综合实验步骤

RNA提取及逆转录步骤

组织RNA提取：

1、将标本约100mg放入研钵，立即加入液氮，研碎后，立即加入TRIZOL 1mL，研磨10min(清亮)后，转入1.5ml EP管，上下颠倒10次，室温静置5min。标本为组织时， 12000转离心10min取上清，转下步。

2、每加入1ml TRIZOL 在EP管中加入氯仿0.2mL，震荡15s后，静置5min，然后12000转离心15min。

3、将上层水相移入另一EP管中（宁缺毋滥），并加入约0.5mL异丙醇，震荡混匀后静置5min，12000转离心10min.

4、弃上清加1mL 75TPC 乙醇（-20°C预冷），漂浮RNA沉淀，（脾脏需用Tip吹打以去尽杂质），以7500转离心5min。

5、弃上清，置于工作台开风机干燥30min，待RNA沉淀变成半透明时，加入DEPC水20uL/40uL，如果沉淀不溶解，置于55-60度温箱水浴5min左右。-70度保存或立即逆转录。 静脉血RNA提取：

1、 将5mL静脉血于EDTA抗凝管中，放4℃冰箱2h左右； 2、 3000转离心5min，吸取上清置于1.5mL离心管； 3、 加4mL NS于下层血细胞中，吹打混匀以悬浮细胞；

4、 加4mL大鼠淋巴细胞分离液到15mL离心管中，将血细胞悬液缓缓加到

装有大鼠淋巴细胞分离液的离心管中；2000转离心25min； 5、 小心吸取云雾层（即单个核细胞），7500转离心5分钟，去上清； 6、 以1ml NS重悬细胞，吹打洗涤，6500转离心5min，吸尽上清，存于-80℃

或加入TRIZOL/裂解液。 逆转录步骤(MBI试剂盒)： 1、05.mL EP管中加入

DEPC水 RNA Oligo 10uL 1uL 1uL 置于PCR仪中70℃ 5min （编号XIER101）

2、放入冰中5min 3、点离5秒，加入

5×缓冲液 4uL Rnase抑制剂 1uL dNTP 2uL 置于PCR仪中37℃ 5min （编号XIER102）

4、加入逆转录酶1uL，用tip头吹打混匀，放入PCR仪中 42℃60min，70℃10min（编号XIER103），然后-20℃保存。 PCR步骤（25uL体系）：

模板 1uL Sense 1uL Anti-sense 1uL TaqMIX 12.5 uL 去离子水加至25uL

★ RNA浓度测定：取1uL RNA原液稀释至250uL，测定其A260和A280的值，一

般A260/280的比值在1.8-2.0之间满足实验要求 RNA原液浓度=A260×稀释倍数（250）×40（ng/μL）

★

Western blotting

一、主要试剂的配制(所有单位均为g/mL)

1、丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺 丙稀酰胺29g+甲叉双丙稀酰胺1g= 100ml，储于棕色瓶，4℃避光保存。 2、10%SDS、10%APS

3、Tris-甘氨酸电泳缓冲液 30.3gTris，187.7g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1L，得10×缓冲液。

4、转移缓冲液 2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.375g SDS，200mL甲醇，定容1L。 5、丽春红染液储存液 丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸 30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。 6、考马斯亮蓝染色液 1g考马斯亮蓝R-250用250mL的异丙醇搅拌溶解，再加入100mL的冰醋酸，均匀搅拌，再加入650mL的去离子水，均匀搅拌。滤纸过滤后室温保存。

7、考马斯亮蓝脱色液 醋酸100mL，乙醇50mL，蒸馏水850mL

二、制胶

三、电泳 浓缩胶70V，分离胶110V，2小时30分钟左右。（同时配封闭液） 四、转膜 PVDF膜用100%甲醇浸泡5min，转膜液浸泡5min，视蛋白分子量

决定电压，恒流300mA左右

五、封闭（室温1h） 1g脱脂奶粉+20mL TBS-T（TBS：Tuween=1000：1） 六、一抗孵育（4℃过夜） 2%脱脂奶粉（TBS-T溶解）稀释，；TBS-T洗膜

10min×3次

七、二抗孵育（室温1h） 10mL 5%脱脂奶粉（PBS-T溶解）1h，TBS-T

洗3×10min，再用TBS洗一次，以洗尽吐温。

八、显色 ECL发光试剂盒：1：1混合； 九、曝光 如有明显条带，30s足够。

石蜡切片-免疫组织化学

将神经组织切成3-4mm长片段，装入铜条盒，流水冲洗20min

一、梯度脱水

50%的酒精（3-4h）→70%的酒精（3-4h）→85%的酒精（过夜）→95%的酒精（1h）（同时融蜡，78℃）→100%的酒精（1h×2次）→1半酒精、1半二甲苯透明（20min）→二甲苯Ⅰ（20min）→二甲苯Ⅱ（20min）

二、浸蜡

56-58℃（20min）→58-60℃（20min）→60-62℃（60min）

三、包埋 以60-62℃包埋（准备电烙铁、镊子）包埋好的蜡块最好放于4℃保

存。

四、切片 4μm切片，贴片 五、脱蜡至水

1、电吹风吹片或烤箱64℃烤1-2h，至溶蜡（此步后玻片可于4℃长期保存）；2、入二甲苯（I）中脱蜡5min，甩干；

3、入二甲苯（II）中脱蜡10min（此时切片应透明），甩干； 4、入100%乙醇（I）5 min，甩干； 5、入100%乙醇（II）5 min，甩干； 6、入95%乙醇5 min； 7、入85%乙醇10min 8、入70%乙醇10min

9、入流水2分钟，甩干水分；

免疫组化 ABC法操作步骤：

（ 1 ） 石蜡切片脱蜡至水。

（ 2 ） 3%H 2O 2 （30% H 2O 2：甲醇=1：9）室温孵育 5-10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。

（ 3 ） 蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5 min×2（如需抗原修复，可在此步后进行，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液，3g柠檬酸二钠+0.4g柠檬酸+蒸馏水=1L）。

（ 4 ） 5% 正常山羊血清（PBS 稀释）封闭（免疫荧光用10%），室温孵育 20min，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 h或 4 ℃ 过夜（如果选择4℃过夜，需37℃复温45min，防止脱片）。

★封闭血清最常用的是二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常用。封闭时间一般为10-30min。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。

★Triton X-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在细胞免疫组织化学或组织免疫组化（>10um厚切片）推荐使用，作为细胞通透剂，在膜上打孔。

（ 5 ） PBS 冲洗， 5min×3 次。

（ 6 ） 滴加适量生物素（biotin）标记二抗工作液， 37 ℃ 孵育30min（同时配制链霉卵白素工作液，因其配好30min后才能使用）。 （ 7 ） PBS 冲洗，5min×3 次。

（ 8 ） 滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素（avidin）工作液， 37 ℃孵育30min。

（ 9 ） PBS 冲洗，5min×3 次。 （ 10 ） DAB显色剂显色 3-15min。

（ 11 ） 自来水充分冲洗，苏木素复染（数秒或不染），脱水，透明，封片。

PK-4001试剂盒内容：

A: 封闭用血清 B：生物素标记二抗 PK-4001: 生物素标记羊抗兔IgG C：卵白素 D：生物素化辣根酶 工作液的配制

1、稀释液:可以采用多种缓冲液对本系列产品进行稀释，最常用的的稀释液是中性的磷酸盐缓冲液（10mM PBS）。 2、封闭血清:稀释比例1:50

3、生物素化抗体:稀释比例1:200 4、ABC复合物:将试剂C和D按1:100的稀释比例等量混合，放置30分钟后方可使用。 贴心提示

1、本系列检测试剂盒适用于绝大多数组织，但对于内源性生物素含量比较丰富的组织（如肾脏、肝脏等），应选用非生物素检测系统。

2、本品为浓缩液，需预先稀释方可使用，稀释后的液体不能长期保存。

3、如以每张切片加入1滴（约50μl）计算，1/4Kit可做750张切片，1Kit可做3000张切片。

Weil髓鞘染色法

1．试剂配制

A液: 苏木精1g, 无水酒精 100ml, 溶解后备用 B液:硫酸铁胺4g,蒸馏水100ml, 溶解后备用 C液：铁氰化钾12.5g, 硼砂2.5g, 蒸馏水1000mL

D 液： 综合染液，A液1份，B液1份，蒸馏水2份，混匀 2．实验方法

（1） 石蜡切片常规脱蜡入水，将切片转入D液染色20min;

(2) 取出切片充分水洗后，置于B液分色，至灰质和白质可以区别为止 （3） 自来水冲洗，蒸馏水洗涤2次；

（4）置于C液中分色片刻，取出后蒸馏水洗涤； （5）常规酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固

3 结果判断正常神经髓鞘被深兰色至黑色，灰质至深黄色至无色，变性和溃变的髓鞘不着色。

1、石蜡切片和冰冻切片的比较？

（1）要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是今天我向一老师请教得出的结论。因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。

（2）冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。

（3）石蜡切片的优点可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80度的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到4微

米左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。

2、一抗的选择要点和技巧是什么？

（1）单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。

（2）应用范围的选择。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。

（3）种属反应性的选择（species reactivity）。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。

（4）种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。

（5）生产厂家的选择。如santa Cruz公司抗体一般1ml，价格2100元左右；而chemicon公司一抗一般100ul，价格2800元左右。这两个厂家的同一种抗体它的实际效价稳定是不同的，我一般用后者抗体做免疫组化效果较好，而前者做Western blotting效果还可以。

3、在什么情况下使用Triton-X100

（1）Triton X-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织化学（>10um厚切片） 和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。

（2）其作用原理：Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。

（3）Triton X-100既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用。 4、封闭血清的选择原则是什么？

（1）膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！

（2）封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。

（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。 5、抗体孵育条件的比较？

（1）一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。

（2）二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。 6、一抗4度孵育后为什么要进行37度复温？ （1）一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；

（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4度和37度时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

（3）其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。事实胜于雄辩！

7、DAB显色时间如何把握？

（1）DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；

（2）DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；

（3）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；

（4）DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。

8、免疫组化结果如何分析？

（1）阳性着色细胞计数法。在40*光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。

（2）灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。

（3）评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最终可以分数相加，再进行比较。

对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。

9、在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么？

（1）由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。

（2）修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH的等）。

（3）微波修复，我们一般用6min*4次，效果不错 10、内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？

（1）一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右；而0。3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min。

（2）用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片。

（3）现用现配，配好后4度避光保存。 11、如何才能充分脱蜡？

（1）蜡不溶于水，如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起染色不均匀、阳性物时隐时现、真假难辨、背景染色增加等。为了解决上述的问题，切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短；

（2）脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜谋面是在不同。如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长。

（3）当天切的切片，烧烤2小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温10-20分钟，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果更好。

总之，操作时应根据不同的季节，不同的室温，不同的试剂来决定，脱蜡的时间，原则上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。

12、如何最大限度地降低组织非特异性染色？

（1）缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。

（2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。 （3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；

（4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；

（5）缩短DAB孵育时间或降低DAB浓度/过氧化氢浓度等；

（6）适当增加PBS冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；

（7）防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色。 13、苏木素复染时间的把握？

（1）苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟。不过这个如果染色不理想可以补救的。即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。

（2）盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。

（3）如果分化的颜色过浅，可以复置于苏木素中染色。 14、PBS的清洗方式选择、次数和时间的选择？ （1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。

临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。

（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。

冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而下流下来，不要拿起切片将PBS对准切片冲洗，这样由于冲出的PBS有一定的冲击力，很容易使切片周边引起松动，导致切片的脱落。

（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。

冲洗切片有人提出用微振荡器振染，振下未结合的各种物，使之不产生背景，此种做法一是浪费时间，二是很容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践认为，用一小烧杯柔和地于切片上冲洗，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好于切片上再注入PBS，持续2分钟左右就完全足够了。

（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。

中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。

（5）常用试剂的配制和使用。

在免疫组织化学的染色过程中，用得最多的试剂就是缓冲液，因为切片在整个染色中，抗体的加、换、切片的冲洗，DAB的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用，缓冲液的过酸或偏碱，都将影响染色的结果。

15、脱片产生的原因和如何防止脱片？

（1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么样子了。后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。

（2）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。

（3）组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。

（4）没烤好，时间短温度不够之类。

（5）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。

（6）修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。

（7）此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。

16、背景染色较深的原因有哪些？

（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。

（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。

（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。

（4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，

采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。

（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4？C冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。

（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。

17、苏木素复染后氨水返蓝这一步如何做、浓度多少、时间多长？ 答：返蓝可以用碱性溶液（PBS/NA2HPO4/淡氨水）或45度温水、冷水蓝化均可。一般蓝化5~10 min。淡氨水有人用50ml自来水+三四滴的氢氧化铵。

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