基因工程讲义

基 因 工 程 讲 义

主讲教师──陈永胜

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目 录

第一章 绪 论???????????????????3

一、基因工程的诞生???????????????????3 二、基因工程的成就???????????????????5 三、基因工程安全性的问题???????????????? 6 四、基因工程研究的内容????????????????? 8

第二章 基因克隆所需的工具酶??????????? 12

一、限制性内切酶(restriction enzyme)????????????

12

二、DNA连接酶???????????????????? 20 三、DNA聚合酶???????????????????? 24 四、逆转录酶????????????????????? 27

第三章 基因的克隆载体 ?????????????? 28

一、质粒载体????????????????????? 28 二、大肠杆菌质粒载体 ????????????????? 30 三、λ噬菌体载体????????????????????33 四、粘粒载体（柯斯质粒载体）?????????????? 35

第四章 目的基因的分离克隆 ???????????? 38

第一节 化学法合成目的基因????????????????

38 38

第二节 PCR技术在基因克隆中的应用????????????一、PCR基本技术??????????????????? 38 二、PCR技术在基因克隆方面的应用???????????? 42

I

第三节 基因文库技术分离目的基因????????????? 45 一、 基因文库的类别???????????????????46 二、核基因组文库构建?????????????????? 48 三、利用PCR技术构建c DNA文库?????????????49 四、应用差别杂交或扣除杂交法构建cDNA文库???????? 49 五、人工染色体文库???????????????????50

第五章 重组体的构建、转化及鉴定?????????? 54

一、质粒DNA的分离纯化???????????????? 54 二、目的基因与载体的连接???????????????? 54 三、重组体向宿主细胞的导入??????????????? 54 四、含重组质粒的细菌菌落的鉴定??????????????56

第六章 克隆基因的表达??????????????? 59

第一节 外源基因在原核细胞中的表达???????????? 60 一、原核生物基因表达的特点??????????????? 60 二、基因表达的调控序列????????????????? 61 三、几种类型的原核表达载体??????????????? 62 四、 提高克隆基因表达效率的途径????????????? 63 第二节 外源基因在真核细胞中的表达???????????? 68 一、 真核细胞基因克隆载体????????????????

68

第三节 外源基因导入真核细胞的方法?????????????72

第七章 重组体的筛选与鉴定?????????????76

一、遗传检测法???????????????????? 76 二、物理检测法???????????????????? 78

II

三、核酸杂交筛选法???????????????????79 四、免疫化学检测法???????????????????80 五、DNA—蛋白质筛选法????????????????? 81

III

《基因工程》课程教学大纲

适用专业 生物科学，生物技术 学 时 50 学 分 4

预修课程 普通生物学、遗传学、生物化学、分子生物学 制订日期 2003.5

一、编写说明

（一）本课程的性质、地位和作用

自本世纪70年代基因工程诞生以来，在不到30年的时间内，已取得许多激动人心的成就，并继续向前迅猛发展，成为当今生物科学研究领域中最具生命力、最引人注目的前沿学科之一。基因工程学的出现，给社会发展带来了深刻的影响。许多国家都已把基因工程列为优先发展的高科技项目。

本课程主要介绍基因操作的主要技术原理，基因操作的工具酶，克隆载体，目的基因的分离方法，重组体的构建及导入，克隆基因的表达与检测，基因工程研究进展，存在问题及新策略等内容，使学生具备基因工程方面的基本知识和掌握基因工程基本的操作技术。

（二）本大纲制订的依据

基因工程是生物学科中的高级课程，主要针对高年级本科生和研究生开设。学生在此之前需要掌握普通生物学、遗传学、生物化学、分子生物学等方面的专业知识，以及分析化学、有机化学、无机化学、大学物理等方面的基本知识。 （三）大纲内容选编原则和要求 （四）实践环节 （六）考核方法与要求 ⒈ 平时成绩： 0% ⒉ 实验成绩： 0% ⒊ 试卷成绩： 100%，

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第二章 基因克隆所需的工具酶

基因操作包括以DNA分子的切割和连接为核心的一系列步骤，需要多种具有不同功能的工具酶参与完成。以限制性内切酶(restrictionendonuclease)和DNA连接酶(1igase)为主的多种工具酶的发现和应用，为基因操作提供了十分重要的技术基础。基因的重组与分离，涉及到一系列相互关连的酶催化反应。已经知道有许多种重要的核酸酶，例如核酸内切酶、核酸外切酶，以及用信使RNA模板合成互补链DNA的反转录酶(reversetranscriptase)等，在基因克隆的实验中都有着广泛的用途。

一、限制性内切酶(restriction enzyme)

1．限制性核酸内切酶的发现

限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出了2 300种以上，可识别230种不同的DNA序列。

早在本世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄生控制的限制(restriction)和修饰(modification)系统。

图中的数字是生长在不同寄主中的^噬菌体的成斑率(EOP)，表示限制程度。在K株或B株上生长繁殖的噬菌体^(K)或L(B)，再次感染原寄主菌株的成斑率均为1，而感染新的寄主菌株的成斑率则分别为10-4和4×10-4，所以说受到了限制。

在限制修饰系统中限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制修饰系统中修饰作用的含义。 2．核酸内切限制酶的类型

目前已经鉴定出有三种不同类型的核酸内切限制酶，即I型酶、II型酶和III型酶。这三种不同类型的限制酶具有不同的特性(表3—3)。

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表3-3 核酸内切限制酶的类型及其主要特性 特性 限制和修饰活性 I型 单一多功能的酶 II型 分开的核酸内切酶和甲基化酶 核酸内切限制酶的蛋白质结构 切割位点 在距寄主特异性位点至少1000bp的地方可能随机地切割 甲基化作用的位点 识别未甲基化的序列进行核酸内切酶切割 序列特异的切割 DNA克隆中的用处

1968年，Meselson和Yuan最早从大肠杆菌B和K菌株的限制和修饰系统中分离到限制性内切酶，这种酶后来被命名为I型限制性核酸内切酶。I型限制性内切酶虽可识别DNA分子中特定的核苷酸序列，但它们的切割作用却是随机进行的，其切割方式是，先与双链DNA上未加修饰的识别序列相互结合，然后沿着DNA移动相当于1000~5000个核苷酸的一段距离后，在似乎是随机的位置上切割一股单链，形成大约75个核苷酸的缺口。因此，I型限制性内切酶在基因操作中没有什么实际的应用价值。

在1970年，发现II型酶，由于其核酸内切酶活性和甲基化作用活性是分开的，而且核酸内切作用又具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。所以在基因工程中我们着重介绍II型酶。

不是 无用 是 十分有用 是 用处不大 寄主特异性的位点 能 寄主特异性的位点 能 寄主特异性的位点 能 位于寄主特异性位点或其附近 距寄主特异性位点3，端24~26bp处 3种不同的亚基 单一的成份 III型 具有一种共同亚基的双功能的酶 2种不同的亚基 13

3．核酸内切限制酶的命名法

由于发现了大量的限制酶，所以需要有一个统一的命名法。H．O．Smith和D．Nathans(1973)提议的命名系统，已被广大学者所接受。他们建议的命名原则包括如下几点：

① 用属名的头一个字母和种名的头两个字母，组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例如，大肠杆菌(Escherichia coli)用Eco表示，流感嗜血菌(Haemophilus influen—zae)用Hin表示。

② 用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型，例如Ecok。如果限制与修饰体系在遗传上是由病毒或质粒引起的，则在缩写的寄主菌的种名右下方附加一个标注字母，表示此染色体外成分。例如Ecop1，EcoR1。

⑧如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体系，则以罗马数字表示。因此，流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为HindI、HindII、HindIII等等。

④所有的限制酶，除了总的名称核酸内切限制酶R外，还带有系统的名称，例如核酸内切酶R．HindIII。同样地，修饰酶则在它的系统名称之前加上甲基化酶M的名称。相应于核酸内切酶R．HindIII的流感嗜血菌Rd菌株的修饰酶，命名为甲基化酶M. HindIII。

在实际应用上，这个命名体系已经作了进一步的简化：

①由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以现在通行的是把全部略语字母写成一行。

②在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶的地方，核酸内切酶的名称R便被省去。

4.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性

与I型及III型核酸内切限制酶不同，II型核酸内切酶只有一种多肽，并通常以同源二聚体形式存在。

(1) 基本特性 它具有三个基本特性：

a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂； b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；

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c. 因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端。 a. 识别位点：

绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别由4~8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。而限制酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此识别序列又称为核酸内切限制酶的切割位点或靶序列。

有些识别序列是连续的(如GATC)，有些识别序列则是间断的(如GANTC)，N是代表任意一种核苷酸碱基，切割位点的一个共同特点是，它们具有双重旋转对称的结构形式，换言之，这些核苷酸对的顺序是呈回文结构，例如： 5′-CTGCA G-3′ 5′-CTGCA G-3′ 3′-G ACGTC-5′ （a）Pst I切割位点

5′-G AATTC-3′ 5′-G + AATTC-3′

3′-CTTAA G-5′ 3′-CTTAA G-5′ (b)EcoRI切割位点

5′-GAT ATC-3′ 5′-GAT + ATC-3′ 3′-CTA TAG-5′ （c）EcoRV切割位点

图 不同的核酸内切限制酶切割DNA分子产生的两种不同的粘性末端 (a) PstI的识别序列，切割后形成3′﹣OH的单链粘性末端， (b) EcoRI的识别序列，切割后形成5′﹣P的单链粘性末端， (c) EcoRV的识别序列，切割后形成平末端。

在切割位点处，限制酶的作用下磷酸二酯键便会发生水解效应，从而导致链的断裂。这就是所谓的核酸内切限制酶对DNA链的切割作用。 b. 切割类型：

3′-CTA TAG-5′ 3′-G + ACGTC-5′

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检验了非常大量的实验事例之后发现，由核酸内切限制酶的作用所造成的DNA分子的切割类型，通常是属于下述两种独特的排列方式之一：

（1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段；

（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。

c. 产生的末端特征：

我们所说的粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。

平末端的DNA片段则不易于重新环化。

已知有两种不同类型的限制酶都可以产生粘性末端， 但一种是形成具有3′﹣OH单链延伸的粘性末端，例如PstI酶就是属于这种类型；另一种则是形成具有5′﹣P单链延伸的粘性末端，例如EcoRI酶便是此种类型的一个代表。 (2) 同裂酶 (isoschizomers)

有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶(isoschizomers)。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。例如，限制酶HpaⅡ和MspI是一对同裂酶，共同的靶子序列是CCGG。 (3) 同尾酶 (isocaudamer)

与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。常用的BamH I,Bcl I,Bgl II,Xho I就是一组同尾酶。它们切割DNA之后都形成由-GATC- 4个核苷酸组成的粘性末端，很显然，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”(hybrid site)。但必须指出，这类杂种位点的结构，一般是不再被原来的任何一种同尾酶所识别的。例如：Sal I（5′ -G TCGAC-3′）和Xho I (5′ -C TCGAG-3′)的消化片段相连，但所形成的重组片段（5′ -GTCGAG-3′）则不能被上述2种酶的任一种酶识别和切割。但也有例外。 5．影响核酸内切限制酶活性的因素 (1) DNA的纯度

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核酸内切限制酶消化DNA底物的反应效率，在很大程度上是取决于所使用的DNA本身的纯度。污染在DNA制剂中的某些物质，例如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS(十二烷基硫酸钠)、以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸内切限制酶的活性。

为了提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三种方法： ①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些 ②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。 ③延长酶催化反应的保温时间。

在有些DNA制剂中，尤其是按微量碱法制备的，会含有少量的DNase的污染。由于DNase的活性需要有Mg2+的存在，而在DNA的贮存缓冲液中含有二价金属离子螯合剂EDTA，因此在这种制剂中的DNA仍然是稳定的。然而在加入了核酸内切限制酶缓冲液之后，DNA则会被DNase迅速地降解掉。要避免发生这种情况，唯一的办法就是使用高纯度的DNA。 (2) DNA的甲基化程度

核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。 (3) 酶切消化反应的温度

DNA消化反应的温度，是影响核酸内切限制酶活性的另一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有不同的最适反应温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃，但也有许多例外的情况，它们要求37℃以外的其它反应温度。其中有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的37℃，例如SmaI是25℃、ApaI是30℃；有些核酸内切限制酶的最适反应温度则高于标准的37℃，例如MaeI是45℃、Bcl I是50℃、MaelII是55℃；还有些核酸内切限制酶的最适反应温度可高达60℃以上，消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。 (4) DNA的分子结构

DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大的影响。某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。

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此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。据推测，这很可能是由于侧翼序列的核苷酸成份的差造成的。 (5) 核酸内切限制酶的缓冲液

核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl,?-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。不正确的NaCl或Mg2+浓度，不仅会降低限制酶的活性，而且还可能导致识别序列特异性的改变。

缓冲液Tris-HCl的作用在于使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值的范围之内。对绝大多数限制酶来说，在pH=7.4的条件下，其功能最佳。

巯基试剂对于保持某些核酸内切限制酶的稳定性是有用的，而且还可保护其免于失活。但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性。

有一部分核酸内切限制酶对于钠离子或钾离子浓度变化反应十分敏感，而另一部分核酸内切限制酶则可适应较广的离子强度的变化幅度。

在“非最适的”反应条件下(包括高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等)，有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子。

有些核酸内切限制酶的切割特异性，受所用的缓冲液成份的影响比较明显。例如，最常用的EcoRI限制酶，在正常的情况下，是在G AATTC识别序列处发生切割作用的，但如果缓冲液中的甘油浓度超过5％(V／V)，那么其识别序列的特异性就会发生松动，可在AATT或PuPuATPyPy序列处发生切割作用。EcoRI限制酶的这种特殊的识别能力，通常叫做星号活性，以EcoRI*表示。 6. 限制性内切酶反应的终止

消化DNA样品后，在进一步处理DNA样品前往往需要钝化内切酶的活性，钝化大多数限制性内切酶的方法是65℃温浴5分钟。

但有些酶，如BamHI和HaeⅡ对热稳定，则需加入终止反应液(如加入0.5mol／L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10mmol/L)螯合Mg2+，以终止反应。 此外，还可以用等体积的酚抽提酶解产物，提取DNA。

如果用限制性内切酶消化DNA分子后，为了进行凝胶电泳分析，则可直接加入凝胶电泳加样缓冲液，振荡混合后，直接上样进行凝胶电泳。

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7. 利用限制酶对DNA进行消化的具体步骤

不同的限制酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。由于大多数生产厂家都针对其特定酶制剂优化过反应条件，所以建议遵循与酶一起提供的说明书进行操作。

不同限制酶的缓冲液主要差别在于其中所含NaCl的浓度。当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割。

如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：

① 先用在低离子强度的缓冲液中活性最高的酶切割DNA，然后加入适量NaCl

及第二种酶，继续温育；

② 使用实际上所有限制酶均可作用的单种缓冲液[谷氨酸钾缓冲液

(KGB)](Hanish和McClelland,1988；McClelland等，1988)。可使各种限制酶的活性达到最高。

限制酶消化反应的进行

以下是对0.2~1.0 ugDNA进行消化的典型反应步骤，如要对更大量的DNA进行消化，则反应的各个成分须相应放大。

1) 将DNA溶液加入一灭菌的微量离心管中并与适量水混匀，使总体积为18pl。 2) 加入2μl适当的10×限制酶消化缓冲液。轻敲管外壁以混匀之。 3) 加入1~2单位限制酶，轻弹管外壁以混匀之。

1单位酶通常定义为，在建议使用的缓冲液及温度下，在20μ1反应液中反应1小时，使lμg DNA完全消化所需的酶量。

除非在酶制剂中污染了DNA酶或外切核酸酶(这种污染情况在商品化的限制酶制品中极少出现)。一般酶量过大或反应时间延长不会发生什么问题。 4) 将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行温育。 5) 加入0.5mol／L EDTA(pH8.0)使终浓度达10mmol／L，以终止反应。

6) 如果消化后DNA直接进行凝胶电泳分析，可加入6μl凝胶电泳加样缓冲液，振荡混合后，即可加样进行电泳。

如欲纯化消化后的DNA，可用酚：氯仿和氯仿各抽提1次，再用乙醇沉淀DNA。 8. 使用限制酶的注意点

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1） 限制酶十分昂贵!遵循以下建议可以最大限度地节省开支。为能从贮存管内取出小量的酶，只要用一次性使用的移液器吸头在酶溶液表面轻沾一下即可。这样，你可以取到少至0.1μl的酶。浓缩的限制酶也可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释。但切勿用水稀释以免酶变性。

2) 限制酶在50％甘油中保存于-20℃时是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即加以混匀，再从冰箱内取出贮酶管，立即放置于冰上。每次取酶时都应换一个无菌吸头，一旦限制酶中污染了DNA或其他酶，将造成财力和时间上的浪费。操作要尽可能快，用完后立即将酶放回冰箱，以使酶在冰箱外放置的时间尽可能缩短。 3) 尽量减少反应中的加水量以使反应体积减到最小。但要确保酶体积不超过反应总体积的1/10，否则，限制酶活性将受到甘油的抑制。

4) 通常延长消化时间可使所需的酶量减少。这在切割大量DNA时不失为一大节约方法。在消化过程中，可取少量反应液进行微胶电泳以判断消化进程。

二、DNA连接酶

同核酸内切限制酶一样，DNA连接酶的发现与应用，对于重组DNA技术学的创立与发展也具有头等重要的意义。它们都是在体外构建重组DNA分子所必不可少的基本工具酶。核酸内切限制酶可以将DNA分子切割成不同大小的片段，然而要将不同来源的DNA片段组成新的杂种DNA分子，还必须将它们彼此连接并封闭起来。

目前已知有三种方法可以在体外连接DNA片段： １）用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段；

２）用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸

转移酶给具平末端的DNA片段加上poly(dA)—poly(dT)尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来；

３）DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用

DNA连接酶将它们连接起来。

这三种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。 １．DNA连接酶的发现

1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶(1igase)。这种酶需要在一条DNA链的3′–末端具有一

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个游离的羟基(–OH)，和在另一条DNA链的5′–末端具有一个磷酸基团(–P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用(图)。同时，由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能的反应，因此还需要有一种能源分子的存在才能实现这种连接反应。在大肠杆菌及其它细菌中，DNA连接酶催化的连接反应，是利用ＮＡＤ＋[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]作能源的；而在动物细胞及噬菌体中，则是利用ATP[腺苷三磷酸]作能源。

值得注意的一点是，DNA连接酶并不能够连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的ＤＮＡ链必须是双螺旋的一部分。实际上，DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的缺口(nick)，即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂；而不能封闭裂口(gap)，即在双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。 ２．ＤＮＡ连接酶的连接机理

在反应中，ATP(在有些连接酶是NAD)提供了激活的AMP，同DNA连接酶生成一种共价结合的酶-AMP复合物，同时伴随着释放出焦磷酸(PPi)或烟酰胺单核苷酸(NMN)。其中，AMP(腺苷一磷酸)是通过一种磷酸酰胺键同DNA连接酶的赖氨酸之c—氨基相连。

激活的AMP随后从赖氨酸残基转移到DNA一条链的5′–末端磷酸基团上，形成DNA—腺苷酸复合物。

最后一步是3′–OH对活跃的磷原于作亲核攻击，结果形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。

这个反应序列，是由在DNA连接酶—腺苷酸复合物形成过程中，释放出来的焦磷酸的水解作用所激发的。因此，如果是以ATP作能源的话，在DNA骨架上形成一个磷酸二酯键就要花费2个高能磷酸键。而如果是应用NAD+作为腺苷酸的给体，那么每形成一个磷酸二酯键同样也需要花费2个高能磷酸键。 分类：

用于共价连接DNA限制片段的连接酶有两种不同的来源：一种是由大肠杆菌染色体编码的叫做DNA连接酶：

另一种是由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的叫做T4DNA连接酶。

这两种DNA连接酶，除了前者用NAD+作能源辅助因子，后者用ATP作能源辅助因子外，其它的作用机理并没有什么差别。T4DNA连接酶是从T4噬菌体感染的大肠杆

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