Western blot基本操作步骤
更新时间:2023-11-27 01:28:01 阅读量: 教育文库 文档下载
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Western blot基本操作步骤
一、细胞蛋白的提取
弃去培养基,加入预冷的PBS洗一遍,加入的RIPA裂解液(含1mM PMSF(100×),每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片,六孔板每孔150-250μl,60mm×15mm培养皿300-400μl,),于冰上裂解约5分钟,裂解总液12000rpm离心10 min。取上清,用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer,10×reducing,再用裂解液补齐到所需上样体积。离心,使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min,变性,之后再离心后准备上样。
二、BCA法测蛋白浓度操作步骤
将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准(BSA),配制成5mg/ml的蛋白标准溶液,10μl 分装,-20℃冷冻保存。
完全溶解蛋白标准品,取10μl用PBS稀释至100μl,使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中,加稀释标准品的溶液补足到20μl。
加适当体积样品到96孔板的样品孔中(可以通过预实验摸索稀释倍数),加PBS到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液,37℃放置30分钟。
测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。
三、Western blot基本操作步骤
1、溶液配制: ①Runnig Buffer(1×):SDS Runnig Buffer(20×)50mL,加MiliQ水至1L; ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL(20%,v/v),加MiliQ水至1L; ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl(pH7.6): 60.5g Tris-base,加入约30ml浓盐酸,调PH至7.6,加MiliQ水至500ml。
TBS缓冲液(10×):1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液(1×):TBS缓冲液(10×)100ml+0.5ml Tween-20(0.05%,v/v),加MiliQ水至1L。
④封闭液:5% BSA(5g/100ml,称取1g BSA至20ml TBST,充分混匀溶解)
2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合,并将此 EP 管放在水浴锅中沸水煮 5min,使蛋白质变性。
②将预制胶固定到电泳装置中,并在装置中加满Runnig Buffer(1×),内槽加入0.5mL抗氧化剂,小心拔下梳子;
③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品(总蛋白量20μg以上)。向marker孔中加入2.5μl marker(按照实验要求设定marker量),向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同(或相近)的上样体积,以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。
3、电泳
将电泳装置与电源连接。调节电压为100-200V,电泳50min,直至溴酚兰接近分离胶的底部,然后关闭电源并撤去连接的导线。
拆除电泳装置:先倒掉电泳缓冲液,连同槽一起将凝胶夹层取出,小心的撬起凝胶外层塑料板,使凝胶暴露出来,切去浓缩胶以及无蛋白样品的凝胶部分(将胶留在短的一面塑料板上)。
4、转膜(湿转) ①将转膜液(1× Transfer Buffer)放于大饭盒内,泡4片海绵,剪4片滤纸、1片PVDF膜,PVDF膜于甲醇中活化30s,取出置于转膜液中;
②按照2层海绵+2层滤纸+胶+膜+2层滤纸+5层海绵(填满)的顺序组装转膜装置,注意组装此装置时一定要保证滤纸、膜、凝胶精确对齐并不留气泡;
③将组装好的装置放入电转槽,合上盖子,电转槽置于冰浴,接通电源,调节电压为15V,时间为16~18h(或恒流300mA, 3h)。显示红灯亮后,按下Start后,开始转膜。 转膜方向为蛋白从负极(黑色)转向正极(红色)。
5、免疫印迹反应及化学发光检测
转膜完毕后,根据目的蛋白分子量将膜剪成不同的条带,用封闭液(5% BSA)室温封闭 2h。弃封闭液,加入用新的封闭液稀释的一抗(可回收),室温2h或4℃过夜。用 TBST清洗 3 次,10min/次。
二抗(可回收)室温孵育1小时,室温 1xTBST 洗涤 3次,每次约10 min。
此步开始避光操作:将膜浸入化学发光底物工作液(A液:B液=1:1,终体积0.5-1ml即可)中,显色2分钟,放入BIO-RAD凝胶成像系统中显影。
内参分子量:β-actin:42 kDa GAPDH:36 kDa Tubulin: 51kDa
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