PLGAOCMC载药纳米粒子的体外释药行为研究

基金项目:国家自然科学基金(50373033)

作者简介:胡云霞,女,25岁,硕士研究生,从事载药及基因纳米微粒的研究。

联系人3:e-mail :jinchang @4d0b6907daef5ef7bb0d3c89 　T el :022-********,Fax :022-********研究简报

P LG A /O -C MC 载药纳米粒子的体外释药行为研究

胡云霞a ,常津

a 3,郭毅a ,康春生a ,原续波a ,宋存先

b (a 天津大学材料科学与工程学院纳米生物技术研究所,天津　300072;　b 中国医学科学院生物医学工程研究所,天津　300192)

摘要:本文以聚乳酸-乙醇酸共聚物(P LG A )和自行制备的O -羧甲基壳聚糖(O -C MC )为原料,以

5-氟尿嘧啶(5-FU )为抗癌药物模型,采用自身设计的改良复乳法制备了载药纳米微粒。微粒平均

粒径为9815nm ,粒径分布指数为01192,粒子表面ξ电位为61148eV ,载药率高达1819%,包封率为

86%。然后用SE M 动态监测载药纳米粒子降解过程中表面形貌的变化,并连续追踪粒子降解过程

中的质量损失和降解介质的pH 变化。载药纳米粒子在P BS 中的释药行为研究表明:(1)前12h 的

释药动力学符合Huguchi 方程,具有一级释放特性;(2)在20天内的释药动力学符合零级释放特性。

关键词:O -羧甲基壳聚糖;聚乳酸-乙醇酸共聚物;纳米微粒;抗癌药物

引言

具有良好生物相容性的可降解P LG A 纳米微粒用于制备生物降解型缓释或定向给药体系已经研究了近30年,是国内外研究的热点。根据药物的性质、给药途径和释药时间,选用不同的P LG A ,采用相应的制备工艺;通过调整P LG A 的组成、分子量、载药量及粒径的大小等因素,来控制药物达到不同的释放模型;还可以通过P LG A 优选药物的输送系统,从而获得药物的新剂型。在此基础上,本实验利用P LG A 和O -C MC 来构建5-FU 的纳米缓释载体系统,设计5-FU 的新剂型;研究P LG A 载药纳米微粒的释放行为及释放过程中纳米微粒的降解情况,进而研究纳米微粒释药机理。1　结果与讨论

111　载药纳米粒子的表征

采用改良复乳法制得的包载5-FU 纳米微粒具有光滑的表面形貌和相对均一的粒径分布(见图1、2),其平均粒径为9815nm ,粒径分布指数为01192(见图3),并具有较高的载药率1819%,包封率为86%。微粒有明显的核-壳结构存在,微粒表面有高聚物包裹,粒子表面ξ电位为61148eV (见图4)。这可以说明利用O -羧甲基壳聚糖作为乳化剂和表面修饰剂,对微粒表面起到很好的修饰作用,使得纳米粒子表面有较强的正电荷,说明微粒表面有较多的氨基基团。这便于在载药纳米粒子表面接上靶向制剂,实现药物的靶向治疗。

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月

112　载药纳米粒子的体外降解

11211　载药纳米微粒降解过程中SE M 的动态监测　由图5可以看出载药纳米粒子经过7天的释放和降解,表面已经变形,失去球形表面并且有褶皱,粒子发生溶胀并部分坍塌,这可能是因为纳米粒子的基体材料P LG A 和O -C MC 发生溶胀,而使粒子体积膨胀,同时随着纳米粒子内药物的不断释放,致使粒子失去一部分质量而造成内部塌陷。图5b 中有发生溶胀后的大球,表面有很多小粒子,可能是释放出的5-FU 经过冻干制样后的晶体。图5c 可以清晰看出虽经一段时间的释药,粒子的核壳结构仍然保持,而且内部仍有5-FU 晶体粒子。经过20天释放降解后,粒子已经没有原来的球状外形(图5d ),并且降解成小块

。

图1　载药纳米粒子的AF M 照片

Figure 1　AF M of 5-FU -loaded

Ns 图2　载药纳米粒子TE M 照片Figure 2　TE M of 5-FU -loaded

NPs

图3　载药纳米粒子的粒径分布

Figure 3　S ize of 5-FU -loaded

NPs 图4　载药纳米粒子的ξ电位

Figure 4　Z eta potential of 5-FU -loaded NPs

11212　载药纳米微粒降解过程中的质量损失和释放介质的pH 变化

从空载纳米微粒降解过程中的质量损失曲线(见图6)可以看出,空载纳米粒子在初期降解比较慢,质量损失速率较慢,而在第25天出现转折,质量损失速率开始加快,释放介质的pH 下降速率也加快(见图7)。这可能是随着P LG A 的降解,使得释放介质的pH 下降,释放体系成酸性,

进而造成P LG A

的自催化降解[2],使得降解速率加快。相比较而言,载药纳米粒子由于制备时内水相药物?36?　第5期高　　分　　子　　通　　

报

5-FU 呈碱性,中和了粒子内部P LG A 降解所造成的酸性环境,使得载药粒子降解匀速进行;另外,降解介质pH 与空载粒子相比变化缓慢(见图7),没有明显的自催化降解现象。这与文献中载药纳米粒子主要发生本体降解的结论一致[3]

。

图5　载药纳米微粒降解过程中SE M 照片

Figure 5　SE M of 5-FU -loaded NPs after degradation

113　载药纳米粒子的体外释药

11311　载药纳米微粒在前12h 的释药行为　载药纳米粒子的静态释放过程分为三步[4]:(1)药物分子在原位溶于扩散介质;(2)药物分子从原位通过聚合物的骨架扩散到微球的表面;(3)药物分子穿过液膜进入溶液中。因此在刚开始纳米粒子的药物释放出来的过程中,药物释放速率非常高,随后急剧下降,这是因为纳米粒子表面有部分5-FU ,将粒子刚放进P BS 释放介质中时,由于粒子表面能接触亲水性介质,使得5-FU 快速溶解于P BS 中,释放速率较快,这就是开始释放过程中的第一阶?46?高　　分　　子　　通　　报2004年10

月

段即快速渗透阶段,一般持续3h 。随后由于初始药物释放过程中会产生一些孔道,分布在靠近纳米粒子表面的药物通过这些孔道开始释放,微粒与释放介质有较好的通透性,药物的渗透能力较好,这是第二阶段即中速渗透阶段,一般持续315h 。然后药物释放速率下降,主要是促使药物释放的动力下降(粒子内外浓度差下降),而且此时微粒并没有开始降解,没有产生新的空洞促使药物释放,这是开始释放的第三个阶段即低速渗透阶段。一般在第615h 后,药物释放基本上处于此阶段(见图8)。该现象与参考文献一致[5]

。

图6　载药纳米微粒降解过程中质量损失曲线

Figure 6　Weight loss during degradation of NPs 图7　载药纳米微粒降解过程中pH 变化曲线Figure 7　Changes of pH during 5-FU release from NPs 图8　载药纳米粒子前12h 释药速率曲线

Figure 8　Release rate of 5-FU from NPs in 12hours 　　将前12h 的累计释放曲线进行线性拟合,结果显

示,药物的累计释放量与时间t 的线性关系较差,相关

系数R =0187200,而与t 1Π2的线性相关性较好,拟合的释药动力学方程为Q =47148834+80181945t 1Π2(R =

0197146,Q 为累计释药量)相关性较好,符合Huguchi

方程(见图9)。而且在Huguchi 方程中,释药速率与微

粒的总表面积成正比,因而释药速率也与微粒粒径成

反比,

这也是本实验测得的纳米粒子具有较高释药速

率的原因。

11312　载药纳米粒子在20天内的释药行为　载药纳

米微粒的体外药物释放性能是反映载药纳米微粒药物

缓释效果的一个重要指标,对评价载药纳米微粒的有

效性有极为重要的参考价值。载药纳米微粒的释放一

般分为三个阶段:初期药物突释阶段,稳定释放阶段与后期加速释放阶段。

(1)药物突释阶段:药物突释是指在载药纳米微粒药物释放的初期,由于吸附在载药纳米微粒表面的药物或者纳米微粒结合力较弱的药物短时间内从纳米微粒表面脱落,引起药物浓度的急剧升高;药物突释有时会引起药物浓度短时间内达到或超过中毒极限浓度,所以虽然维持时间很短,却是载药纳米微粒不可忽略的重要的药物释放阶段。图10释放曲线可以看出,纳米粒子释放在第一天有明显的突释现象,释放出的总药物占总释放量的2116%。而从图8可以进一步确定突释现?56?　第5期高　　分　　子　　通　　报

象集中在前3h 。

(2)稳定释放阶段:稳定释放阶段是载药纳米微粒最主要的药物释放阶段,此药物释放阶段,纳米微粒外液体逐步扩散到纳米微粒内部并携带药物从纳米微粒内部向外水相扩散,同时组成纳米微粒的高分子材料逐步降解,促进纳米微粒外液体向纳米微粒内的扩散以及药物向纳米微粒外扩散,加速纳米微粒的药物释放;所以,稳定释放过程由扩散过程与降解过程共同控制。在稳定释放阶段,药物可以在较长时间内维持较稳定药物释放速度(见图10,11),一般从第2天开始持续到第14天

。

图9　载药纳米粒子前12h 累积释药曲线

Figure 9　Accumulative release am ount of 5-FU from NPs in 12

hours

图10　载药纳米粒子在25天内的释药曲线

Figure 10　Release behavior of 5-FU from NPs in 25days

(3)后期加速释放阶段,在纳米微粒药物释放后期,P LA 的降解程度达到一定程度时,载药纳米?66?高　　分　　子　　通　　报2004年10

月

图11　载药纳米粒子释药曲线Figure 11　Release behavior of 5-FU from NPs

微粒会发生全面解体,从而产生了载药纳米微粒包

载药物从载药纳米微粒中全面加速释放,纳米粒子

从第12天开始释放速率开始增加,维持6天,然后

粒子中药物几乎释放完全。

对纳米粒子的累计释放百分比(Q )与时间(t )

关系进行拟合,得到线性相关性很高的释放动力学

方程Q =40105783+2191067t (R =0198128);将纳

米粒子的累计释放百分比(Q )与时间(t 1Π2)关系进

行拟合,得到释放动力学方程Q =30114632+

13165601t 1Π2(R =0197919)(见图10)。比较这两方

程的R 及其他误差指数,可以得出结论纳米粒子

的累计释放百分比(Q )与时间(t )有更好的线性相

关性。从图11可以看出从第二天开始,纳米粒子

每天的释药量基本维持平衡,为30～40μg 。因此可

以认为本实验制备的载药纳米粒子符合零级释放

方程。2　结论

采用改良复乳法制备包载5-FU 纳米微粒,其平均粒径为9815nm ,粒径分布指数为01192,粒子表面ξ电位为61148eV 。对载药纳米粒子降解过程的动态研究中发现,经过7天降解后,载药粒子失去球形表面并出现褶皱和内部塌陷;经过20天降解后,粒子已经没有球状外形,被降解成小块。随纳米微粒的不断降解,将出现质量损失,主要发生本体降解。

对载药纳米粒子在P BS 中释药行为的研究表明:(1)载药纳米微粒在前12h 的释药行为可分为快速渗透、中速渗透和低速渗透三个阶段。前12h 的释药动力学方程为Q =47148834+

80181945t 1Π2,符合Huguchi 方程;(2)载药纳米粒乎在20天内释药行为也分为三个阶段即突释阶段、稳定释放阶段和加速释放阶段。载药纳米粒子在20天内的释放动力学方程为Q :=297145789+21161380t (R =0198128);载药纳米粒子的长期释放行为符合零级释放特性。3　材料与方法

311　材料和仪器

5-氟尿嘧啶(原药,天津人民制药厂),P LG A (50∶50,MW :30000,山东医疗器械研究所),氧羧甲基壳聚糖(O -C MC ,MW :100000,实验室自制)。扫描电子显微镜,HIT ACHIX -650型,PHI LIPS 公司;

透射电子显微镜,J E O L-100CXII ,日本电子光学公司;激光粒度仪/Z eta 电位仪,BI -90Plus ,美国Blook-haven 公司。

312　载药纳米微粒的制备[1]

将5%(g Πm L ,以下同)5-FU 溶液在超声条件下(100W ,10S )滴加到10%P LG A 二氯甲烷溶液中形成初乳溶液;将013%O -C MC 溶液作为外水相在超声条件下(100W ,30S )逐滴加入到初乳溶液中,制得复乳溶液;在800rpm 的电磁搅拌条件下挥发复乳液中的有机溶剂3h ,然后离心、洗涤、冻?76?　第5期高　　分　　子　　通　　报

干,得到固化的载药纳米粒子。

313　载药纳米粒子的体外评价

31311　载药纳米粒子的表征　用透射电子显微镜和原子力显微镜观察载药纳米粒子的结构、粒径及表面形貌,激光粒度仪/Z eta 电位仪测试分析载药纳米粒子的粒径分布和表面电位。

31312　载药纳米粒子载药率与包封率的测定　准确称取冷冻干燥后的载药纳米微粒5mg ,溶于5m L CH 2Cl 2溶液中,振荡摇匀后用5m L 011N 稀盐酸萃取,然后以3000r/min 进行离心,收集上层溶液,重复萃取三次。然后用紫外分光光度计在265nm 处测萃取液的吸光度值,与浓度-吸光度标准曲线对照,可得到相应的5-FU 的浓度,进而计算得到微粒中5-FU 的包载率。

31313　载药纳米粒子的体外降解和释药　精密称取一系列载纳米粒子1mg ,分别装入eppendorf 离心管中,加入1m L pH =714的P BS 溶液;将离心管置于37℃的水浴恒温振荡器内(频率72r/min ),开始记时;间隔一定时间取出离心管并离心沉淀载药纳米粒子,收集释放后的上清液。然后(1)将释放后的载药纳米粒子冷冻干燥测量其重量,比较释放前后重量损失情况;(2)用扫描电子显微镜观察释放后的载药纳米粒子的表面形貌;(3)将释放的上清液用紫外分光光度计在265nm 处检测释放出的5-FU 含量,并用酸度计测释放液的pH 。以三次实验取平均值。31314　数据处理的统计学方法　根据数据采集的不同方法及统计学处理的不同要求,选用方差分析、q 检验、x 2

检验、等级相关及相关系数分析,用计算机Origin 610软件对所有数据进行统计学处理。参考文献:

[1]　胡云霞,原续波,张晓金,等.中国生物医学工程学报,2004,23(1):30～36.

[2]　M artinez M E ,Cam m as S ,Appel M ,P onchel G.Biom acrom olecule ,2004,5(1):137～143.

[3]　Friederike V B ,Luise S ,Achim G.Biom aterials ,2002,23:4221～4231.

[4]　M as on M N ,M etters A T ,Bowm an C N ,Anseth K S.M acrom olecules ,2001,34(13):4630～4635.

[5]　Peppas L B.Inter J Pharm ,1995,116:1～9

The Degrad ation and R elease B eh avior of 5-F luorouracil -loaded

P L G A ΠO -CMC N anop articles in vitro

H U Y un-xia 1,CH ANGJin a 3,G UO Y i a ,K ANG Chun-sheng a ,Y UAN Xu-bo a ,S ONG Cun-xia b

(a Institute o f Nanobiotechnology ,School o f Material Science and Engineering ,Tianjin Univer sity ,Tianjin 300072,China ;

b Institute o f Biomedical Engineering ,Chinese Academy o f Medical Sciences ,Tianjin 300192,China )

Abstract :Due to the attractive biodegradation and physicochemical properties ,poly (D ,L-lactide-co -glycolic acid )(P LG A )and o -carb oxymethyl chitosan (O -C MC )were ch osen to microencapsulate 5-fluorouracil (5-FU )by im proved W ΠO ΠW method.T he mean size of

the resulting 5-FU -loaded nanoparticles (NPs )was 9815nm with fine polydispersity (01192)and high Z eta potential (61148eV ).T he drug -loading level and encapsulation efficiency of the NPs were 1819%and 86%,respectively.SE M was used to study the m orph ological change of NPs during the degradation ;and the weight loss of NPs and pH change of degradation medium were traced as well.T he investigation of 5-FU release behavior from NPs showed that (1)the release kinetics of 5-FU from NPs in early 12h ours was coincided with Hugucbi release equation ;(2)the release kinetics in 20days was coincided with Z ero-level release.

K ey w ords :O -Carb oxymethylated chitosan (O -C MC );P oly (D ,L-lactide-co -glycolic acid )(P LG A );Nanoparticles (NPs );Anticancer drug ?86?高　　分　　子　　通　　报2004年10月

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/7xpl.html