抗苯磺隆猪殃殃乙酰乳酸合成酶的突变研究

抗苯磺隆猪殃殃乙酰乳酸合成酶的突变研究

中国农业科学 2010,43(5):972-977 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.05.011

抗苯磺隆猪殃殃乙酰乳酸合成酶的突变研究

孙 健，王金信，张宏军，刘君良，卞圣楠

（1山东农业大学植物保护学院，山东泰安 271018；2农业部农药检定所，北京 100125）

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2

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摘要:【目的】近几年,中国大部分冬小麦田猪殃殃（Galium aparine L.）用苯磺隆已无法有效控制。为明确猪殃殃对苯磺隆产生抗药性的分子机制，本试验从分子水平上开展研究，以初步明确乙酰乳酸合成酶（ALS）氨基酸序列的突变位点。【方法】通过对敏感和抗药性猪殃殃生物型ALS基因片段进行扩增、克隆和测序，比对2种生物型的ALS序列。【结果】与敏感生物型猪殃殃的ALS相比，抗药性猪殃殃生物型ALS有3个位点发生突变，其中位于高度保守区Domain B的第574位色氨酸被甘氨酸所取代。【结论】该位点的突变可能是猪殃殃对苯磺隆产生抗药性的主要原因。

关键词：抗药性；猪殃殃；乙酰乳酸合成酶；基因突变

Study on Mutations in ALS of Resistance to Tribenuron-Methyl

in Galium aparine L.

SUN Jian1, WANG Jin-xin1, ZHANG Hong-jun2, LIU Jun-liang1, BIAN Sheng-nan1

(1College of Plant Protection, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, Shandong; 2Institute for the Control of

Agrochemicals, Ministry of Agriculture, Beijing 100125)

Abstract: 【Objective】 In recent years, Galium aparine L. in most winter wheat fields in China could not be controlled by tribenuron-methyl. The objective of this study is to understand the molecular basis of the resistance mechanism to tribenuron-methyl in G. aparine and to find the specific mutation sites in amino acid sequence of acetolactate synthase (ALS) in the resistant biotype of G. aparine. 【Method】 Fragments encoding the ALS were amplified and cloned from G. aparine, susceptible (S) and resistant (R) biotypes to tribenuron-methyl, respectively, and sequenced subsequently. 【Result】 The result showed that the nucleotide sequence of R-biotype of G. aparine differed from that of the S biotype with three amino acid substitutions, of which, the amino acid substitution of Trp574 (TGG) to Gly (GGG) located in the highly conserved region Domain B. 【Conclusion】 The substitution of Trp574 might be responsible for the resistance to tribenuron-methyl in the R-biotype of G. aparine.

Key words: resistance; Galium aparine L.; acetolactate synthase; gene mutation

0 引言

【研究意义】猪殃殃（Galium aparine L.）是生长在冬小麦田和冬油菜田的一种恶性茜草科杂草[1]，危害非常严重。苯磺隆属于乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase, ALS）抑制剂类除草剂，因用量低、低残留、选择性强、杀草谱广以及对哺乳动物安全使之成为用于防除麦田阔叶杂草的重要除草剂[2-3]，但是，由于其作用位点单一，容易产生抗性[4-5]。近几年，由于长期

单一使用，在中国北方大部分冬小麦田，猪殃殃对苯磺隆产生了不同程度的抗药性[1]。【前人研究进展】大多数情况下，杂草对ALS抑制剂的抗性是由ALS基因一个或几个位点突变所致[6-7]。1992年Guttieri 等[8]首次报道了从靶标酶基因突变研究抗药性的机理，研究发现，毒莴苣（Lactuca serriola）和地肤（Kochia scoparia）对ALS抑制剂产生抗药性是由197位脯氨酸突变所致。此后，更多杂草或植物的ALS基因被相继克隆、测序、分析，以更好地解释抗药性机理。目

收稿日期：2009-08-24；接受日期：2009-10-21

基金项目：国家“十一五”科技支撑计划（2006BAD08A09）

作者简介：孙 健，硕士研究生。Tel：0538-8241114；E-mail：sunrain0309@。通信作者王金信，教授，博士。Tel：0538-8241114；E-mail：

Wangjx@

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前已发现的ALS抑制剂抗性杂草中，共有6个ALS基因位点发生了突变，从而导致ALS发生变异。这些位点在拟南芥ALS氨基酸序列中相应的位置及表达的氨基酸分别为第122位丙氨酸（Ala122），第197位脯氨酸（Pro197），第205位丙氨酸（Ala205），第376位天冬氨酸（Asp376），第574位色氨酸（Trp574）和第653位丝氨酸（Ser653）[6,9-11]。其中，有5个位点分别位于Domain C、Domain A、Domain D、Domain B和Domain E 5个保守区中，第376位天冬氨酸被谷氨酸取代是近期发现的一个新的突变位点。目前，报道最多的是Domain A的Pro197位点的突变。

中国正式报道的有3种，分别是雨久花（Monochoria korsakowii）对苄嘧磺隆和吡嘧磺隆[12]、慈姑（Sagittaria montevidensis）对苄嘧磺隆和吡嘧磺隆[13]及播娘蒿（Descurainia sophia）对苯磺隆[14-15]产生抗药性。【本研究切入点】目前冬小麦田猪殃殃发生严重，部分地区农业技术员反映使用苯磺隆常规剂量已无法有效控制其发生危害。唐贵章等[16]发现，苯磺隆防除麦田猪殃殃不论冬季前施药还是春季施药，效果均不理想，但目前未见从分子水平研究猪殃殃对苯磺隆的抗性机制。【拟解决的关键问题】本研究从分子水平研究猪殃殃对苯磺隆的抗性机制，并初步明确其产生抗药性突变的基因位点。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试抗药性猪殃殃种子分别于2007年和2008年5月采自山东省济宁市梁山约有10年苯磺隆使用历史 的冬小麦田，室内盆栽经75%苯磺隆水分散粒剂 54 g a.i./hm2处理仍存活，并继续培养，单株收集存活猪殃殃种子，供测试用。

供试敏感型猪殃殃种子采自同一地区的非农田（从未使用过除草剂），室内盆栽经75%苯磺隆水分散粒剂18 g a.i./hm2处理，16 d后全部死亡。 1.2 试验方法 1.2.1 温室盆栽法

[17]

每盆面积100 cm2

，对单株收

集的猪殃殃种子进行催芽，播种露白的种子，每盆10粒，置于温室内培养。温室温度白天（25±5）℃，夜间为（15±5）℃，光照强度为15 000—23 500 lx，相对湿度（75±5）%。待叶片长至3—4轮，取幼嫩叶片（0.2 g/包），经消毒处理后，放入-80℃冰箱内保存，备用。

1.2.2 引物的设计与合成 目前已有多种植物的

ALS基因被克隆和报道，从NCBI的GenBank登记的ALS基因序列中，选取拟南芥等5种植物的ALS氨基酸序列，找出这几种植物共有的同源保守区（表1），参考其保守区域设计引物，引物由上海博尚生物技术有限公司合成。

表1 不同植物的ALS基因序列

Table 1 ALS gene sequence identification from various plant

species

登录号* 生物 碱基数

氨基酸数

Accession Organism

NucleotideAmino acid

No. AY541454向日葵（Helianthus annuus L.） 1959 652 U16279 苍耳（Xanthium strumarium L.） 1947

649

X07644 烟草（Nicotiana tabacum L.） 2004 667

X16708 油菜（B.napus L.） 1896 637 X51514

拟南芥（Arabidopsis thaliana L.） 2013

670

* 在NCBI GenBank上的登记号 NCBI GenBank accession number

根据上述植物的ALS序列保守区设计了2对引物（表2），这2对引物扩增的片段长度约为520 bp（没有内含子的情况下），包含已报道的一个保守区。用温度梯度PCR仪（Biometra T-Gradient Thermoblock）确定每一对引物的最佳退火温度。

表2 扩增猪殃殃ALS片段的引物

Table 2 Primers designed for Galium aparine ALS gene amplification

引物 序列

退火温度 Primer

Sequence（5′-3′）

Annealing temperature (℃)

Ⅰ-F TTGGGAAGAAYAARCARCC 53

Ⅰ-R TTYCCBARGTAKGTATGWGCC Ⅱ-F GGAAGAATAARCARCCTCATG 55 Ⅱ-R YTCCCAYTGAACMACCATAC

Y=C或T；R=A或G；B=C或G或T；K=G或T；W=A或T；M=A或C

Y=C/T; R=A/G; B=C/G/T; K=G/T; W=A/T; M=A/C

1.2.3 反转录（RT） 用TIANGEN公司的RNAsimple Total RNA Kit试剂盒提取猪殃殃叶片的总RNA。cDNA第一链的合成用TIANGEN公司的Quantscript RT Kit来完成。在20 µL的反应体系中包括：3 µL的总RNA，2 µL的10×RT Mix，2 µL的 dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1 each），2 µL的Oligo-dT15（10 µmol·L-1），1 µL的Quant Reverse Transcriptase，

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10 µL的RNase-free水。反转录条件按照试剂盒说明，反转录产物立即作为模板进行PCR扩增。

1.2.4 ALS基因片段的克隆 全部PCR均使用TIANGEN公司的试剂盒Taq DNA Polymerase完成。第一轮PCR的50 µL的反应体系含：37 µL的ddH2O，5 µL的10×Taq Buffer，1 µL的dNTP Mixture（10 mmol·L-1），1.5 µL的PrimerⅠ-F（10 µmol·L-1），1.5 µL的PrimerⅠ-R（10 µmol·L-1），1 µL Taq DNA Polymerase（2.5 U·µL-1），3 µL的反转录产物为模板。第二轮PCR将引物改为PrimerⅡ-F和PrimerⅡ-R，将模板改为2 µL的第一轮PCR产物，其它成分与第一轮PCR的相同。第一轮PCR反应条件设定为：94℃预变性4 min，然后，94℃变性40 s，53℃退火40 s，72℃延伸3 min，共20个循环。最后72℃延伸10 min；第二轮PCR反应条件设定为：94℃预变性4 min，然后，94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸3 min，共30个循环。最后72℃延伸10 min。扩增产物于琼脂糖凝胶中电泳检测。将扩增产物进行回收，连接到pMD18-T载体，然后转到大肠杆菌感受态细胞中，涂布于含有Ampicilin和X-gal/IPTG的LB固体培养基上培养过夜，挑取白色菌落到含Ampicilin的LB培养液中震荡培养，取菌液为模板进行PCR鉴定，得到的阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证。 1.2.5 生物信息学分析 将测序的序列进行BLASTx比对，得到蛋白序列，然后用DNAman软件对扩增出的抗药性和敏感型猪殃殃ALS基因的蛋白序列进行比对。

2 结果

2.1 猪殃殃总RNA检测结果

在常规琼脂糖凝胶电泳中，较好的RNA产物应该可以看到2条明显的优势rRNA条带，分别为28S rRNA、18S rRNA，条带亮度比值约为2:1。图1是猪殃殃总RNA的常规琼脂糖凝胶电泳检测结果，发现RNA略有降解，18S rRNA的亮度高于28S rRNA，但不影响下一步试验。

2.2 猪殃殃ALS基因片段的克隆

以猪殃殃的cDNA为模板，按上述PCR反应条件进行扩增，得到一条大小约为500 bp的基因片段（图2），与预期目的片段520 bp的大小一致。将目的片段进行克隆、测序。

2.3 猪殃殃ALS基因片段的菌落PCR鉴定

将转化后的单克隆菌落于含Ampicilin 的LB液

图1 猪殃殃总RNA电泳检测

Fig. 1 The total RNA of Galium aparine

M：DNA marker D2000；R：抗性猪殃殃；S：敏感猪殃殃

M: DNA marker D2000; R: Resistant Galium aparine biotype; S: Susceptible Galium aparine biotype

图2 抗药性、敏感生物型猪殃殃ALS基因的扩增

Fig. 2 Amplification of ALS fragments from resistant and

susceptible Galium aparine biotype

体培养液中震荡培养，以菌液为模板进行PCR鉴定，2种生物型均扩增出目的片段（图3）。 2.4 猪殃殃ALS基因片段的生物信息学分析

与敏感生物型相比，抗性生物型猪殃殃ALS编码区共有3个氨基酸残基发生突变（表3），即第457位苏氨酸突变为丝氨酸，第573位谷氨酰胺突变为丝氨酸，第574位色氨酸突变为甘氨酸。其中，只有第574位氨基酸的突变位于高度保守区Domain B处，第457位、573位氨基酸突变位于非保守区。

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表3 抗性生物型与敏感生物型猪殃殃ALS基因片段及氨基酸的比较

Table 3 The comparison of mutant parts of ALS gene and amino acid sequences from the resistant and susceptible Galium aparine

biotypes

生物型 Populations S S R R A A S S R R A A

氨基酸的位置和对应碱基及氨基酸序列

The amino acid position, relative sequence of nucleotide and amino acid

450 451 452 453 454 455 456 457 458 459 AAG TAT CCG CTG AGC TTC AAG ACC TTT GGC K Y P L S F K T F G AAG TAT CCG CTG AGC TTC AAG TCC TTT GGC K Y P L S F K S F G AAG TTT CCG TTG AGC TTT AAG ACG TTT GGG K F P L S F K T F G 565 566 567 568 569 570 571 572 573 574 AAC CAG CAC CTT GGT ATG GTT GTT CAG TGG N Q H L G M V V Q W AAC CAG CAC CTT GGT ATG GTT GTT AGT GGG N Q H L G M V V S G AAC CAG CAT CTT GGC ATG GTT ATG CAA TGG N Q H L G M V M Q W

R：抗药性猪殃殃ALS DNA序列及对应氨基酸序列；S：敏感性猪殃殃ALS DNA序列及对应氨基酸序列；A：拟南芥ALS DNA序列及对应氨基酸序列。文中所有氨基酸和基因碱基的编码皆以拟南芥氨基酸和基因碱基编码为标准。加粗字体为突变位点

R: ALS DNA and corresponding amino acid sequence from resistant Galium aparine biotype; S: ALS DNA and corresponding amino acid sequence from susceptible Galium aparine biotype; A: ALS DNA and corresponding amino acid sequence from Abrabidopsis thaliana. The numbers of amino acid and DNA base are based on the numbers of that from Abrabidopsis thaliana. The bold letters indicate the mutant sites

3 讨论

杂草对ALS抑制剂抗性机理主要包括2个方面：一方面是由于ALS基因保守区中某个位点的突变[18]；另一方面是由于ALS基因的过量表达[19-20]。已知对ALS抑制剂产生抗性的机制主要是ALS基因的变 异[21-23]。

基因突变可导致杂草抗药性的产生，在有关抗磺酰脲类除草剂的杂草报道中，ALS基因的4个特殊氨基酸位点中任何一个突变都可以使杂草产生对磺酰脲类除草剂的抗药性。其中Trp574位点的突变能够使杂草对磺酰脲类（SU）和咪唑啉酮类（IMI）抑制剂均产生抗性，进一步研究显示Trp574残基决定着ALS酶

M：DNA marker D2000；R：抗性猪殃殃；S：敏感猪殃殃

M: DNA marker D2000; R: Resistant Galium aparine biotype; S: Susceptible Galium aparine biotype

活性位点通道的形状，而且在SU类和IMI类抑制剂与酶的结合中起着重要作用。因此Trp574残基的突变改变了酶与抑制剂结合位点的形状，从而导致杂草抗药性的发生[2]。

本研究中，仅扩增出ALS基因部分片段，其中只包含能使猪殃殃对苯磺隆产生抗药性的一个突变位点研究证实，这种突变是导致反枝苋（Amaranthus Trp574，

retroflexus）和长芒苋（Amaranthus tuberculatus）对磺

图3 抗性、敏感性生物型猪殃殃ALS基因片段的菌液PCR

鉴定

Fig. 3 Identification of ALS fragments from susceptible and

resistant Galium aparine types by PCR

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酰脲类除草剂产生抗药性的分子基础[24-25]。因此，该突变可能是猪殃殃对苯磺隆产生抗药性的重要原因。而发生在第457位和第573位的氨基酸突变是否也会导致猪殃殃对苯磺隆产生抗药性还需进一步研究。本试验尚未扩增出ALS基因的全长序列，特别是报道最多的第197位氨基酸是否发生变异还不清楚，因此有必要获取ALS基因全长，以便全面了解猪殃殃对苯磺隆的抗性机制。

4 结论

通过PCR技术，克隆出麦田恶性杂草猪殃殃ALS基因的部分片段，该片段共有3处位点发生了突变，其中Trp574的突变有可能是导致猪殃殃产生抗药性的重要原因之一。

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（责任编辑 李 莉）

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/8584.html