黄酮提取工艺设计思路

黄酮提取工艺设计思路

1、黄酮类化合物含量测定的原理

在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在条件下，黄酮类化合物与铝盐生成螯合物，加入氢氧

化钠溶液后显红橙色。黄酮类化合物能与金属离子络合产生有色反应，于波长510nm附近有吸收，可用分光光度法进行测定。实验采用在碱性条件下，亚硝酸盐存在时，硝酸铝与黄

酮形成红色络合物，在波长510nm附近有吸收可进行比色分析。

在中性或弱碱性及硝酸钠存在条件下，黄酮类化合物与铝盐生成鳌合物，加入氢氧化

钠溶液后显红橙色，硝酸钠还原黄酮，加硝酸铝络合，加氢氧化钠使黄酮类化合物开环，

生成2’-OH查耳酮而显色。

利用黄酮类化合物中的3－羟基、4－羟基、5－羟基、4－羰基或邻二位酚羟基，与Al3＋进行络合反应，在碱性条件下生成红色络合物的原理测定其含量

2、测定波长的确定

取样品溶液和标准溶液2mL，加70 %的乙醇至5 mL, 然后加入5 %的NaNO2 溶液1 mL, 室温放置6min, 再加入10 %的Al(NO3)3 1mL, 混匀, 室温放置6 min, 加入4%的NaOH 10mL, 用水稀释至25 mL,混匀, 放置15 min, 在分光光度计上扫描波长从400 nm～600 nm 之间的吸收度, 结果在510nm 波长处有最大吸收值。

配合物在Kmax1= 354nm 及Kmax2= 510nm有两个吸收峰, 经实验后得出Kmax1= 354nm波长处得到的工作曲线线性关系及精密度数据均不佳, 故本实验选取Kmax2= 510 nm为测定波长。

3、标准溶液的配制

精确称取105℃干燥恒重芦丁对照品50mg, 加乙醇适量, 使之充分溶解, 用乙醇定容

到100mL, 摇匀, 制得芦丁溶液。精确量取芦丁溶液20mL, 置于50mL容量瓶中, 用水稀释至刻度, 摇匀, 即得对照品溶液。每1mL溶液含芦丁对照品0.2mg。或精密称取干燥至恒重的

芦丁标准品10mg, 置50mL容量瓶中, 加无水乙醇20mL, 轻摇使充分溶解,定容, 摇匀, 得0. 2mg /mL芦丁标准液。

精确称取芦丁标准品5mg，用70%乙醇溶解，于50 mL容量瓶中定容，即得每1mL溶液含

芦丁对照品0.1mg芦丁标准品溶液。

称取约20mg芦丁标准品于称量瓶中置105℃烘箱下烘干至恒重,干燥器中冷却，精确称

取10 mg芦丁标准品，用70%乙醇定容至100 ml为标准液。

4、样品溶液的测定方法

4.1、标准曲线的绘制

精确量取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL, 分别置于25mL容量瓶中。分别加水至6mL, 加5%亚硝酸钠溶液1.0mL, 混匀, 放置6min; 加10%硝酸铝溶液1.0mL, 摇匀, 放置6min; 加1% 氢氧化钠溶液10.0mL, 再加水至刻度, 摇匀, 放置15min。用分光光度法在510nm波长处分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标, 浓度为横坐标, 用最小二乘法对直线进行回归计算，令回归方程为：y=ax+b，绘制标准曲线, 得回归线方程: Y = 11. 321 43X + 0. 00343( r= 0.9998), 在8~40μg/mL的范围内，浓度与吸收度有良好的线性关系。分别取0. 0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 mL的0. 1mg/mL芦丁标准溶液于6支比色管中，分别加入0. 3 mL 5%亚硝酸钠，放置6 min，加0. 3 mL 10%硝酸铝后放置6 min,，再加1. 0mol/L NaOH 4.0mL，加70%乙醇定容至10 mL，摇匀，放置12min得测定液。以空白溶液作参比,在λ= 510nm处测吸光度,计算标准液浓度(C)与吸光度(D)的回归方程D = bC + k。

精确吸取芦丁标准液0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 ml分别置于6支具塞试管中，各补70%乙醇至5. 0ml，加5%亚硝酸钠溶液0. 3 ml,，摇匀，放置6 min后，加10%硝酸铝溶液0. 3ml,摇匀，放置6 min后，再加4%氢氧化钠溶液4. 0ml，加水0. 4ml，摇匀，放置15 min 后，在510 nm处测吸光度-浓度值，所得吸光度-浓度曲线见图，回归方程如下: A =12. 721 0C - 0. 02903，相关系数r = 0. 9998。

4.2、样品处理

取采回的新鲜芦蒿叶，洗净，参考相关文献，在105℃烘至约八成干,剪成约1 cm长度，用粉碎机粉碎，再在105℃烘至恒重。采用Soxhlet提取法，以无水乙醚为脱脂剂,于43℃水浴中脱脂至充分除去样品中脂类和脂溶性色素。取出样品滤纸包，先置通风处晾干，再将滤纸包置烘箱中130 ℃烘干，放入干燥器中冷却备用。

4.3、样品处理方法

湿热法：将鲜叶置于高压反应釜加压蒸30min，另取鲜叶常压蒸30min。将阴干叶置于高压反应釜加压蒸15min，另取阴干叶常压蒸15min。

氧化法：（1）H2O2法：将鲜叶、阴干叶分别用用2倍量H2O2浸泡10min（H2O2浓度1%、温度50℃）、10min（2%、40℃）、30min（0.5%、30℃）、30min（2%、50℃）、60min（0.5%、40℃）、60min（1%、30℃）。（2）KMnO4法：将鲜叶、阴干叶分别用用2倍量KMnO4浸泡10min （KMnO4浓度1%、温度50℃）、10min（2%、40℃）、30min（0.5%、

30℃）、30min（2%、50℃）、60min（0.5%、40℃）、60min（1%、30℃）。

4.3、样品溶液的测定

4.3.1、分光光度法

精确量取样品溶液5. 0 mL, 置于25 mL容量瓶中, 按照2.1中方法进行操作, 在510nm 波长处测定吸光度A1; 再精确量取样品溶液5.0mL, 置于25mL容量瓶中, 加水至刻度, 摇匀, 在510nm 波长处测定吸光度A2。取2次吸光度的差值, 由回归线方程计算样品中黄酮类化合物的提取率。

4.3.2、HPLC 法

取上述样品总黄酮提取液浓缩物，用甲醇溶解，进样前用0.45 μm 滤膜过滤。高效液相色谱仪：LC- 9A(日本SHMADZU) ；色谱柱：Dima Technologies(C18 迪马公司)，规格：250 mm×4.6 mm；柱温为室温；流速1 mL/min；检测器：SPD-10A；检测波长254 nm；进样量20 μL；流动相：80%甲醇。在进柱之前，流动相要经过0.45μm 的有机膜过滤，并超声脱气30 min。

5、溶剂选择

分别称取样品1g，以提取温度90℃，提取时间2 h ，分别利用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚为溶剂，料液比1:50(g/mL)为提取条件进行常压回流提取，以此结果进行比较。

6、线性范围、回归方程和检出限

总黄酮的线性范围在1.0～40μg/ml 之间，所得回归方程为y=0.0033x－0.0109，相关系数为0.9995，检出限为1.0μg/ml。

7、显色剂稳定性实验

精确量取标准溶液和样品提取液1.0mL, 同标准曲线和样品测定的操作，分别于配制后每隔5min测定其吸光度考察反应体系的稳定性。结果显示其RSD值为0. 5097% , 说明样品溶液在1h内稳定。

8、加标回收率实验

取已测得黄酮类化合物提取率的样品溶液2.0mL, 加入0.2mg/mL的芦丁对照液1. 0mL, 按实验方法测定, 计算回收率。加样回收率为99. 12%, RSD 值为2. 135%。表明, 该方法对黄花菜中黄酮类化合物提取率测量的准确度较高。回收率= (混合后测得的总黄酮含量-样品中总黄酮含量)/芦丁标准品加入量×100%。

分别取0.2g含总黄酮的样品于两支15ml具塞比色管中，各加入4ml乙醇，其中1管加入

0.100mg芦丁标准品作为加标测定管，另1管作为本底管，再按最佳试验条件进行样品处理，用标准曲线法进行计算，重复试验3次，计算回收率。由表8可知，该方法的回收率为95%~104%，证明该方法的准确度较好。

取5个10mL比色管，在已知黄酮含量的蓖麻叶和蓖麻花提取液中分别加入0.2mg/mL芦丁对照品溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL样液，分别测定黄酮含量，根据所得的总黄酮含量减去加入的标量，再除以样品所含的总黄酮量即可计算出回收率。

回收率%= 样品加标准样测得总黄酮含量?样品中总黄酮含量/加入标准液总芦丁的含

量×100%

9、精密度实验

取5份同一样品溶液各5.0mL, 置于25mL容量瓶中, 按实验方法测定，计算其平均含量和相对标准偏差。其RSD 值平均为0.162%, 测定结果的相对标准偏差很小, 说明仪器的精密度较高, 实验数据可靠。

在正交试验得出的最佳条件下，样品用超声波提取后测定总黄酮提取量，重复试验5 次，计算保健食品总黄酮提取量为（5.370±0.092）mg，RSD 为1.717%，证明该方法的精密度较好。

按微波提取法同时制备5份试样液，按标准曲线方法对试样液中总黄酮含量进行平行测定。

精密称取车前草供试品3份，每份测试3次,结果见表2，相对标准偏差为3. 20 %(m =3)。

精密移取芦丁标准液1mL，共5 份，分别置于10mL试管中，按1.3.3.2 节操作，计算吸光度的相对标准偏差(RSD)。

10、重现性试验。

取同一批大白口蘑样品6份，在最佳条件下进行萃取，分别测定各自的总黄酮含量，结果表明，其相对标准偏差为1.24%。

在同一实验室、不同时间对样品叶中总黄酮含量进行5次重复测定。

11、金属离子的干扰实验

银杏叶提取物作为生物活性物质, 许多金属离子对它的测定都有一定影响。本实验选取常见的Zn2+ 、Fe3+ 进行实验。实验表明Zn2+ 对反应无影响, 加入1 mL 100Lg?m L Fe3+ 溶液, 扫描发现在波长510 nm 无吸收峰, 由此可知Fe3+ 对实验测定影响很大。本实验选择EDTA做掩蔽剂。

12、黄酮类化合物的定性检测

12.1、三氯化铝反应

取8支试管，分别加入少许经上述各提取方法所得的样品，用95%乙醇完全溶解，每只试管中再加1%三氯化铝乙醇溶液1～2 mL，观察颜色变化情况。在三氯化铝反应中，原来的黄色加深，并有黄色或黄绿色荧光，原因是与铝离子产生了螯合物而呈现出鲜黄色。滤纸上无明显颜色变化，紫外灯下显鲜黄色荧光，可能不含4’-羟基黄酮醇和7，4’-二羟基黄酮醇等黄酮类化合物。黄色或黄绿色：有黄酮类化合物。

12.2、盐酸-镁粉还原反应

将经上述各提取方法所得的样品分别溶于盛有95%乙醇的试管中，待完全溶解后加少许镁粉，再加数滴浓盐酸,观察颜色变化情况。在盐酸- 镁粉还原反应中,溶液呈现出橙黄色或紫红色,这是由于黄酮类化合物被还原生成花色苷元及其二聚物。试液呈现红色，可能含黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇等黄酮类化合物。

取样品液5mL，加入少许镁粉振摇，滴加数滴浓盐酸，微热2min。并作空白对照实验（在样品液中仅加入浓盐酸进行观察）。可观察到在用粗提取液进行预试时，加入浓盐酸后升起的泡沫颜色呈紫红色，溶液显橙红色，表明样品液中有黄酮类物质存在。橙红色：黄酮类化合物。

取自制的黄酮样品少许置于试管中，加5%vol的乙醇2mL，在水浴中加热溶解，滴加2滴浓HC1，再加镁粉约50mg，即产生剧烈的反应。反应过程中溶液颜色逐渐由黄色变为橙红色。此现象表明被测物为黄酮类物质。

12.3、四氢硼钠反应

取8支试管，分别加入少许经上述各种方法提取所得到的样品，用95%乙醇完全溶解后加数滴四氢硼钠，观察颜色变化情况。在四氢硼钠反应中，溶液由浅黄色变为红色或紫红

色

，此反应是二氢黄酮类化合物的专属反应。

12.4、与碱反应

试液变黄色，可能含二氢黄酮、黄酮醇等黄酮类化合物。棕黄色，空气氧化变褐色：有黄酮醇类或查耳酮。4%氢氧化钠反应，棕色，有黄酮类化合物。

12.5、铝盐反应

取样品提取液5 mL，加入0.3mL 5% NaNO2，充分混匀，混匀后静置5min，加入0.3mL 10% Al(NO3)3，混匀后静置6min，加入2mL1 mol/L NaOH，混匀，静止10min。可观察到有砖红色的颜色产生，表明提取液中有黄酮类物质。黄色：有黄酮类化合物。

12.6、浓氨水反应

提取物乙醇溶液点在滤纸上,置于浓氨水上方30 s, 紫外灯下观察, 显黄色荧光斑点。棕黄色，有黄酮类化合物。

12.7、1%三氯化铁反应

蓝色：黄酮类化合物。

12.8、1%醋酸铅反应

黄色沉淀：黄酮类化合物。

12.9、浓硫酸反应

橙色：黄酮类化合物。

12.10、熔点测定

取提取的莲子心黄酮样品，经多次重结晶提纯，测其熔点230℃~230.5℃。

12.11、红外光谱图的比较

取精制的黄酮样品和黄酮（芦丁）对照品，溴化钾压片法绘制红外光谱图。测试条件：扫描范围4000cm-1~400cm-1；分辨率4cm-1，扫描次数32

13、总黄酮提取量即得率和提取率计算

13.1、总黄酮提取量即得率计算

Y＝C×V1×（V2/V3）/m

式中，Y 为黄酮含量（mg/g），C为测定液黄酮浓度（mg/mL），V1为测量时定容

的体积（mL），V2为提取液体积（mL），V3为测量时取液体积（mL），m 为提取时原料质量（g）。

总黄酮得率X（%）＝n×C×V/m×100%

式中：n为提取液稀释倍数；C为提取液中总黄酮浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；

m为果渣的重量，mg；X总黄酮得率。

P =C ×V ×n/W ×V1 ×103 ×100

式中:P—总黄酮类物质含量, g/100 g;C—从回归方程计算得样品中黄酮类物质质量, mg;n—稀释倍数;V —浓缩液的体积, mL;V1 —测定体积, mL;W—投料量, g。

13.2、总黄酮提取率计算

提取率= [提取的总黄酮质量/原料质量×原料中总黄酮含量] ×100%

14、单因素试验

14.1、乙醇体积分数的影响

取样品1g 左右，分别加入0%、10%、20%、30%、40%、50%60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液，在100℃条件下快速萃取法提取5min，测定提取液黄酮含量，并计算得率。14.2、不同提取温度

取样品1g，乙醇体积分数60%，分别20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃于用快速萃取法提取5min，测定提取液黄酮含量，并计算得率。

14.3、不同提取时间

取样品1g，乙醇体积分数60%，在100℃分别快速萃取30min、60min、90min、120min、150min、180min，测定提取液黄酮含量，并计算得率。

14.4、不同粒度

取样品1g，乙醇体积分数60%，分别于20目、40目、60目、80目、100目、120目用快速萃取法提取5min，测定提取液黄酮含量，并计算得率。

14.5、提取次数

取样品1g，乙醇体积分数60%，在100℃快速萃取1 0mi n ，分别萃取1 、2 、3 、4 、5次，测定提取液黄酮含量，并计算得率。

14.6、料液比

取样品1g，乙醇体积分数60%，分别于1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80用快速萃取法提取5min，测定提取液黄酮含量，并计算得率。

15、超声波提取总黄酮

15.1、乙醇溶液浓度对总黄酮提取的影响

15.2、超声温度对总黄酮提取的影响

15.3、超声时间对总黄酮提取的影响

15.4、料液比对总黄酮提取的影响

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/818l.html