年需要发酵液为75003106 350000/50000=7500m3 若工厂生产周期为4天，这有65个周期 每周期需生产的发酵液：7500/65＝115.38 m3

确定采用总容积为80 m3发酵罐，则需要发酵罐的个数为3个，填充系数72％，发酵罐中的比重取1.045。

单罐批料量为： 80372%31.045＝61t

根据发酵液的接种量为1/10，所以投料量为:发酵罐61t，二级种子罐6.1t

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种子罐的个数为：每个发酵周期种子罐可生产次数为54÷36＝1.5，取正数为1，

则种子罐个数为2÷1＝2，设计种子罐2个。 考虑到工程菌损失1%，则年需发酵液为： 61323653（1+1%）=8009.3t

实际年生产木聚糖酶的量为：8009.3380%=6407.44t 富裕量为：6407.44t-6000t=407.44t 富裕率为：407.44/60003100%=6.8%

4.2热量衡算 ：换热面积的计算

基础数据：发酵高峰发热量4.18636000 KJ/(m32h)，发酵液体的浓度1075.64kg/ m3。

1、种子罐：

采用立式蛇管换热器，换热系数为 K＝4.1863400KJ/(m32h2℃)

冷却水的入口温度为9℃，出口温度为17℃，种子罐温度控制在30℃。 平均温度差：△tm=[(30-17)-(30-17)]/{ln[(30-17)/(30-9)]}=14.64℃ 一级种子罐换热面积：F=Q/（K2Δtm）=[4.1863600030.613103/1075.64]/( 4.1863400314.64)=0.60 m2

二级种子罐换热面积：F=Q/（K2Δtm）=[4.1863600036.13103/1075.64]/( 4.1863400314.64)=5.98 m2

2、发酵罐：

采用立式蛇管换热器，换热系数为K＝4.1863400Kg/(m32h2℃) 冷却水的入口温度为9℃，出口温度为17℃，发酵罐温度控制在30℃。

平均温度差： △tm=[(30-17)-(30-17)]/{ln[(30-17)/(30-9)]}=16.68℃ 换热面积：F=Q/（K2Δtm）=[4.186360003803103/1075.64]/( 4.1863400316.68)}=68.89m2

4.3冷却水水耗

1、洗水用量（取罐容积的5%）

每个生产周期共需：（80+8+.08）3235%=8.88m3 全年共需：8.88365*2=1154.4m3

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2、冷却水用量

(1)种子罐：培养时间按24h计 C水＝4.18 kJ/(kg20C)

一级种子罐需水量，培养时间按20h计{[4.1863600030.613103/1075.64]320]}/[4.183(17-9)]

=8.774t

二级种子罐需水量，培养时间按16h计

{[4.1863600036.13103/1075.64]316]}/[4.183(17-9)] =70.19t

全年需冷却水量79.96432365＝10.265t (2)发酵罐：发酵周期按50h计

单罐需水量{[4.186360003613103/1075.64]350]}/[4.183（17-9）]=2193.584t

全年需冷却水量2193.58432365＝285165.95t

第五章 设备的设计与选型

5.1输送设备的设计计算

气流:va=20m/s 混合比:μ=1

输送空气量:ρ空气=1.2kg/m3,生产能力:2.5t/h,

Q气=W/(μρ)=2.53103/(131.2)=2083.3m3/h=0.5787(m3/s)

.3/21=0.192m 取整0.2m 输送管直径: D=0.0188Q/va=0.01888333压力损失:

(1)加速段:Δp=(C+μ)ρ空气va/2=(8+1)31.23202/2=2160Pa (2)水平管:αH=1.452

0.00110.0011λa=K(0.0125+D)=1.3(0.0125+0.37)=0.0237

1.2?212L??22ΔP=αhλaD2=1.395*0.0201*10*=84.4

(3)垂直输料段:

21

2502503/23/2αv=v+0.15μ=21+0.15=2.945 LΔPHL=αvλD(4)输料弯管:

发酵车间空气净化系统图=1308.7 ??2R/D=6 ξe=0.5 ΔPEl=ξe*μs2=120Pa (5)旋风分离器:

??2ξ=5.5 ΔPsl=ξ(6)洗尘塔阻力: 100mmH2O=1176.4Pa (7)空气管路损失:

取空气管D=0.4m 风速为21m/s

2=475Pa

0.0011直管部分: λa=K(0.0125+D)=0.0234 L??2 ΔPav=λaD2=561.6Pa 弯管部分: R/D=2.0 ξb=0.15 取 3个

1.2?2122ΔPbr=3ξb2=3*0.15*=108Pa

??2(8)总压力损失:

ΔP=1984.5+74.19+146.25+132.3+844.8+1176.4+53.18+ 119.07=4530.7Pa

功率消耗:取10%的裕量:系统的总风压P=1.1Pa=4983.8Pa总风量V=1.1va=1.132.3148=2.546m3/s

4983.8?2.5460.7功率N=?==6.0kw

VP

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6．风机选择:查化工手册选择9-19型10D 真空泵，功率7.5kw 转速:2900rpm

5.2发酵设备的设计及选型 5.2.1发酵罐的设计计算（60m3）

发酵罐为通风式发酵罐，结构为圆筒体椭圆形封头焊接而成，材料为不锈钢，罐内必须焊接平整、磨光，以利于清洗和防治结垢。灌顶有人孔、进料补料口、排气口、压力表、视镜、接种口、取样口和消泡回流口等。内部设挡板和搅拌器，大型罐内设列管式换热器。

1、尺寸设计：

H0=2.0D B=0.1D S=3Di C=Di Di=(1/3)D

12DH0?4V0＝ V1 V2分别为底封头和顶封头容积＝(л/4)D2[hb+(1/6)D]

发酵罐容积V＝V0+V1+V2

12DH0?总容积近似计算公式为V＝4+0.15D3

其中：H0—园筒体高 B—挡板宽 S—两搅拌桨间距 Di—搅拌桨直径 C—下搅拌桨离封底的间距

V =(π/4)D2 H0+0.15D3=(π/4)D23(2.0D)+0.15D3=80380% D=3.033m=3033mm 取整D=3100mm

则H0=6200mm H=2.5D=7750mm 取H=8000mm 封头椭圆短半轴长度ha=(1/4)D=775mm

封头椭圆直边高度hb=(H-H0)/2-ha=(8000-6200)/2-775=125mm 则椭圆封头的体积为V1=(π/4)D23[hb+(1/6)D]

=(π/4)3(3.1)23[0.125+(1/6)33.1]=4.84m3 则发酵罐的公称容积为51.61m3,全体积为56.45 m3。 按通用罐系列，取搅拌桨直径Di=(1/3)D=(1/3)33.1=1.03m， 取整Di=1.1m

2、材料：1Cr18Ni9Ti耐酸不锈钢 3、罐体厚：

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S0=(PD)/[(230[σ]Ф)-P]+C1+C2(mm)

其中：P—耐受压强，取1.5MPa D—罐径，单位mm Ф—焊缝系数，取Ф=0.8 C1—腐蚀欲度，取C1=3mm C2—钢板抗拉欲度，取C2=1mm [Ф]—许用应力，取12 则S0=(1.533100)/(23031230.8-1.5)+3+1=6.11mm 取S0=6.5mm,即罐体厚为6.5mm。 4.换热器

换热面积为40.13㎡，冷却水进口温度为9℃，出口温度为17℃。 W=Q总/[Cp(t2-t2)]

={4.186360003[483103/1075.64]}/[4.183(17-9)] =33468.45kg/h

则冷却水的体积流量为（33468.45kg/h）/(1000kg/m333600s/h) =1.00310-2m3/s 取冷却水的流速为v=1m/s

冷却水管总面积S总=（1.00310-2m3/s）1/m/s=1.00310-2㎡ 进水管总直径d总=[S总/(π/4)]1/2=[(1.00310-2)/0.785]1/2=0.1129m

冷却水管取4组，则管径d0

43（π/4）d02=(π/4) d总2

d0=(1/2)d总=(1/2)30.1129=0.05645m=56.45mm 选取Ф7639无缝钢管

取竖蛇管圈端部U型弯管曲径为250mm，则两直管距500mm，弯管总长 L0=πD=3.143500=1570mm

冷却管总长L：dm=(76-58)/[㏑(76/58)]=66.60mm=0.06660m L=F/(πdm)=40.13/(3.1430.06660)=191.90m 液高：HN=[483103/1075.64-4.84]/[( π/4) 33.12]=5.27m 取管高5.2m

则每组管子的圈数为n0=L/[n3(h32)]= 191.90/[43(5.232)]=4.61,

取整n0=5

则实际管长L=4353235.2=208m

24

实际换热面积F=π3dm3L=3.1430.066603208=43.50㎡ 5、搅拌桨：

采用六箭叶涡轮搅拌器，两挡搅拌。

搅拌桨直径Di=(1/3)D=(1/3) 33.1m=1.03m,取Di=1.1m 尺寸设计：

叶宽B0=0.2Di=0.231.1=0.22m 下搅拌桨离封底的间距C=（1/3）D， 取C=1.1m 叶距S=3Di=331.1=3.3m 箭叶厚度δ=12mm （2）搅拌轴功率 转速取 100r/min

n=100r/min P=0.05Mpa μ=1.3310-3N2s/m3 ρ=1075.64kg/ m3

则通风量Q=4.8 m3/min

Rem=( Di2Nρ)/ μ=[1.123(100/60) 31075.64]/1.3310-3=1.673106

其中：N—转速 查图得：Np=2.8

P0= Np3Di53N33ρ=2.831.153(100/60)3 31075.64=16.87KW Pg=2.25(P023n3Di3/Q0.08)0.39310-3

=2.25[16.872310031013/(4.83106)0.08]0.39310-3=16.82KW

(3)搅拌轴计算 材料：1Cr18Ni9Ti

按扭转强度计算d≥12.43[(16.823103/735)/100]1/3=7.58cm 按弯曲强度计算d≥103[(16.823103/735)/100]1/4=6.92cm 根据资料得，应按弯曲强度计算，考虑到轴上开键槽，轴径增加20%， 即6.923（1+20%）=8.30cm (4)挡板：取4块挡板 (5)减速器设计与电机选型

大功率皮带减速机选用YPV9a-1301150型，出轴转速150r/min，传动比：4 功率：130KW。

电机选用YSL450-10型电机，功率为130KW。 6.管道设计

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(1)进料管：接种时间5 min

体积流量：Q=[11.23231033(1+3.6)/1075.64]/(5360)=0.1601m3/s 取流速2m/s 则F=0.1601/2=0.08005㎡ d=(0.08005/0.785)1/2=0.3193m 选取Ф377328无缝钢管 (2)排料管选取Ф377325无缝钢管

(3)通风管 风量Q=4.8m3/min=0.08 m3/s 取风速v=25m/s 则F=0.08/25=0.0032m2 d=(0.0032/0.785)1/2=0.0638m 选取Ф7636

(4)取样管 Ф3032.5无缝钢管 以上钢管均采用耐酸不锈钢材料 7.支座设计 醪重：48t

罐体重：（πDH0+2S封头）3S3ρ钢

=（3.1433.136.2+234.84）30.00637.93103=3.32t S—罐体厚 ρ钢=7.93103kg/m3

换热管重：191.903（3.14/4）3（0.0762-0.0582）37.93103=2.870t 换热管内水重：(3.14/4) 3(0.058)2 3191.9031000=0.507t 支座承受的重量为：48+3.32+2.870+0.507=54.70t 8.人孔：Dg=500mm 视镜：Dg=150mm

人梯：材料1Cr8Ni9Ti

5.2.2种子罐的设计

根据发酵液的接种量为1/10，可以设计二级种子罐的体积为8 m3，一级种子罐的体积为0.8 m3，具体部件的计算过程同发酵罐，其材料为1Cr8Ni9Ti耐酸不锈钢材料。

5.3发酵车间相关设备的型号一览表

表5-1 发酵段主要设备一览表

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发酵罐 80m 3河北冀能化工有限公司 数量：3台 数量：3台 编号：59543002 发酵罐电机 YSL450-10 无锡华达电机有限公司 电源电压：380V 转速590r/min 功率：130KW 数量：3台 编号：105056155157 大功率皮带减速机 YPV9a-1301150Ⅰ 浙江长城减速机有限公司 出轴转速150r/min 传动比：4 功率：130KW 一级种子罐 0.8 m 3河北冀能化工有限公司 数量:3台 材质：外壳３０４ 数量：2台 编号：608048 一级种子罐电机 P100A-4G 常州莱克斯诺传动设备公司 出轴转速1410r/min 电源：380V 功率：2.2KW 数量：3台 编号：105058159 一级种罐减速机 CFC2V-2.2/270Ⅱ 浙江长城减速机有限公司 出轴转速:220r/min 传动比：5 功率：2.2KW 二级种子罐 8 m 3河北冀能化工有限公司 数量:3台 材质：外壳３０４ 数量:3台 二级种罐电机 Y2-160L-4 浙江防爆电机有限公司 编号：339 电源：220V 50HZ 功率：15 KW 数量：3台 编号：105051/52 二级种罐减速机 FLC125-11/200Ⅱ 浙江长城减速机有限公司 输入转速:1450r/min 输出转速:200r/min 功率：11KW

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甘油罐 6 m 3河北冀能化工有限公司 数量:3台 材质：外壳３０４ 数量：3台 甘油罐减速机 FLC125-11/200Ⅱ 编号：105051/52 浙江长城减速机有限公 司 输入转速:1450r/min 输出转速:200r/min 功率：11KW 数量:3台 甘油罐电机 Y2-160L-4 浙江防爆电机有限公司 编号：339 电源：220V 50HZ 功率：15 KW 泡敌罐 3.5 m 3河北冀能化工有限公司 数量:3台 材质：外壳３０４ F3012-10-397 材质：搪瓷 输入转速:1450r/min 功率：5.5 KW 输入转速:1440r/min 功率：5.5 KW 数量:1台 材质：外壳３０４ 数量：1台 编号：274 无机盐罐 无机盐罐减速机 无机盐电机 3 m 3淄博太极工业搪瓷有限公司 BDL-11-5.5 Y132S-4 淄博太极工业搪瓷有限公司 烟台博达机电有限公司 配料罐 15m 3河北冀能化工有限公司 配料罐电机 Y2-160L-4 浙江防爆电机有限公司 转速:1460r/min 功率：15 KW 频率：50HZ 数量：1台 编号：10655 输出转速:69 r/min 功率：15 KW 数量：3台 编号：110584 配料罐减速机 XLD15-8-21 浙江长城减速机有限公司 自吸泵 2HJ80-50-250 淄博康威泵业有限公司 扬程：80m 功率：22KW 流量：50m/h 介质：水 3补糖罐

15 m 3河北冀能化工有限公司 28

数量：3台 数量：3台 补糖罐电机 Y225M-6 威海泰富西玛电机有限公司 编号：13534151 功率：30KW 转速：980 r/min 数量：3台 编号：101210109 功率：37KW 输入转速：1000r/min 输出转速：330 r/min 大功率皮带减速机 FPV6-37/330Ⅰ 浙江长城减速机有限公司

第六章 发酵车间的布置

6.1概述

设计的目的是对厂房的配置和设备的排列做出合理的安排，并决定车间的长度、宽度、高度和建筑结构的型式，以及生产车间与工段之间的相互关系。

酶制剂生产车间布置是工艺设计的重要组成部分，不仅对建成投产后的生产实践有很大关系，而且影响到工厂的整体布局。车间布置一经施工就不易更改，所以，在设计过程中必须全面考虑。车间布置设计以工艺设计为主导，必须与土建、给排水、供电、供汽、通风采暖、制冷以及设备、安装、安全、卫生等方面取得统一和协调。

发酵车间平面设计，主要是把车间的全部设备（包括工作台等），在一定的建筑面积内做出合理安排。平面布置图，就是把屋盖（或楼盖）掀开往下看，径直画出设备的外形轮廓图。在平面图中，必须表示清楚各种设备的安装位置，下水道、门窗、各工序及各车间生活设施的位置，进出口及防蝇、防虫措施等。除平面图外，有时还必须画出生产车间剖面图，剖面图又叫“立剖面图”。它是解决平面图中不能反映的重要设备和建筑物立面之间的关系，以及画出设备高度、门窗高度等在平面图中无法反映的尺寸。

6.2生产车间工艺布置的原则 6.2.1车间布置设计的依据

车间布置设计必须在充分调查的基础上，掌握必要的资料作为设计的依据，

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这些资料包括：

① 生产工艺图；

② 物料衡算数据及物料性质，包括原料、半成品、成品、副产品的数量及性质；三废的数量及处理方法；

③ 设备资料，包括设备的外形尺寸、重量、支撑形式、保温情况及其操作条件，设备一览表等；

④ 公用系统耗用量，供排水、供电、供热、供冷、压缩空气、外管资料等； ⑤ 土建资料和劳动安全、防火、防爆资料等； ⑥ 车间组织及定员资料；

⑦ 厂区总平面布置，包括本车间与其他生产车间、辅助车间、生活设施的相互关系，厂内人流、物流的情况与数量等； ⑧ 国家、行业有关方面的规范资料。

6.2.2生产车间工艺布置的原则

在进行车间工艺布置时，应根据下列原则进行：

1.要有总体设计的全局观点。首先满足生产的要求，同时，还必须从本车间在总平面图上的位置，考虑与其他车间或部门间的关系以及发展前景等，满足总体设计的要求；

2.设备布置要尽量按工艺流程的顺序来作安排，但有些特殊设备可按相同类型设备作适当集中，务必使生产过程占地最少、生产周期最短、操作最方便。如果一车间系多层建筑，要设有垂直运输装置，一般重型设备最好在底层，原料收发间应设有地磅。

3.在进行生产车间设备布置时，应考虑到进行多品种生产的可能，以便灵活调动设备，并留有相当的余地，以便更换设备，同时，还应注意设备相互间的间距和设备与建筑物的安全维修距离，既要保证操作方便，又要保证维修装拆和清洁卫生的方便。

4.生产车间与其他车间的各工序要相互配合，保证各物料运输通畅，避免重复往返。必须注意：要尽可能利用生产车间的空间运输；合理安排生产车间各种废料的排出，人员进出要和物料进出分开。人流通道、物流通道包装材料通道要流畅，尽量避免交叉、往复、污染。

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5.必须考虑生产卫生和劳动保护。如卫生消毒、防蝇防虫、车间排水、电器防潮及安全防火等措施。

6.应注意车间的采光、通风、采暖、降温等设施。对散发热量、气味及有腐蚀性的介质，要单独集中布置。对空压机房、空调机房和真空泵房等既要分隔，又要尽可能接近使用地点，以减少输送管路的长度及在管路中的能量损失。

7.可以设在室外的设备，尽可能设在室外，上面可加盖简易棚。

8.根据生产工艺对品质控制的要求，对生产车间或流水线的卫生控制等级要进行明确的区域划分和区间隔离，不同卫生等级的制品不能混流、混放，更不能倒流，造成重复性加工和污染。

9.严格执行HACCP、ISO14000、GMP的规范性。

6.3发酵车间的设计

发酵车间的设备主要有种子罐、发酵罐。依据前面的计算，按比例绘制发酵车间平面立面布置图。

现将发酵车间布置设计步骤叙述如下：

1.整理好设备清单、生活室等各部分的面积要求，根据工艺流程对生产区域、辅助区域、生活行政区域的面积做初步的划分。

2.对设备清单进行全面分析，哪些是轻的、可以移动的，哪些是几个产品生产时公用的，哪些是某一产品专用的等等。对于笨重的、固定的和专用的设备，应尽量排布在车间四周；而对于轻的，可移动的设备，可排在车间的中间，这样，在更换产品时调换设备比较方便。

3.根据该车间在全厂总平面中的位置，确定车间建筑物的结构形式、朝向和跨度；用坐标纸按厂房建筑设计的要求，绘制厂房建筑平面轮廓草图（比例可用1∶100，必要时也可用1∶200或1∶50），画好生产车间的长度、宽度和柱子以及大体上的区域位置。

4.按照总平面图的构思，确定生产流水线方向。

5.将设备尺寸按比例大小，剪成方块状（或设备外形轮廓俯视图），在草图上进行排布，应排出多种不同的方案，以便分析比较。若采用AutoCAD制图，会更加方便，这也是作为一个现代的工程设计人员所必需掌握的基本技能。

6.对不同的方案可从以下几个方面进行比较

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①工艺流程的合理性，人流、物流的畅通，与总平面的协调（包括废弃物及包装物的流向）；

②建筑结构的造价、建筑形式的实用和美感；

③管道安装（包括工艺、上下水、冷、电、汽等方面）的便捷、隐蔽、规范和美观，与公用设施的距离及施工的便利；

④车间内外运输的流畅（包括原料进厂及产品出厂的流向）； ⑤生产卫生条件的合理、规范；

⑥操作条件的可靠性、消防安全措施的完整； ⑦通风采光等。

通过上述7个方面来分析比较各方案的优缺点，综合评价，选出最佳方案，再逐一计算每台设备必须的辅助场地和空间，而后把生活间、车间办公室等辅助用房放进去，再对布置做出必要的调整和修正。

7.对自己确认的方案征求配套专家的意见，在此基础上完善后，再提交给委托方和相关专家征求意见，集思广益，根据讨论征求的意见做出必要的修改、调整，最终确定一个完整的方案。

8.在平面图的基础上再根据需要确定剖视位置，画出剖视图，最后画出正式的车间图，按照设计阶段的不同划分为初步设计阶段的车间布置图和施工图阶段的车间布置图，它们在表达内容的深度上有所不同；从设计程序上，一般为：车间布置草图→车间布置图（初步设计阶段）→车间布置图（施工图阶段）。

另外，车间布置设计也有用立体模型布置的，它是先将车间内设备和厂房按比例制成立体模型，而后进行布置，这种方法由于计算机的普及已得到广泛应用，它适合于现代化的、复杂的大型车间的布置，具有更直观、实际的优点。

6.4管路的设计

管路系统是饲料工厂生产过程中不可少的部分。蒸汽、水、压缩空气、真空、煤气以及流体物料等，都要用管路来输送。同时，有些设备与设备之间的连接，亦要用管路组成一条连续化生产作业线。由于管路系统的设计对工艺的要求很高，譬如物料的性质、物料的流量、流送的位置，都与工艺的设计密不可分，所以管道布置是否合理，不仅直接关系到建设指标是否先进合理，而且也关系到生产操作能否正常进行以及厂房各车间布置的整齐美观、通风采光良好等问题，也就是说，工艺设计师必须进行管路计算。

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第七章 总平面布置与建筑说明

7.1设计依据和范围 7.1.1设计依据

a、国家及地方现行的规范、规定； b、项目相关专业提供的技术条件； c、厂方提供的基础资料

7.2厂址

7.2.1厂址地理位置

本设计的厂址选择充分考虑了国家地区的工业布局和城市规划，考虑了本地区的地质条件，年降雨量，风向，地形地势等一系列地理条件和能源供应，给排水等技术经济条件，协调了同周围企业的共同发展问题，具有方便的交通条件，保证原料和产品的及时流通。厂址选择保证了建厂过程中以最省的投资费用，安质安量安期完成工程设计中所提出的各项指标，充分考虑了投产后的长期生产，技术管理和发展远景问题，例如投产后的工厂生产管理工作，原材料和成品的产供销，动力设施的安装和维修，交通运输方式和费用，产品的结构和质量及职工生活安排等方面。

7.2.2厂区基本条件

（1）厂址的位置要符合城市规划（供汽、供热、给排水、交通工程、职工文化生活、商业网点等）和微生物发酵工厂对环境的特殊要求。

（2）厂址的地区要接近原料、燃料基地和产品销售服务区，还要接近水源和电源。

（3）具有良好的交通运输条件。

（4）场地有效利用系数较高，并有远景规划的最终总体布局。 （5）有一定的基建施工条件和投产后的协作条件。 （6）厂址选择要有利于“三废”处理，保证环境卫生。

7.3总厂平面设计

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7.3.1平面设计原则 发酵工厂总平面设计主要是依据总平面不止方案草图及生产工艺流程简图，并按照国家有关的设计标准和规范，逐步编制出来的。总平面设计的内容有以下几个方面：

1、总平面设计必须符合生产流程要求，并能保证合理的生产作业线，避免原 材料、半成品的运输交叉和往返运输。

2、总平面设计应将面积大、主要的生产厂房布置在长驱的中心地带，以便其他部门为其配套服务；辅助车间和动力车间应尽量在靠近其所服务的负荷中心；工厂大门和生活区应与生产主厂房相适应，便于工人上下班。

3、总平面设计应充分考虑地区主风向的影响。散发煤烟灰尘的车间和易燃仓库及堆场应尽可能集中布置在场地的边沿地带和主导的下风向。发酵工厂菌种各异，应防止环境染菌。

4、总平面设计应将人流、货流通道分开，避免交叉。工厂的大门至少应设置两个以上。合理设计厂区对外运输系统，将运输量大的仓库尽量靠近对外运输主干线，保证良好运输条件和效益。

5、总平面设计应符合国家有关规定和规范。如：建筑设计防火规范、厂矿道路设计规范、工业企业采暖通风和空气调节规范、工业锅炉房设计规范、工业企业卫生标准、工业“三废”排放试行标准规定、工业与民用通风设备电子装备设计规范等。

7.3.2平面的总体布置的设计方案

一般来说，工厂厂区包括下列几个项目：

1、 生产车间 包括从种子制备和发酵配料开始到成品分装，包装出厂全过程的生产车间。它是工厂的主体。

2、 辅助车间 包括原料仓库、成品仓库、机修部分排放物的处理等部门。 3、 动力车间 一般指锅炉房、变电站、配电室、空压站、水泵房、冷冻站，并含有地上、地下各类有关构成物。

4、行管部门。

5、运输设施和各类地上、地下工程管网。如上、下水道，电缆或架空电气线路、物料管道、空气管道。

6、绿化设施和美化环境布置。

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7.3.3工厂出入口布置特征

厂区设计两个出入口，东门位于本项目南侧，主要功能用于大型车辆的通行，承担生产车间的原料及产品的运输。南门主要功能是小型车辆、人员通行。

7.3.4厂区设计

本项目占地面积66132m2，考虑到现代化生物工程工厂的特色，尽量节约生产空间，适当提高绿化、道路，小品等占地面积。主要建设内容包括：建设发酵车间、提取车间、生产车间、动力和循环车间、成品和原料库及其他配套设施。生产项目总建筑面积12230m2，其中发酵车间为4500m2，提炼车间2000m2，干燥车间500m2，包装车间800m2，制冷剂车间、泵房500m2，空压机车间400m2，综合楼1000m2，其他配套工程锅炉房、配电房、仓库等3530m2，购置生产、实验及配套设备汞191台（套）。

主车间车间位于项目用地最南侧，根据物料走向最省原则，生产工序依次自西向东排布，车间共分为三层，局部为二层，车间办公室及中试生产线位于西侧，配电及动力车间安排在生产车间一层的中部，包装GMP车间位于生产车间的东部，包装车间东邻为单层轻钢结构的成品仓库，主车间北侧道路以北空地的东端为项目自来水池、循环水池及相关泵房位置。

雨水经车间外散水台向东排入厂区雨水沟，车间污水自车间污水管网向西排至厂区污水管网，入污水处理系统集中处理后排放。

规划道路及硬化地面约占总面积的18%，绿地占25%，建筑48%，厂标、雕塑等其他内容5%。

7.3.5坐标系统

本设计平面定位采用相对坐标，原点（A0.000，B0.00）拟定于厂区征地的西南角。场地空间根据自然地势和环境条件，地势坡度由东向西下降和排放雨水。

7.3.6厂区划分要求

在进行总平面布置的时候，首先对厂区进行建筑划分。根据生产、管理的需要，结合安全卫生、运输和绿化的特点，把全厂建、构筑物群划分为若干紧密而性质相近的单元。这样则满足了生产工艺流水线的要求，以利于邻近各厂房建、构筑物之间保持协调、互相的关系。

在总平面布置时，同时还要与厂址实际地势相联系，进行合理的布置。在考虑各建、构筑物布置的同时，厂区运输道路要布置合理，主干道与大门连通，绿

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化设施、美化环境等问题都要进行考虑。

7.4建、构筑物的布置位置

1、主生产车间建筑物的布置位置是决定全厂区布置的关键 在确定其位置时，考虑到生产的工艺，建筑物的高低，对采光的要求等因素。厂房要求平直整齐，沿生产流程线呈链条状布置。这样便于集中管理。

2、辅助车间建筑物等的布置 辅助车间建筑物等的位置应安排在服务对象的最近距离，以减少管道的输送距离。

3、动力车间建筑物的布置位置 动力车间一些工段的位置布置应靠近起服务的具体部门，可以大部分集中在厂区的两侧。以最大限度的减少输汽、水、电、冷的管线为原则，同时动力车间应安排在厂区的下风向，以减少烟尘污染厂区和引起火灾。

4、确定厂区建、构筑物之间的距离 将各构筑物群，根据各个建筑物的作用，确定其方位，然后分析比较确定间距离。

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