实验四 酸性磷酸酶Km及Vmax值测定

酸性磷酸酶Km及Vmax值测定 酸性磷酸酶Km及Vmax值测定 Km 清洗试管24支 清洗试管24支 24

一、概述 酸性磷酸酶： 酸性磷酸酶：催化磷酸单酯的水解反应 存在于人的肝脏， 存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。

是生物体中重要的一种酶类， 是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测 指标。 指标。

二、实验原理酶液 磷酸苯二钠 苯酚 + 磷酸氢二钠

folin-酚测定酚的浓度 酚测定酚的浓度计算出反应速度(用产物生成量/min来表示) 计算出反应速度(用产物生成量 来表示) 来表示

根据双倒数法计算出Km及Vmax 及 根据双倒数法计算出

V=

Vmax [S] Km + [S]

三、实验步骤： 实验步骤：

1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 3、制作酚标准曲线 [S]与 4、[S]与V0关系实验 双倒数作图法计算Vmax Vmax和 5、双倒数作图法计算Vmax和Km

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buffer substrate enzyme Color developed Certain Time Stop the reaction

生化实验课老师：于晓虹 实验报告请交到讲台上来 酶液稀释 取上清液300微升，稀释 30倍，用大试管装 科代表

李博恒

1、磷酸酶原液的制备： 磷酸酶原液的制备：称取5g绿豆芽茎(去头去根),加入pH5.6 ),加入pH5.6的 称取5g绿豆芽茎(去头去根),加入pH5.6的 5g绿豆芽茎 HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟 纱布过滤， 缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。 HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。纱布过滤， 1.8ml滤液 滤液, 6000rpm,离心20min 取上清。 20min, 取1.8ml滤液,以6000rpm,离心20min,取上清。 上清液用pH 5.6的HAC缓冲液稀释30倍 缓冲液稀释30 上清液用pH 5.6的HAC缓冲液稀释30倍，用于实 验。

2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 制作酶反应时间 反应时间与产物生成量的关系曲线 (目的：选取合适的反应时间) 目的：选取合适的反应时间)

加 液 程 序 表管号 磷酸苯二钠 酶液 1 0.5 0.5 2 0.5 0.5 3 0.5 0.5 4 0.5 0.5 5 0.5 0.5 6 0.5 0.5 0 0.5

精确反应时间 3碳酸钠溶液 酶液 2 -

52 - 0.5

102 - 0.5

152 - 0.5

202 - 0.5

252 - 0.5 2 0.5 0.5

Folin- Folin-酚溶液 0.5 35℃保温10分钟 ℃保温 分钟

Folin-酚溶液已稀释好！ Folin-酚溶液已稀释好！

进行酶促反应时，注意预热， 注： 进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始

结果： 结果：

0 反应时间 吸光度 0

1 3

2 5

3 10

4 15

5 20

6 25

以反应时间为横坐标， 为纵坐标， 以反应时间为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制反 为纵坐标 应进程曲线， 应进程曲线，并从

该曲线上求出酸性磷酸酶反应初 速率的时间范围。 速率的时间范围。

3、制作酚标准曲线 (目的：可从酚标准曲线上查出A680nm所相 目的：可从酚标准曲线上查出A nm所相 当的酚含量,并计算出反应速度( 当的酚含量,并计算出反应速度(用每分钟 产物生成量来表示) 产物生成量来表示)

加液程序表

0 0.4mM phenol standard solution H2 O 1M Na2CO3 Folin-phenol reagent 0 1 2

1 0.1 0.9 2

2 0.2 0.8 2 0.5

3 0.3 0.7 2 0.5

4 0.4 0.6 2 0.5

5 0.5 0.5 2 0.5

6 0.6 0.4 2 0.5

7 0.7 0.3 2 0.5

8 0.8 0.2 2 0.5

0.5 0.5

35℃保温10分钟 ℃保温 分钟

号管作空白， 以0号管作空白，在可见光分光光度计 号管作空白 在可见光分光光度计680 nm波长处读取各管的吸光度 波长处读取各管的吸光度 (A680nm)。 )。

结果： 结果： 0 酚含量/µmol 酚含量 吸光度 0 1 0.04 2 0.08 3 0.12 4 0.16 5 6 7 0.28 8 0.32

0.20 0.24

以酚含量( 为纵坐标， 以酚含量(µmol)为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制标准曲线 )为横坐标， 为纵坐标 绘制标准曲线。

4、[S]与V0关系实验 [S]与

实 验 加 液 程 序 表管号 磷酸苯二钠 醋酸缓冲液 酶液 1 0.10 0.40 0.50 2 0.15 0.35 0.50 3 0.20 0.30 0.50 4 0.25 0.25 0.50 5 0.30 0.20 0.50 6 0.50 0.50 0 0.50 -

35度 精 确 反 应 15 分 钟 35度碳酸钠溶液 Folin- Folin-酚溶液 酶液 2 0.5 - 2 0.5 - 2 0.5 - 2 0.5 - 2 0.5 - 2 0.5 - 2 0.5 0.5

35℃保温10分钟 35℃保温10分钟 保温10 680nm处吸光度 测680nm处吸光度 进行酶促反应时，注意预热， 注： 进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始

实验中需注意事项： 实验中需注意事项：

酶反应作用时间精确控制

实验结果

Tube number [S] (mM) 1/[S] A680 phenol content(酚含量) V0 (µmole phenol per min) 1/ V0

1 0.5

2 0.75

3 1

4 1.25

5 1.5

6 2.5

1、酚含量从酚标准曲线上查得

反应初速率(μmol/min)为酚含量除以酶反应时间(15分钟 分钟)。 2、V0 反应初速率(μmol/min)为酚含量除以酶反应时间(15分钟)。 双倒数作图法计算Vmax Vmax和 3、双倒数作图法计算Vmax和Km

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