2015年研究生分子生物学课后答案

第一次课

举例说明人的基因组成或结构变化引起的相关疾病

(要求：1特定某个基因名称、定位、大小及组成等基本特征。2基因组成或结构变化的过程、结果和表型)。

疾病：严重复合免疫缺陷病（XL-SCID） 名称：受体γ链(γc)基因突变引起。 定位：编码基因位于Xq12～131

组成：γc基因8个外显子的135种基因突变，其中5个突变热点;最常见的突变类型是单个碱基置换(错义突变和无义突变)，其次为剪接部位突变、缺失和插入突变

结果：该基因编码的产物为白介素（如IL-4，IL-21）。这些白介素和受体涉及了很多T,B细胞的分化和常熟。当基因突变时，无功能蛋白质产物生成，导致白介素信号的广泛缺失，进而引起免疫系统功能的丧失。 第三次课

1、请叙述肝细胞对胰高血糖素或肾上腺素的反应过程。

简洁答案： 肾上腺素能受体激活——与Gi偶联——AC活性下降——cAMP活性下降——平滑肌舒张。胰高血糖素能受体——激活Gs、增加AC活性——cAMP——PKA（增加肝糖原分解）

叙述答案：肾上腺素和胰高血糖素中的任何一种激素同肝细胞膜上相应受体结合后激化G蛋白，G蛋白化a亚基，a亚基激化腺苷酸环化酶(AC)，AC催化小分子信使cAMP的产生，cAMP结合PKA，通过变构调节作用激化PKA，PKA通过磷酸化作用激化或抑制各种效应蛋白，继续传递信号，PKA激活磷酸化酶b激酶，促进糖原的分解代谢，糖原分解成1-磷酸葡萄糖，然后进一步分解为6-磷酸葡萄糖随后进入血液。激活的PKA计入细胞核使cAMP反应元件结合蛋白(CREB）磷酸化。磷酸化的CREB结合于cAMP反应元件（CRE），并与CREB结合蛋白（CBP）结合。与CREB结合后的CBP作用于通用转录因子（包括TFIIB）,促进CFIIB等通用转录因子与启动子结合激活基因的表达。

2、细胞膜在信号转导的过程中起到怎样的作用？

答案1：屏障作用，位于细胞膜的某些能特异性地与外源性物质结婚，并诱发细胞产生某些特定的生理生化反应，并最终产生生物学效应的物质。 答案2：

每个细胞在机体内并非孤立地存在，而是不断受到其生活环境中各种理化因素的影响。各种信号，如化学、机械、电刺激信号，一般首先作用于细胞膜，膜上某些特异性蛋白质能选择性地接受某种特定信号，引起细胞膜两侧电位变化或细胞内发生某些功能改变；细胞膜的这种作用称为跨膜信号转导功能。

细胞通过位于胞膜或胞内的受体感受胞外信息分子的刺激，经复杂的细胞内信号转导系统的转换而影响其生物学功能，这一过程称为细胞信号转导，这是细胞对外界刺激做出应答反应的基本生物学方式。其中，水溶性信息分子如肽类激素、生长因子及某些脂溶性信息分子(如前列腺素)等，不能穿过细胞膜，需通过与膜表面的特殊受体相结合才能激活细胞内信

息分子，经信号转导的级联反应将细胞外信息传递至胞浆或核内，调节靶细胞功能，这一过程称为跨膜信号转导。其过程包括：①胞外信号被质膜上的特异性受体蛋白识别，受体被活化；②通过胞内信号转导物(蛋白激酶，第二信使等) 的相互作用传递信号；③信号导致效应物蛋白的活化，引发细胞应答(如激活核内转录因子，调节基因表达)。脂溶性信息分子如类固醇激素和甲状腺素等能穿过细胞膜，与位于胞浆或核内的受体结合，激活的受体作为转录因子，改变靶基因的转录活性，从而诱发细胞特定的应答反应。 第四次课

1.试述外源基因在原核体系中的表达需要具备的条件，及影响外源基因表达的因素。 外源基因表达所要具备的条件︰（1）编码区不含插入序列（mRNA-cDNA）;(2)位于启动子下游，方向一致，原有的读码框不变；（3）含起始密码子（AUG）,终止密码（TAA）;(4)转录的必须有SD序列，调节SD序列与第一个AUG间的距离；（5）选择系统编号的简并密码；（6）增强产物的稳定（如︰融合蛋白，信号肽）。

影响因素︰（1）启动子的强弱（主要因素）；（2）基因的剂量；（3）RNA转录效率（SD互补，AUGSD距离及序列，AUG前后核苷酸序列的适宜性）；（4）密码子；（5）表达产物的大小；（6）产物的稳定性。

2.蛋白质的分离纯化技术依据蛋白质的性质分为哪几大类，请列举其中的一类，谈谈它的原理及应用。

蛋白质的分离纯化可分为︰①依据溶解度差别，如硫酸铵分离法；②依据分子大小不同︰透析、超过滤、离心法、凝胶过滤层析、凝胶电泳；③依据蛋白质分子带点性质不同︰电泳、离子交换层析；④依据蛋白质吸附性质不同︰吸附柱层析、吸附薄层层析；⑤利用蛋白质的特异性配体︰亲和层析。举例︰电泳。其原理︰在一定PH值下，细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动，向正极或负极移动。各种细胞或处于不同生理状态的同种蛋白质所带电荷的电量不同，故在一定的电场中的泳动速度也不同。（影响颗粒电泳迁移率的因素︰缓冲液，电场，支持介质）类型︰SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点聚焦电泳、毛细管电泳。应用︰电泳的类型很多，应用范围也很广，如︰SDS-PAGE，常用于蛋白质分子量的测定︰目前，双向凝胶电泳已成为蛋白质组学研究的重要技术。

3.以人GM-CSF为例，写出获得该基因工程重组蛋白纯品的流程。

1、GM—CSF全基因及可溶性sGM—CSF基因PCR扩增。2、含肠激酶位点的

pth10HisA·sGM—CSF表达载体的构建（纯化后的GM—CSF，sGM—CSF及质检）。3、诱导表达pth10HisA·sGM—CSF在大肠杆菌BL21中诱导表达。4、sGM—CSF融合蛋白的制备<1度工程菌的培养2度超声破坏菌体。5、sGM—CSF融合蛋白的纯化<1度融合表达载体pthhisa在硫氧还蛋白融合段有组氨酸标签，用M2+固相化的chelating sepharose fast flow 填材料进行亲和，层析2度将可溶性表达产物（超声波，噬菌体的离心上清）与亲和柱结合，用2信柱床体积以上的A液过柱至基线平稳，用B液（A液加入朱唑至浓度为50mmol/L)梯度习脱5—10个柱体体积，用AKATA Explore进行检

测，收集各洗脱液）。6、sGM—CSF融合蛋白的肠激酶切割及纯化。7、sGM—CSF融合蛋白及非融合蛋白的western Blot检测。 第五次课 一、基本概念 1.siRNA：

引导RNA：在RNAi的起始阶段，加入了dsRNA或内源性pre-miRNA被Dicer酶切割为19-23nt长的小分子，用于干扰dsRNA。

siRNA (Small interfering RNA)，是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。

2.miRNA：

大小约21-23个碱基的ssRNA，有具有发夹结构的约70-90个碱基的ssRNA前体经Dicer酶加工生成。是非编码RNA，参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。具有高度的保守型，时序性和组织特异性。

MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC），通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。

3.Dicer protein

RNaseⅢ家族成员之一，可特异识别dsRNA，以来ATP逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等方式引入的dsRNA（或pri-miRNA），将RNA降解为3’端有2个碱基突出的19-23bp的dsRNA（siRNAs）。

该酶是一种核糖核酸内切酶，属于RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(dsRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。 4.RISC

一种RNA-蛋白质复合物，通过与目标mRNA完全护着部分的互补配对来实施切割或者翻译抑制的功能。siRNA组装siRISC，miRNA组装miRISC。RISCs包括两种类型：切割型和不切割型，这由RISC当中的AGO蛋白决定。

RNA诱导沉默复合体（英语：RNA-induced silencing complex，RISC）：一种由siRNA与Argonaute蛋白和Dicer酶复合形成的复合物。在RNAi中，利用siRNA的反义链切割靶mRNA，达到基因沉默 5.PTGS

转录后基因沉默：在基因转录后的水平上通过对靶RNA进行特异性降解而使其失活。

二、请说明RNAi的作用机制

病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。

答：dsRNA进入细胞内，被一种具有类似RNase tlI活性的核酸内切酶Dicer结合，并被酶切成19～23nt的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)，在ATP的作用下，siRNA与由多种蛋白质结合形成且具有活性的RNA沉默复合物(RNA—in—duced silencing co1TIpiex，RISC)结合，RISC具有解螺旋酶的功能，使与其结合的siRNA双链解螺旋成单链，释放正义链，保留反义链，随后识别并结合细胞内与其反义链相互补的mRNA链。RISC将mRNA剪切成siRNA双链，降解mRMA，使靶基因表达沉默 。

三、请分析说明解释Su Guo的实验结果。

Su Guo的实验证明了导入一个目的基因的正义与反义RNA可以达到敲除某个基因的效果。因为该基因的野生型与突变型在胚芽时有对称与不对称的差异，所以她想从RNA共抑制现象（以前的研究结果）的基础上实现产生变异的效果，但是由于当时还没有研究清楚到底是哪种RNA起到了抑制的作用，所以她同时导入了正义与反义RNA，她当时的分析是反义的RNA可以特异性的与mRNA结合，从而阻止RNA的翻译以及以后的步骤，当然最后她成功了，用现在的科学成果进行分析和解释，由于她导入了正义与反义RNA，使得正义与反义RNA在细胞内特异性的互补形成了dsRNA，然后在被Dicer酶切割为干扰dsRNA，然后随着RISC形成并识别降解mRNA。

第六次课

1. 什么是基因表达？试述基因表达的特点及其调控对生物体的重要性？

1）基因表达︰从DNA到蛋白质的过程（是指原核生物和真核生物基因组中特定的结构基因所携带的遗传信息，经过转录、翻译等一系列过程，合成具有特定的生物学功能的各种蛋白质，表现出特定的生物学效应的全过程）但并非所有的基因表达都过程都产生蛋白质，rRNA tRNA编码基因转录产生RNA的过程也属于基因表达。

2）特点①组织特异性︰不同组织细胞中不仅表达的基因数量不同，而且基因表达的强度和种类也不相同。②阶段特异性︰细胞分化发育的不同时期，基因表达的情况不相同。③与环境相适应︰当周围的营养、温度、湿度、酸度及各条件变化时，生物体就要改变自身的基因表达状况，以调整体内执行和相应功能的蛋白质的种类、数量，从而改变自身的代谢活动度以来适应环境。（3）对生物体的重要性︰1、适应环境、维持生长和繁殖。2、维持个体发育和分化。

2. 真核生物中，基因表达受不同水平的调控，请列举三种。

A.转录前调控︰基因丢失；（原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物）转录前调控，非洲蛙蟾的卵母细胞中原有的rRNA基因约500bp，卵裂期和胚胎期需要大量的rRNA，基因会大量复制rRNA,使拷贝数达到200万倍，扩增约4000倍。基因扩增（gene amplification）；基因重排（gene rearrangement）。DNA的甲基化（DNA methylation）组蛋白修饰（Histone modification）/及组蛋白的修饰。

B.转录水平的调控︰转录调控是通过各种调控元件相互作用来实现的，调控元件主要包括顺式作用元件和反式作用因子。

C.转录后调控︰hnRNA的选择性加工运输；mRNA前体的选择性剪接；RNA编辑；RNAi。 D.翻译调控︰翻译因子的磷酸化调控；mRNA稳定性调控。 E.翻译后调控-蛋白质修饰。

3. 为什么说转录的调控是基因表达调控的中心环节？

答︰基因调控主要发生在转录阶段，尤其起始阶段，因为这些是表达的起始阶段，可以避免那些不需要的转录所造成的资源浪费。转录调控是通过各种调控元件相互作用来实现的，调控元件主要包括顺式作用元件和反式作用因子。而且转录起始是基因表达的基本调控点，涉及DNA序列调控蛋白及这些因素对RNA聚合酶活性的影响，顺式作用元件和反式作用因子之间相互作用，均在转录起始来表达，而转录后的加工修饰为RNA以及翻译及翻译后的蛋白质修饰都是以转录水平为基础的。

4.举例说明DNA甲基化与肿瘤的关系

答︰DNA甲基化是基因表达修饰方式之一，与基因表达调控密切相关，它能关闭一些基因的活性，而去甲基化能诱导基因的重新活化及表达。DNA甲基化修饰通过改变基因的表达，参与了细胞的生长、发育过程及X染色体失活等的调控。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA的稳定性、DNA与蛋白质相互作用方面的改变，从而控制基因表达。加计划的状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素。这种变化包括︰（1）整体甲基化水平降低；

（2）正常非甲基化CpG岛的高甲基化；（3）维持甲基化模式酶的调节失控。从而导致基因组的不稳定（如︰染色体的不稳定，可移动遗传因子的激活，原癌基因的表达）和抑癌基因的不表达。列如︰对家族性和散发型乳腺癌和结肠癌的研究中发现，家族性肿瘤中序列无突变的10个抑癌基因启动子区域甲基化常见，但在突变的抑癌基因中没有发现甲基化的现象。由此可见︰DNA甲基化模式的改变和肿瘤的发生、发展密切相关。 第七次课

1. 什么是表观遗传学？它主要研究什么内容？

答︰（1）基因的DNA序列不发上改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。不依赖于DNA序列的遗传现象。（2）①DNA甲基化修饰︰基因选择性转录表达的调控，主要表现为基因组DNA上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧啶由此被修饰为5-甲基胞嘧啶。②非编码RNA的调控作用︰miRNA调节大约30%的人类基因表达。miRNA可以通过靶向DNA或组蛋白修饰酶等表观遗传复合物而实现调节作用。siRNA通过诱导染色质的形成来实现对基因表达的调控。piRNA主要表现为在配子形成过程中对转座子元件的沉默作用，是生殖细胞发育所必须的。③组蛋白修饰︰构成核小体的组蛋白，氨基端可以被多种酶进行各种修饰，如磷酸化，乙酰化，甲基化和泛素化，组蛋白的这类修饰可以改变DNA-组蛋白的相互作用，是染色质的构型发生改变，称为染色质构型重塑。

2.什么是甲基化，在调控基因表达过程中起什么作用？

答：（1）从活性甲基化合物（如S-腺苷基甲硫氨酸）上催化其甲基转移到其他化合物的过程。可形成各种甲基化合物，或者是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。其中DNA甲基化是指在甲基化酶的作用下将一个甲基添加在DNA分子的碱基上，DNA甲基化修饰决定基因表达的模式，即决定从亲代到子代可遗传的基因表达状态。（2）甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节基因的表达和关闭，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。最常见的甲基化修饰有DNA甲基化和组蛋白甲基化。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则又到了基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。研究证实，CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化导致了人体1/3以上由于碱基转换而引起的遗传病。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基腺嘌呤(N6-mA)及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG序列、CpXpG、CCA/TGG和GATC中。DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DMT）的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等。但在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5ˊ-CpG-3ˊ的C上生成5-甲基胞嘧啶（5mC）。

3.什么是基因印记？它的主要特征是什么？

答：基因印迹，是表观遗传调节的一种形式，是指两个亲本等位基因的差异性甲基化造成了一个亲本等位基因的沉默，另一个亲本等位基因保持单等位基因活性。2.特征；a每一个印记基因簇由一个印记控制元件（imprint control element，ICE）所控制。B也称为印记控制区域（imprint control region，ICR）或者印记中心（imprint centre，IC）c绝大多数都有CpGislands，能够发生dna甲基化。D在CpGislands，内或附近常有成簇的、有向的重复片段。 第十次课

1.什么是细胞凋亡（Cell apoptosis）？

答：细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序死亡。

2.细胞凋亡有哪两条主要的途径？ 答：细胞凋亡信号转导的两大途径

A:由死亡受体（FAS、TNFR）介导的外源途径。在这条途径中，启动capase-8首先被激活。

B：线粒体介导的内源途径。在这条途径中，启动caspase—9首先被激活。

第十一次课 无

第十三次课 无

第十四次课

1.简述创伤修复的基本过程及每个过程的标志性细胞行为学事件。 创伤修复愈合的过程：止血-炎症反应-细胞增殖-组织重塑。

细胞反应：炎症细胞浸润至创伤区域是炎症期标志性特征；角化细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞迁移并增殖，血管新生，细胞外基质合成是细胞增殖期标志性特征；

2.简述TGF-β受体的激活，及其下游经典信号通路的活化。

TGF-β（转化生长因子-β）信号通路在调控干细胞活性和器官形成中发挥着重要的作用，当TGF-β信号通路各成员活性未激活时，体内会自发性发生多种癌症，这表明TGF-β定向调节干细胞对癌症形成也具有不可或缺的功能。TGF-β超家族包含接近30个生长和分化因子，其中有TGF-β s，活化素(activin)，inhibins和骨形态发生蛋白(BMPs) 。下游的跨膜TGF-β受体是多个SMAD蛋白，这些蛋白是TGF-β超家族信号传递的重要调控分子，并在不同层面上受多种多样精确的调控。 TGF-β与TGF-βII型受体（TGF-βRII）结合后，再激活募集TGF-β I型受体（TGF-β RI）组合后形成二聚体形式的受体复合物。TGF-β RII磷酸化TGF-β RI的甘氨酸-丝氨酸富集区域（GS序列）并活化TGF-β RI的丝氨酸/苏氨酸活性。活化的TGF-β RI反过来又磷酸化受体相关smad蛋白。脊椎动物中

目前发现的smad蛋白至少有9种，分别是(a)受体调节的Smads （R-Smads）：Smad 1,Smad 2, Smad 3, Smad 5, and Smad 8; (b)共调节Smads: Smad 4 and Smad 10;（c）抑制性Smads(I-Smads): Smad 6 and Smad 7。Smad 2,和Smad 3参与TGF-β和活化素信号通路，而Smad 1、Smad 5和Smad 8调节BMP信号通路。R-Smads和Smad 4 主要位于细胞质中，它们的活性主要受衔接蛋白调节，如Smad锚定受体激活蛋白（SARA）和ELF。Smad 2和Smad 3直接被TGF-β RI磷酸化, 使得构象发生改变从而从受体复合物中释放出来。Smad 4蛋白的MH2结构域识别R-Smads C端的磷酸丝氨酸从而形成异质二聚体复合物（R-Smad/C-Smad）。这些复合物转运至细胞核，核内Smad蛋白与同源DNA结合，吸附力较低，但在转录共激活因子的作用下可增强亲和性。Smad 3 和Smad 4 结合于称为SBE的DNA序列，而Smad 2 通过与Smad 4 的相互作用与DNA复合物反应。Smad蛋白在细胞质和细胞核间进行依赖性磷酸化的穿梭对于TGF-β信号的动态调控具重要意义。

第十五次课

1. 基因治疗与基因工程药物治疗有何区别?

基因治疗是指在基因水平上将正常有功能的基因或其他外源基因通过基因转移方式导入到患者体内，并使之表达，产生具有治疗作用的生物活性物质来治疗疾病，实质上可以看作是导入一个具有治疗作用的给药系统，甚至可将基因看作药物。而基因工程药物治疗是先将重组基因导入体外培养的细胞获得表达产物，再将表达产物导入患者体内，治疗疾病。简言之，基因治疗是给予基因，体内表达；基因工程药物治疗是体外表达，给予表达产物。

2. 何谓核酸疫苗，核酸疫苗有哪些优点?

核酸疫苗是编码保护性抗原的基因制成的疫苗。与传统疫苗相比，核酸疫苗具有以下优点 (1)能模拟活疫苗，免疫原性强，不存在用活疫苗时毒性回升的危险。 (2) 可获长期免疫力，避免传统疫苗反复加强免疫。 (3)对难纯化的活抗原可直接利用DNA疫苗在体内表达，省略了蛋白纯化分离的工作。 (4)采用同种不同株的保守DNA序列作核酸疫苗，具有交叉保护作用。

3. 细胞因子类药物的分类及其主要作用有哪些？

(1)干扰素 促进合成多种抗病毒的蛋白，抑制病毒的复制和病毒蛋白的合成；抑制某些肿瘤细胞，特别是病毒转化肿瘤细胞的生长，起到一定的抗肿瘤作用；很强的免疫调节作用。 (2)白细胞介素 介导白细胞间相互作用；与其他细胞如血管内皮细胞、纤维母细胞等发生相互作用，在细胞因子网络中发挥调节作用。 (3)集落刺激因子 参与造血调节过程；参与对调节成熟细胞，参与宿主抗感染免疫。 (4)肿瘤坏死因子 直接杀伤肿瘤细胞；激活免疫效应细胞。 (5)生长因子 促进不同细胞生长。

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