生化实验方法

实验一 准备实验（一）

分光光度计的使用

一. 目的

通过电化教学方式学习分光光度计的工作原理 掌握比色测定的基本操作方法

二. 原理

光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在400～750nm：小于400nm的光线称为紫外光；大于750nm的光线称为红外光。

当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部分被吸收，一部分透过、因此光线射出溶液之后，部分光波减少，这种光波的吸收和透过可用于某些物质的定性定量分析。

LI0CI分光光度法依据Lambert-Beer定律：lg令A = lgI0II0I = KCL

，T =

II0，则A = KCL，A = -lgT

A：吸光度（有时用光密度OD表示） I0：入射光强度 L：溶液的光径长度

其中：T：透光率 I： 透射光强度 K：吸收系数 C：溶液的浓度

从上式可以看出，一束单色光通过溶液后，光波被吸收一部分，其吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比，当入射光、吸收系数K和溶液的光径长度L不变时，吸光度A与溶液的浓度C成正比。

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三. 实验材料及设备

1. 仪器

分光光度计 放相机 电视机 2. 器材

普通试管： 20mL×3 移 液 管： 5mL×2 烧 杯： 250mL×1 洗 耳 球： 2

洗瓶、试管架、移液管架：各1

四. 试剂的配制

重铬酸钾（K2Cr2O7）溶液（0.2mg/mL）

称取0.2g K2Cr2O7，蒸馏水溶解后定容至1000mL。

五. 操作步骤

1. 在电教室中看录像

了解721型分光光度计的工作原理。 2. 在分光光度室中练习操作 详细步骤见附录六。 3. 在实验室中应用练习

取3支试管，按下表所示顺序操作。

管号 空白 样品 操作 0 Ⅰ Ⅱ 重铬酸钾溶液(mL) 5.0 5.0 蒸馏水(mL) 5.0 比色 以0号管为空白参比，测定?=450nm处的吸光度 记录吸光度（A450）

六. 结果处理

1. 求两个样品管A450的平均值A—

450；

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2. 计算重铬酸钾的摩尔消光系数。

七. 思考题

1. 到分光光度室中进行比色测定应携带哪些器材？它们分别起什么作用？ 2. 比色时，设一个“0”号管的意义是什么？

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实验二 3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量

一. 目的

了解3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的原理 掌握总糖定量测定的操作方法

二. 原理

还原糖是指含自由醛基或酮基的单糖（如葡萄糖）和某些具有还原性的双糖（如麦芽糖）。它们在碱性条件下，可变成非常活泼的烯二醇。遇氧化剂时，具有还原能力，烯二醇本身则被氧化成糖酸及其他产物。

HCOHCOHOCOHHCOHHCOH( )nH2COH还原糖（碱）HCOH( )nH2COH烯二醇（碱）加热COOHOH糖酸COOHOHO2NNO2O2NNH23,5-二硝基水杨酸（黄色）3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色）黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比，在波长为540nm处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中还原糖的含量。

对于非还原性的双糖（如蔗糖）以及还原性很小的多糖（如淀粉），应先用酸水解法将它们彻底水解成单糖。再借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量。由于多糖水解时，在每个单糖残基上加了一分子水，因而在计算时，须扣除加入的水量，当样品里多糖含量远大于单糖含量时，则比色测定所得总糖含量应乘以折算系数（1-

18180=

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0.9），即得比较接近实际的样品中总糖含量。

三. 实验材料及设备

1. 材料 面粉 2. 仪器

分光光度计 电子天平 沸水浴 3. 器材

刻度试管： 25mL×8 容 量 瓶： 100mL×2 锥 形 瓶： 100mL×1

移 液 管： 1mL×2 2mL×2 10mL×2 烧 杯： 250mL×1 50mL×1 滴 管： 2 洗 耳 球： 2 滤 纸： ?11cm 坐 标 纸

漏斗、洗瓶、白瓷板、试管架、移液管架、试管夹、玻棒：各1

四. 试剂的配制

1. 葡萄糖标准液（1mg/mL）

预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 2. 3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）

将5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于200mL 2N NaOH溶液中（不适宜用高温促溶），接着加入500mL含130g酒石酸钾钠的溶液，混匀。再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至1000mL。暗处保存备用。 3. 碘液

称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL水中。 4. 酚酞指示剂

称取0.1g酚酞，溶于250mL 70%（V/V）的乙醇中。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/84k2.html