白介15

盛顿大学研究人员近日发现，特定类型的白细胞有助于消灭体内肿瘤。这些细胞便是CD8+ T细胞，T细胞是与免疫反应相关的血液细胞。

CD8+ T细胞的作用途径主要是通过免疫接种（即通常所说的癌症疫苗）来增加肿瘤反应T细胞的数量，或者通过在体外培养大量的肿瘤反应T细胞来治疗患者，也就是过继免疫疗法的治疗。

CD8+T细胞检测蛋白是一种抗原类物质，它在防御过程中起作用。如果肿瘤细胞中存在这样的抗原，CD8+ T细胞会将肿瘤细胞穿孔进而破坏它们的组成。然而，研究人员也在正常的身体组织中发现许多肿瘤抗原。因此，胸腺必须除去大量的肿瘤反应T细胞以保证不受自身的攻击。

CD8+ T细胞能识别这样的肿瘤抗原但会避开胸腺检测，因此具有潜在的危害性。

研究结果发表在2月13日出版的《自然医学》杂志过继性免疫治疗最新研究中。

由于肿瘤细胞相对于正常细胞而言，抗原的表达水平较高，因此体系的反应情况良好。一些T细胞能识别出肿瘤细胞并忽略过正常的

细胞，但检测发现这些CD8+ T细胞也在体内对肿瘤抗原的产生耐性机制，当它们缺乏时就会导致肿瘤细胞死亡。

研究结果清楚地显示，这些细胞可能在肿瘤治疗中产生显著疗效。白介素15能恢复CD8+ T细胞的耐受性，因此可将其用于过继性免疫治疗。（李雪华译）

白介素-15突变体在大肠杆菌中的克隆表达及鉴

定

苏 琴 王嘉玺 冯健男 王金惠 宋晓国 张明伟

［摘要］目的：构建两株IL-15末端缺失突变体以研究其N、C端对其功能的影响。方法：以pBV220为载体，在大肠杆菌中进行表达。表达产物以包涵体形式存在，经过SDS-PAGE纯化，复性，以CTLL-2增殖实验检测野生型及突变体的生物活性。结果：N端缺失突变体失去了增殖活性，而C端缺失突变体保持了对CTLL-2的生长刺激活性。

［关键词］白细胞介素类; 缺失突变体; 克隆;表达; CTLL-2增殖实验 ［中国图书资料分类法分类号］R392-33 ［文献标识码］A ［文章编号］1000-5501(2000)01-0012-04

Cloning and expression of IL-15 mutants in E.coli and its

identification

SU Qin WANG Jia-xi FENG Jian-nan WANG Jin-hui SONG Xiao-guo

ZHANG Ming-wei

（Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical

Sciences, Beijing 100850） ［Abstract］Objective: To construct two mutants in order to study IL-15 structure-function relationship, Methods: The mutant genes were cloned into pBV220 and were expressed in E.coli. The

recombinant IL-15 was purified and renaturated and its mutants were tested for bioactivity by CTLL-2 proliferation assay. Result: The results showed that N-terminus-deleted mutant lost its bioactivity, but C-terminus-deleted mutant kept this bioactivity. ［Key words］interlenkins; mutant ;cloning ;expression;CTLL-2

proliferation assay ▲

人白介素15(interleukin 15,IL-15)是Grabstein等［1］于1994年发现的一种结合人IL-2受体β、γ亚基的免疫因子。人IL-15不仅能够维持IL-2依赖的T细胞株CTLL-2的生长，对T淋巴细胞有激活和促生长作用［2］，还可以诱导B细胞增殖反应［3］;并且诱导外周血单个核细胞的LAK活性，同时也是NK细胞成熟过程中重要的因子,在免疫系统中起着重要的作用。IL-15有可能在肿瘤的免疫治疗、类风湿性关节炎治疗中发挥作用［4］。

为了研究IL-15结构与功能的关系，我们构建了两株突变体以分析IL-15 N、C端对IL-15活性的影响。对一系列人IL-2突变体的分析发现，其N、C端对其生物学活性影响较大，N端残基Asp20突变后活性急剧下降，周围氨基酸残基形成的微环境对人IL-2与受体的相互作用十分重要［5］；C端Gln126对活性影响较大，突变或缺失均很大程度地影响其生物学活性［6］，根据人IL-2突变实验结果，我们设计了人IL-15的两株突变体（N端缺失4个氨基酸、C端缺失3个氨基酸），在大肠杆菌中表达获得重组蛋白，通过对野生型与突变体生物活性的比较，分析了N、C端对IL-15生物活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

E.coli DH5α:supE44 ΔlacU169(φ80 lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-l relA1 为本室保存。质粒pBV220由中国预防医学科学院构建，本室保存。质粒pBVIL-15由本室构建并保存。 1.1.2 试剂

Taq酶和各种限制性内切酶分别购自华美公司及Promega 公司等。 dNTP为进口分装;回收试剂盒购自原平公司。

DNA 标志物：pBR322/Msp I购自华美公司。DNA引物为生工公司合成。

1.1.3 仪器

SE250 (Mighty smallII)型蛋白电泳仪为Hoefer公司产品；Labsonic U型超声仪为B.Braun公司产品；KF-2型恒温水浴槽为辽宁恒温仪器厂产品；超净工作台为北京半导体仪器设备一厂产品；薄层扫描仪为Dual-wavelength TLC-scanner cs-910；PCR仪为PE公司的GeneAMP PCRsystem2400；离心机分别为Sigma公司的2K15型及Beckman公司的 J2-MC型。

2 方法

2.1 PCR

以pBVIL-15质粒为模板，分别以如下两组引物进行扩增:(1)5′突变引物和3′引物；(2)5′引物和3′突变引物。首先94℃变性10 min，然后进行循环，94℃热变性1 min，43℃退火40 s，72℃延伸1 min，30次循环之后再72℃延伸7 min。 2.2 突变体基因的克隆

PCR产物及pBV220分别用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切,酶切产物纯化后用T4连接酶连接。然后连接产物转化DH5α,酶切鉴定挑取阳性克隆(图1)。

图1 表达质粒pBVIL15N端或C端缺失突变体的构建

2.3 阳性克隆的序列分析

由本院生物工程研究所用自动序列分析仪完成。 2.4 SDS-PAGE分析

重组子经42℃热诱导之后进行表达分析，重组子经超声裂解后进行表达产物的存在形式分析。 2.5 表达蛋白的纯化、复性

表达蛋白经制备SDS-PAGE纯化，经GSH/GSSG体系复性。 2.6 活性鉴定

MTT法检测IL-15及其突变体对CTLL-2增殖的刺激活性。

3 结果

3.1 突变体基因的扩增

IL-15全长编码序列克隆于pBV220之中，我们以pBVIL-15为模板，分别扩增N、C端缺失突变体序列。 引物序列如下:

5′端突变引物：CGGAATTCATATGGTAATA-AGTGATTTGAAA 5′端全长引物：CGGAATTCATATGAACTGG-GTGAAATGTA 3′端突变引物：CGGGATCCTTAGATGAACA-TTTGGACAAT 3′端全长引物：CGGGATCCTTAAGAAGTGT-TGATGAACAT 在5′端引入EcoRⅠ位点，在3′引入BamHⅠ位点，便于连入pBV220

载体。PCR反应后，电泳显示所获条带较特异，位于marker(pBR322/HinfⅠ)第4、5条带之间，大小合适。

图2 PCR产物鉴定

1.marker(pBR322/HinfⅠ)；2，3.5′端突变PCR产物；

4，5.3′端突变PCR产物

3.2 重组子鉴定

PCR产物与pBV220均用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后回收片段，载体，连接后转化DH5α的感受态细胞,挑选重组子，经酶切鉴定后，获得阳性重组子。阳性重组子均可切下大小合适的片段。说明5′端突变的PCR产物及3′端突变的PCR产物均已克隆于质粒pBV220中（图3）。 然后我们对重组子进行了序列分析，序列分析结果表明全长基因已如设计进行了突变，我们获得了目的突变。 3.3 mRNA结构预测及稳定性分析

用Goldkey软件，采用基于螺旋区随机组合的RNA二级结构预测方法对pBV200/IL-15，pBV220/IL-15 mut5，pBV220/IL-15 mut3的mRNA二级结构进行预测，在ATG前取30 bp，之后取39 bp，在TAA前取30 bp，之后取39 bp。5′突变引物△G=2.52 kJ/mol，5′全长引物△G=6.72 kJ/mol，3′突变引物△G=-50.4 kJ/mol, 3′全长引物△G=-47.04 kJ/mol。位于高表达范围内（G5≥-21.0 kJ/mol,-72.28 kJ/mol≤G3≤-47.80 kJ/mol）。

图3 重组子的酶切鉴定

1.标志物;2，3.pBV220/IL-15 mut5 EcoRⅠ+BamHⅠ;

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