RT-PCR实验标准操作规程

一、实验名称：RT-PCR实验

二、实验目的：对提取的完整RNA进行体外转录，并应用PCR手段进行大量扩增，说明某种基因在体内的表达情况。

三、背景知识：RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。

四、基本原理：RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。 五、药品试剂：

琼脂糖 国产；Ex Taq酶 TaKaRa公司；M-MLV逆转录酶 Amersham公司； Oligo(dT)18、dNTP 上海博亚公司; 引物 上海生工；DNA分子量标准 TaKaRa公司； Tris，EDTA，冰乙酸等

六、仪器设备与材料：

⑴电泳仪 北京六一仪器厂 型号DYY-12 ；⑵电子天平 Sartrius公司 型号 BS1103 ；⑶PCR仪 基因公司 型号PE 9600；⑷制冰机 上海安亭科学仪器厂 型号LQP-B-4；⑸纯水系统 Millipore公司型号 Biocel；⑹核酸蛋白分析仪 贝克曼公司型号 DU650；⑺台式高速冷冻离心机 贝克曼公司 型号 64R ；⑻凝胶成像系统 美国伯乐公司 型号 GEL DOC 2000 七、实验对象：经抽提得到的完整RNA 八、实验环境：室温15-28℃。

九、操作步骤： 1.50×TAE缓冲液：称取 Tris 242.2 g，先用300 ml水加热搅拌溶解后，加100 ml( 500 mmol/L) EDTA的水溶液（pH 8.0），用冰乙酸调pH至8.0，然后用水定容到1000ml。

2.反转录反应：M-MLV逆转录酶l ul、5×RT缓冲液5 ul 、Oligo(dT)18 (20 umol／L)2 ul、dNTP(20 umol／L)2 ul、RNA 2 ug、补去离子水至20 ul体积，42℃ 1 h逆转录反应，95℃ 5 min灭活M-MLV。

3.PCR反应：在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂, 用手指轻弹混匀，再

加约50 ul石蜡油（有热盖设备的PCR仪可以不加石蜡油）。每个试样3次重复。在台式离心机离心10s后，将PCR管插入PCR仪中。95℃变性5 min；进行35次循环扩增反应（94℃,1 min；退火温度视引物而定（50－60℃）, 1 min；72℃, 1 min ）；然后72℃恒温7 min，取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或在4℃下保存。

表1 PCR反应体系

试剂 ddH2O 10×PCR 缓冲液 25 mM MgCl2 10 mM dNTPs

终浓度 1× 2.5 mM 0.2 mM 单样品体积 31.25 ul 5 μl 5 μl 1 μl

10 μM Primer 1 10 μM Primer 2 5 U/μl Taq 酶 100 ng/μl DNA 模板 总体积 0.5 μM 0.5 μM 0.025 U/μl 5 ng/μl 2.5 μl 2.5 ul 0.25 μl 2.5 μl 50 μl 4.PCR产物的电泳检测：将适量的琼脂糖加入1×TAE缓冲液中，加热将其溶解，配制成琼脂糖浓度为2%（w/v）的溶液，然后按每100 mL琼脂糖溶液中加入5 μL溴化乙锭溶液的比例，加入溴化乙锭溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，轻轻垂直向上拔去梳板。在每个泳道中加入适量的PCR产物（需和上样缓冲液混合，10 μL-20μL），其中一个泳道中加入DNA分子量标准，接通电源进行电泳，按2 V/cm 的电压电泳15-30 min。

5.凝胶成像分析（照相）：电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，轻轻地置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小， 将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。 十、结果及评价：

DNA片段的扩增是否成功。检测DNA片段的扩增情况，可以通过在紫外线下 直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。

十一、注意事项：

PCR实验很容易出现假阳性或假阴性的结果。出现假阴性结果的常见原因有：Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统的建立欠妥当；循环次数不够；等等。当实验中出现假阴性的情况时，应首先在原来扩增的产物中再加入Taq DNA聚合酶，并增加5～10次循环。为了防止假阴性结果的出现，在选用Taq DNA聚合酶时，要注意用活力高、质量好的酶。同时，在提取DNA模板时，应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物，如酚、氯仿等的存在。尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度的要求不高，但也不允许有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件以及特异性的高低，很大程度上取决于引物与靶DNA的互补情况，尤其需要保证引物的3′ 端与靶基因互补。

PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增，因此模板DNA的污染是PCR假阳性结果的主要原因。此外，样品中存在靶基因的同源序列也可能造成假阳性结果。为了避免因污染而造成的假阳性结果，PCR操作时要注意做到：隔离操作区，分装试剂，简化操作程序，使用一次性吸头等。

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