大肠杆菌和农杆菌感受态的制备

感受态制备

A 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）（《水稻NR和NIR基因启动子的克隆及功能验证》第38页）

1 材料、设备及试剂

1.1 材料

大肠杆菌DH5α、BL21、Rossette、JM109菌株

1.2试剂

LB液体培养基：

蛋白胨 10g/L

酵母提取物 5g/L

NaCl 10g/L

NaOH（1mol/L） 1mL/L

400mL 0.1M/L预冷的 CaCl2溶液（高温高压灭菌）

50%甘油

75%酒精

95%酒精

液氮

1.3 实验设备

接种环、酒精灯，打火机，75%酒精，95%酒精，50mL灭菌三角瓶4个，250mL灭菌的三角瓶4个，移液抢（5mL、200μL，1000μL），灭菌的枪头（5mL、200μL，1000μL），离心管（1.5mL，50mL）恒温摇床,灭菌锅，紫外分光光度计，超净工作台，制冰机，冰盒，高速冷冻离心机。

2 实验步骤

1、从新鲜培养的大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落，接种于5mL新鲜LB培液体养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。

2、培养12～16h，取1ml培养物加入到100mL新鲜LB培液体养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD=0.4~0.6(3~4h)

3、在无菌条件下将菌液转移到250mL离心管中，置于冰上10min.

4、于4℃，3000rpm离心5～10 min，弃上清，收集菌体。

5、加入20mL预冷的0.1M/L CaCl2溶液重新悬沉淀，至于冰上30min（严格）

6、于4℃，3000rpm离心5～10 min，弃上清，收集菌体。

7、加入4 mL0.1M/L CaCl2溶液及15%(最终浓度)甘油（50%的甘油1.71428 mL），重悬沉淀。

8、以100μL每管分装于1.5mL冻存管中保存于液氮。

3 试验结果

4 注意事项

感受态制备

B 大肠杆菌DH5α感受态的制备（《褐飞虱胰蛋白酶基因的克隆、异源表达及产物的生化特性研究》第9页）

1、将置于液氮（-80℃）保存的大肠杆菌在LB平板上划线，37℃培养活化。

2、挑取经活化的大肠杆菌单菌落于NZY液体培养基，18℃，200-250rpm培养。

3、当OD600=0.7-1.0时，用预冷的50mL离心管，4℃，4000离心10min，收集菌体。

4、用-20℃预冷的TB Buffer重悬菌体,4℃，3000离心10min，收集菌体

5、重复步骤4

6、用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体,缓慢加入DMSO(二甲基亚砜)至浓度7%。

7、冰浴10min，分装保存于液氮中备用。

感受态制备

C E.coli DH5α感受态细胞的制备及转化

1 目的

学习掌握CaCl2法制备感受爱的原理和方法

学习掌握感受态细胞转化的原理和方法

把前面实验的两个连接反应结果和一种商品质粒进行转化实验

2 原理

2.1名词概念

感受态细胞：处于接受外源DNA的生理状态的细胞

细胞转化：从遗传学出发，转化是特指以质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌细胞，并使其生物学特性发生可遗传的变化。

细胞感染：指以噬菌体、病毒作为载体构建的重组DNA导入细胞的过程，使细胞发生可遗传的变异，它是与细胞转化概念相对而定义的

细胞致敏：用理化方法诱导细胞进入感受态的操作过程

2.2 原理

培养至对数生长期的E.coli DH5α菌在0摄氏度经过低渗CaCl2溶液致敏处理，就可成为高效的感受态细胞，这种感受态细胞与质粒混匀置0摄氏度30min，混合物中的DNA形成DNase羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，再经42摄氏度短时热激以促进质粒进入细胞实现转化，利用质粒上的遗传选择标记在LB平板上进行初步筛选转化菌落

3 材料、试剂和仪器

3.1 材料

菌株E.coli DH5α

质粒pBS

实验6的两个连接反应结果

3.2 试剂

LB液体培养基：

蛋白胨 10g/L

酵母提取物 5g/L

NaCl 10g/L

NaOH（1mol/L） 1mL/L

固体LB培养基为在液体LB培养基中加1%琼脂粉

LB/Kan(50μg/mL)固体培养皿2个

LB/Amp(100μg/mL)固体培养皿3个

灭菌的0.1mol/L CaCl2

感受态制备

灭菌的去离子水

3.3 仪器用品

高速制冷离心机、超净台、42℃水浴、37℃培养箱、电子天平、制冰机、pH计、量筒（10mL,100mL,500mL,1000mL）烧杯（50mL,100mL,500mL,1000mL）、玻璃棒、镊子、微量移液器（1000μL，200μL）、吸头（1000μL，200μL）、1.5mL 离心管、平皿、灭菌锅及紫外分光光度仪等。

4 操作步骤

以下操作步骤要注意防止杂菌污染。

4.1

0~4℃保存菌种

↓

接种在LB,37℃250r/min,

↓

过夜菌：LB按1:30~100接种，37℃250r/min，活化培养2～3h，OD600=0.2~0.4

↓

加1.5mL菌液，放置冰上10min

↓

0~4℃，4000r/min，2min

↓

0~4℃，彻底弃上清的菌体

↓

加0.1mol/L CaCl2 0.6mL，缓和悬菌，放置冰上10min

↓

4000r/min，10min

↓

0℃彻底弃上清

↓

冰冷的0.1mol/L CaCl2 0.2mL，缓和悬菌，放置冰上待用

↓

分装在4个管中

冻融法制备农杆菌感受态（《水稻NR和NIR基因启动子的克隆及功能验证》第42页） 制备YER液体培养基，使Rif终浓度分别为50mg/l,混匀后于4℃保存

从YER平板挑取根癌农杆菌EHA105单菌落,接种于10ml YER液体培养基中，28℃，

感受态制备

200rpm振荡培养过夜。

取2ml培养液加到50ml YER液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养至OD=0.5~1.0，冰浴30min.

4、在无菌条件下降菌液分装于40ml离心管中，于4℃，5000rpm离心5 min，弃上清，收集菌体。

5、用10ml冰冷的20mmol.LCaCl2溶液重悬菌体，于4℃，5000rpm离心5 min，弃上清，收集菌体。

6、用0.5ml冰冷的20mmol.LCaCl2（含15%甘油）重悬菌体。

7、以100微升每管分装到预冷的1.5ml冻存管中，-80℃保存。

-1-1

农杆菌感受态的人制备（水稻MAPKK家族基因克隆及转基因研究第17页） 根癌农杆菌感受态细胞制备（OsMAPK4基因水稻突变体的培育及功能分析第16页）

1、挑取农杆菌LBA4404单菌落接种于5ml含有Sm50mg/L、Rif50mg/LYEB液体培养基中，28℃，200r/min振荡培养过夜（12小时）

2、取上述菌液按照1：10比例接种于50ml含有相应抗生素的YEB液体培养基中，200r/min振荡培养5～6小时，至OD600为0.5左右，

3、将菌液冰浴30min

4、分装至1.5ml离心管中，5000rpm离心5 min，弃上清。

5、用100微升的预冷的20mmol.L-1CaCl重悬菌体，于4℃保存备用。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/7owj.html