《环境微生物的检测与分析》实验指导20150113

《环境微生物的检测与分析》实验指导

编者：吴方丽 李欧

浙江理工大学生命科学学院

二零一四年十二月 中国 浙江 杭州

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目 录

实验一 土壤微生物拮抗菌的分离与测数 ..................................... 3 实验二 拮抗菌的鉴定与保藏 .............................................. 14 实验三 变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析技术及其在微生物种群多样性研究中的应用 29 附录 各种培养基、试剂的配制 .............................................. 39

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实验一 土壤微生物拮抗菌的分离与测数

一、实验目的

1、熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。 2、初步掌握从土壤中分离微生物和测数的基本方法。 3、了解培养基的配制原理，掌握其配制过程和方法。 4、掌握实验室几种灭菌方法及技术。 5、掌握无菌操作技术。 6、了解平板菌落计数的原理。

7、识别土壤中几大类微生物的菌落特征。

8、学习拮抗作用的试验方法，观察微生物间的拮抗现象及抗生素的抗菌作用。

二、实验原理

自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类的微生物的混合体。为了研究某种微生物的特性或者要大量培养和使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离纯化。

在自然界中，土壤是微生物生活的良好环境，各种微生物混居生活在一起。其中生活的微生物的数量和种类极其丰富，因此土壤是人类开发利用微生物资源的重要基地。土壤中微生物的数量、种类与土壤肥力有关，肥沃的土壤中多，贫瘠的土壤中少。其生理类群则与土壤的其它理化性质，如通气性、pH有关。例如在通气良好的菜园土中，好气性微生物占有绝对优势。本实验以肥沃的菜园土为实验材料分离土壤中的好气性细菌、放线菌和霉菌，并进行数量测定。

分离微生物常用的方法有：稀释涂平板法、稀释混合平板法、划线分离法等。根据不同的实验材料可以采用不同的分离方法。其最终目的是在培养基上出现欲分离的微生物的单个菌落，必要时再对单菌落进行进一步的分离纯化。本实验分离细菌时采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、分离放线菌时采用高氏一号琼脂培养基、分离霉菌时采用马铃薯蔗糖琼脂培养基。

稀释平板计数法是根据微生物在固体培养基上一个活的单细胞繁殖能形成一个菌落这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个活的单细胞。计数时，首先将待

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测样品制成一系列稀释液，再取一定稀释度，一定体积的稀释液接种到平板中，使其均匀分布到平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，根据稀释倍数即可计算出样品中的含菌数。由于此方法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。一般用于某些产品检定，如根瘤菌剂等产品的检定，生物制品检验，土壤中可培养微生物含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验等方面。

拮抗作用是微生物之间普遍存在的一种相互关系。它是某些微生物生命活动中产生的一种特异性代谢产物─抗生素，具有抑制或杀死另一些微生物的作用。能产生抗生素的微生物称为抗生菌。

平板对峙法常用于拮抗菌对离体植物病原菌的拮抗作用的测定。其原理是，把抗生菌与供试病原菌同时置于同一培养基平板上，由于抗生菌对病原菌的拮抗作用，抗生菌菌落边缘与病原菌菌落边缘之间会产生一定的抑菌距离。抑菌距离越大，拮抗作用越强。

组织法常用于拮抗菌对活体植物病原菌的拮抗作用的测定，也可用于化合物的活性测定。其原理是把抗生菌所产生的抗菌物质预先接种于即将发病的植物组织上或接种在已发病的植物组织上，由于抗生菌所产生的抗菌物质对病原菌的拮抗作用，病原菌无法致病或延缓病原菌的致病作用。

三、实验材料

1、器材：电子天平、带有玻璃珠的三角瓶、摇床、1mL的无菌吸管、10mL的刻度试管、无菌水、搪瓷缸、玻璃涂棒、牛角匙、pH试纸、封口膜、记号笔、线绳、纱布、培养皿、高压蒸汽灭菌器、称量纸、药匙、试管架、涂布棒、酒精灯、超净工作台、火柴。

2、试剂和材料：无菌牛皮纸袋、无菌铲、标签、打孔器，镊子，牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、 葡萄糖、1mol/L NaOH、1mol/LHCl、75%酒精、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、蒸馏水、新鲜马铃薯、10%酚酞、乳酸。

四、实验步骤

（一）培养基的配制

（1）配制牛肉膏蛋白胨（NA）培养基

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基。

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配方如下：牛肉膏 3 g 蛋白胨 10g NaCl 5g 琼脂 15-20g 水 1000 mL pH 7.4-7.6

1、称量药品

按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入搪瓷缸中。牛肉膏和蛋白胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入搪瓷缸。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。

2、加热溶解

在搪瓷缸中加入少量少于所需的水量，然后放入锅中，在电磁炉上小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则需先调pH值后再溶解琼脂，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。

3、调pH

用pH试纸或酸碱度计检测培养基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaoH，边加边搅拌，并随时检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1 mol/l HCL进行调节。 pH调节通常放在加琼脂之前。注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。

4、过滤

液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。 5、分装

按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培养基约至试管高度的 1/5；分装入三角瓶内的以不超过其容积的一半为宜，半固体培养基以试管高度的1/3为宜。

6、加棉塞

试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要适合，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长3/5塞入试管口或瓶口内，以防止棉花脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽、塑料塞或封口膜代替棉塞。

7、包扎

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加塞后，将三角瓶的棉花外包一层牛皮纸或双层报纸，以防止灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把装同类培养基的试管扎成捆后，再于棉花塞外包一层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

8、灭菌

将上述培养基于121摄氏度湿热灭菌30 min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。

9、摆斜面

灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的长度不超过试管总长的1/2；待其凝固，

10、无菌检查

将灭菌的培养基放入37摄氏度温箱中培养24~48h，无菌生长即可使用。或储存于冰箱或清洁的橱内，备用。

（2）、配制高氏一号培养基

高氏一号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。

配方如下： 可溶性淀粉20g KNO3 1 g NaCl 0.5 g K2HPO4 0.5 g MgSO4·7H2O 0.5g FeSO4·7H2O 0.01 g 琼脂20g 蒸馏水1000mL pH7.4~7.6

1、 称量和溶解

先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入搪瓷缸中，并用少量冷水将其调成糊状，再加少许少量少于所需的水量，放入锅中在电磁炉上边加热边搅拌，至其完全溶解。对微量成分FeSO4·7H2O可先配制成高浓度的储备液后再加入，方法是先在100 ml 水中加入1g的FeSO4·7H2O，配成0.01 mg/ml的储备液，再在1000 ml的培养基中加入以上储备液0.1 ml即可。待所有的药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

2、pH 调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同上。 （3）配制马铃薯蔗糖培养基

马铃薯蔗糖培养基是用于分离真菌的选择培养基。

配方如下： 去皮的马铃薯 200g 蔗糖 20g 琼脂20g 蒸馏水1000mL，自然pH

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1、称量和溶解

先计算后称量，按用量称取各成分。将去皮的马铃薯切片后放入锅中，然后加少许少于所需的水量在电磁炉上加热20 min，然后用双层砂布过滤，滤液重新放入锅中煮沸，然后加入称量好的蔗糖和琼脂，待各成分溶解后，补充水分至所需体积。

2、同（2）2

（二）制备土壤稀释液 （1）取土壤

取表层以下 5~10 cm 处的土壤样品，放入灭菌的牛皮纸袋中，用铅笔填写好标签，袋内外各具一张。

（2）土壤预处理及保存

将采集的样品带回实验室平摊在聚乙烯塑料布上，在室温下阴干，土块捏碎，并检出植物根、茎、叶及石块等杂物，约20号筛筛分。土壤处理好后备用，或放在4摄氏度冰箱暂存。

（3）制备土壤稀释液（要无菌操作） 1、制备土壤悬液

取土样 5 g，迅速倒入带玻璃珠的45 mL无菌三角瓶中（玻璃珠用量以充满瓶底为最好），置摇床中振荡 5~10 min，使土样充分打散，即成 10-1 的土壤悬液。

2、稀释

用无菌移液管吸10-1 的土壤悬液0.5 mL，放入4.5 mL 无菌水中，震荡混匀即为10-2 稀释液，如此重复，可依次制成10-2 ~10-9 的稀释液。注意：操作时移液管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支移液管，每次吸土液，要将移液管插在液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。

（三）混菌测定菌落数的方法 1、细菌

取10-7，10-8，10-9三管稀释液各1ml，分别接入相应标号的平培养皿中，每个稀释度接三个培养皿。然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中（装量以铺满培养皿底的2/3为宜），迅速轻轻摇动培养皿，使菌液与培养基充分混均，但不沾湿培养皿的边缘，待培养基凝固即成细菌平板，倒平板时注意无菌操作。

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2、放线菌

取10-4，10-5，10-6 三管稀释液，在每管中加入10%酚液5~6滴，摇匀，静置片刻，然后分别从三管吸出1ml加入相应标号的培养皿中，选用高氏1号培养基，用与细菌相同的方法倒入培养皿中，便可制成放线菌平板。

3、霉菌

取10-1，10-2，10-3三管稀释液各1ml，分别接入相应的培养皿中，每个稀释度接三个平皿。在溶好的马铃薯蔗糖固体培养基中，每100ml加入灭菌的乳酸1ml，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入培养皿中，便可制成霉菌平板。

将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即培养皿盖朝下放置，于 28~30 摄氏度恒温培养，细菌培养 1~2d，放线菌培养 5~7d，霉菌 3~5d。可用于观察菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。

（四）稀释倒平板法测定菌落数的方法 1、倒平板

将牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基和马铃薯蔗糖培养基分别放入微波炉中熔化，将熔化好的培养基冷却至50摄氏度至超净工作台中倒入灭菌好的培养皿中，待冷却后编号备用。

2、吸取土壤稀释液

用无菌吸管吸取取10-7，10-8，10-9三管土壤稀释液各0.1 mL对号接种在不同稀释度编号的牛肉膏蛋白胨培养基平板上。每个编号设3个重复，用于分离细菌。

用无菌吸管吸取取10-4，10-5，10-6两管土壤稀释液各0.1 mL对号接种在不同稀释度编号的高氏一号培养基平板上。每个编号设3个重复，用于分离放线菌。

用无菌吸管吸取取10-1，10-2，10-3 两管土壤稀释液各0.1 mL对号接种在不同稀释度编号的马铃薯蔗糖培养基平板上。每个编号设3个重复，用于分离霉菌。

3、涂布平板

用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20~30min使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养。 注：无菌操作要点

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火焰消毒：在无菌环境中进行培养或进行其它无菌操作时，首先要点燃酒精灯。以后所有的操作，如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都要在火焰附近操作并经过灼烧进行。但要注意：金属器械不能在火焰中灼烧时间过长，以防退火，烧过的金属要待冷却后才能夹取物品，以防造成物品损伤。吸过营养液的吸管不能再次进行灼烧，因残留在吸管中的营养液能被烧焦成碳膜，再用时会把有害物带入培养液中。开启、关闭长有微生物的培养瓶时，火焰灭菌时间要短，防止温度过高烧死细胞。另外，有橡胶塞的试管也不能灼烧时间太长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养的微生物。

无菌操作：进行无菌操作前用75%的酒精擦拭超净工作台面及双手。进行无菌操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已经消毒的物品，如已接触，要用火焰灼烧或取备用品更换。为了拿取方便，工作台面上的东西要有合理的布局，原则上应将右手使用的东西放在右侧，左手使用的东西放在左侧，酒精灯放在中央。工作由始至终要保持一定的连续性，组织和细胞在未做处理前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；如果用过之后不再重复使用，应立即封闭瓶口直立。吸取各种液体时，均应分别使用吸管，吸管不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能向操作台面讲话或咳嗽，以免细菌或支原体带入工作台面发生污染。

（五）平板菌落计数

按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出每克土壤中的含菌数。

1、同一稀释度各个重复的菌落数相差不太悬殊。

2、细菌、放线菌以每培养皿30~300个菌落为宜，霉菌一每培养皿10~100个菌落为宜。

3、选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算。

混合平板计数法：

每g土壤样品含菌数=同一稀释度3次重复的菌落平均数×稀释倍数 稀释倒平板计数法：

每g土壤样品含菌数=同一稀释度3次重复的菌落平均数×10×稀释倍数 注：未知菌判断要点

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细菌菌落特征：细菌菌落大小不一，小的不到1 mm，大的可以铺满整个培养皿；菌落形状有圆形、不规则形、卷发状、假根状等；菌落的隆起形状有扩展、台状、低凸、乳头状等；有点菌落有光泽，有的没有；有的菌落较粘，有的较脆；菌落一般呈白色，少数为灰色、黄色、红色、绿色和棕色等。

放线菌菌落特征：放线菌的菌落质地致密，表面呈紧密的绒状、或坚实、干燥而多皱。由于基内菌丝长在培养基内，所以菌落与培养基结合紧密，不容易被挑起，或被挑起后不容易被破碎。当孢子丝形成大量的孢子而不满菌落表面时，使菌落呈絮状、粉末状或颗粒状，而与细菌菌落判然有别。此外，如用放大镜仔细观察，可以看见菌落周围有放射状菌丝。

霉菌菌落特征：霉菌菌落形态较大，外观干燥，不透明，呈现或松或紧的蛛网状、绒毛状、棉絮状或毡状；菌落与培养基间的连接紧密，不易挑取，菌落正面与反面的颜色、构造，以及边缘与中心的颜色、构造常不一致等。由于霉菌的细胞呈丝状，在固体培养基上生长时又有营养菌丝和气生菌丝的分化，而气生菌丝间没有毛细管水，故它们的菌落与细菌、酵母菌的不同，较接近放线菌。 （六）拮抗菌的筛选——平板对峙法 1、真菌与细菌

（1）NA培养基平板的制备：待NA培养基熔化后，冷却至手摸不烫时，取10mL刻度试管，趁热倒入培养基至10mL刻度，立即倒入9cm的培养皿中，制成厚薄均匀的培养基平板，备用。

（2）细菌接种：在无菌条件下，从分离的平板中接种细菌培养过夜、备用。 （3）真菌接种：用4mm打孔器从分离的平板上打制菌饼，然后将菌饼面朝下紧贴于PDA培养基接种到培养基平板一侧，然后加盖并标记（操作要迅速准确，菌饼放下后就不能够再移动）。于适宜温度（一般为25~28摄氏度）的培养室或培养箱中黑暗培养。

（4）结果检查：培养5~7天后，取出PDA平板，用卡尺测量真菌菌落和细菌菌落边缘之间的抑菌距离，单位为毫米（mm）。

2、真菌与放线菌

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（1）高氏一号培养基平板的制备：待高氏一号培养基熔化后，冷却至手摸不烫时，取10mL刻度试管，趁热倒入培养基至10mL刻度，立即倒入9cm的培养皿中，制成厚薄均匀的培养基平板，备用。

（2）放线菌接种：在无菌条件下，从分离的平板中接种放线菌培养2~3天，备用。 （3）真菌接种：用4mm打孔器从分离的平板上打制菌饼，然后将菌饼面朝下紧贴于PDA培养基接种到培养基平板一侧，然后加盖并标记（操作要迅速准确，菌饼放下后就不能够再移动）。于适宜温度（一般为25~28摄氏度）的培养室或培养箱中黑暗培养。

（4）结果检查：培养5~7天后，取出PDA平板，用卡尺测量真菌菌落和放线菌菌落边缘之间的抑菌距离，单位为毫米（mm）。

3、细菌与放线菌

（1）细菌菌悬液的制备：对分离得到的细菌，接种到NA液体培养基中，培养过夜，备用。

（2）高氏一号培养基平板的制备：待高氏一号培养基熔化后，冷却至手摸不烫时，取10mL刻度试管，趁热倒入培养基至10mL刻度，立即倒入9cm的培养皿中，制成厚薄均匀的培养基平板，备用。

（3）细菌接种：在无菌条件下，将制备好的细菌菌悬液涂布到高氏一号培养基平板，备用。

（4）放线菌接种：在无菌条件下，从分离的平板中接种放线菌与上述平板中央，然后加盖并标记。于适宜温度（一般为25~28摄氏度）的培养室或培养箱中黑暗培养。

（4）结果检查：培养2~3天后，取出平板，用卡尺测量细菌菌落和放线菌菌落边缘之间的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）。 （七）拮抗菌的保藏——短期保藏

对具有拮抗作用的细菌、放线菌、真菌分别接种到NA培养基平板、高氏一号培养基平板、PDA培养基平板，经培养后存放于4℃冰箱保存（保藏期限1~3个月），备用。

五、注意事项

1、称量药品后应做好标记，勿与其它药品混在一起，称完药品应及时盖紧瓶盖。 2、注意pH值不要调过头，以免影响培养基内各离子的浓度。

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3、应用记号笔在相应的位置注明培养基的名称、组别和日期。 4、放线菌的生长时间比较长，故制作平板时，培养基的量应多加一些。

5、观察菌落特点时应选择分离的较开的很大的菌落，对培养基和试管要编好号码，不要随意移动开盖，以免搞混菌号获受到污染。

6、实验完成后，应即时对实验数据进行收集、处理。

7、在利用平板对峙法分析真菌与细菌、真菌与放线菌之间是否有拮抗作用时，接菌后菌丝块勿移动。

六、结果分析

1、对菌落数进行观察记录，填入下表。并计算每克土壤中不同种类微生物的数量，并与理论值进行比较分析。

天 第一天 浓度 10-1 10-2 10-3

高氏一号 培养基

10-4 10-5 10-6

NA 培养基

10-7 10-8 10-9

① ②

第二天 ①

②

第三天 ①

②

第四天 ①

②

第五天 ①

②

第六天 ①

②

培养基 PDA 培养基

2、平板对峙法结果分析

记录实验结果，分析真菌与细菌、真菌与放线菌之间是否有拮抗作用？

七、思考题

1、固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？ 2、培养基中加琼脂的作用是什么？

3、干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌的场合有何不同？

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4、如何检查培养基灭菌是否彻底？ 5、平板培养时为什么要把培养皿倒置？

6、在划线分离时，为什么每次都需要将接种环上的剩余物烧掉？ 7、总结几种接种技术的要点及注意事项。 8、分离不同类群的微生物为何要选不同的稀释度？

9、稀释平板分离测数法与血球计数板测数法各有何优缺点？ 10、何为拮抗作用？举例说明微生物与微生物之间的拮抗关系。

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实验二 拮抗菌的鉴定与保藏

一、实验目的

1、掌握微生物菌种鉴定的常规方法。 2、掌握微生物菌种的保藏方法。

二、实验原理

微生物菌种鉴定对于更好的认识和利用微生物菌种具有重要的理论和实践意义。目前常用的菌种鉴定方法包括形态学观察、生理生化特性鉴定、BIOLOG碳源自动分析鉴定、分子生物学鉴定、API细菌数值鉴定、功能性分析及功能基因、RAPD、SSCP、TLC薄层层析、全细胞脂肪酸分析鉴定、（G＋C）mol％测定、DNA/DNA同源性测定等。

（1）常规鉴定

常规鉴定内容有形态特征和理化特性。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等。 （2）BIOLOG碳源自动分析鉴定

BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。

（3）分子生物学鉴定

应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。可采用核酸序列分析法分析细菌16S

rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列。

（4）API细菌数值鉴定系统

API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。 （5）功能性分析及功能基因

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目前通过木聚糖酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、β-甘露聚糖酶等功能基因的克隆进行菌种产酶的功能性分析。应用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌种鉴定，在某些种、亚种、株间有较好的分辨效果。 （6）RAPD、SSCP技术

采用随机扩增多态性DNA（Randomly amplified polymorphism DNA，RAPD）技术和单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）技术对微生物菌株进行鉴别。如采用RAPD技术能够对同一菌种原始菌株与诱变菌株进行鉴别，对诱变菌株知识产权保护具有重要意义；采用SSCP技术进行工业酒精酵母菌株的鉴别，此技术结合菌株发酵特性，在酒类生产的质量控制方面起到积极作用 （7）TLC薄层层析

TLC薄层层析技术应用于微生物菌种鉴定，进行细菌、放线菌细胞壁化学组分分析（氨基酸、糖），作为划分属特征的重要鉴定技术手段，起到了良好的辅助作用。 （8）全细胞脂肪酸分析鉴定系统

采用Sherlock全自动细菌鉴定系统，通过对不同菌株的脂肪酸图谱进行分析，并与标准数据库进行比对，来鉴定细菌及酵母。该技术是细菌或酵母种水平鉴定的有效手段之一。

（9）（G＋C）mol％及DNA/DNA杂交

采用DU800核酸蛋白分析仪测定Tm值，从而得到微生物菌株的（G＋C）mol％，并与模式菌株进行DNA/DNA同源性分析，该鉴定技术手段是多相鉴定的重要组成部分。

三、实验材料

1、器材：电子天平、带有玻璃珠的三角瓶、摇床、1mL的无菌吸管、10mL的刻度试管、无菌水、搪瓷缸、玻璃涂棒、牛角匙、pH试纸、封口膜、记号笔、线绳、纱布、培养皿、高压蒸汽灭菌器、称量纸、药匙、试管架、涂布棒、酒精灯、超净工作台、火柴。

2、试剂和材料：无菌牛皮纸袋、无菌铲、标签、打孔器，镊子，牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、 葡萄糖、1mol/L NaOH、1mol/LHCl、75%酒精、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、蒸馏水、新鲜马铃薯、10%酚酞、乳酸。

四、实验步骤

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（一）菌落形态（群体形态）的观察

观察不同细菌、放线菌、真菌生成菌落的形态特点。观察内容主要有菌落大小、形状、表面、质地和颜色等方面。其中，菌落的大小可量取其直径；形状指圆形或不规则形等；表面指凸起或平展、有无光泽以及是否光滑等；质地指粘、脆而言，可用接种针挑取菌落，试验是否容易挑取。

（二）细胞形态（个体形态）观察 1、细菌细胞形态观察

（1）区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、有无鞭毛和糖被； （2）观察细菌的形状（如球形、杆形、螺旋形等）； （3）菌体排列方式。 革兰氏染色步骤： （1） 涂片

取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央， 用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。

（2） 干燥

将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水 分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

（3） 固定：

固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回 通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。

（4） 初染

加草酸铵结晶紫染色液一滴，染色约1 min，水洗。水洗时用木炭夹夹住载玻片的一端，斜置载玻片，用细小的缓水流自标本的上端流下，洗去多余的染料，勿使水流直接冲洗涂菌处，直到流下的水为无色为止。将标本置于桌上风干，也可用吸水纸轻轻地吸去水份，或微微加热，以加快干燥速度。

（5） 媒染

滴加碘液冲去残水，复染约1 min，水洗。

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（6） 脱色

将载玻片上的水用吸水纸轻轻地吸干净，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20~30 s，立即用水冲净酒精。

复染

用番红染色液染2~3 min，水洗，干燥。 （7） 镜检

干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

鞭毛染色步骤：

鞭毛染色——硝酸银染色法 硝酸银染色液配制如下：

A液：单宁酸5.0g，FeCl3 1.5g，福尔马林(15%) 2.0mL，1%NaOH 1.0mL，蒸馏水100mL。

B液：AgNO3 2.0g,蒸馏水100mL。 （1） 载玻片准备：

将载玻片用洗衣粉洗涤后，置于95%的乙醇溶液中浸泡20min，使用时取出再火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。

（2） 制片：

取一块载玻片，在一端滴一滴蒸馏水，用接种环无菌操作从斜面上挑取菌种在载玻片液滴上轻轻蘸一下，使液滴表面形成一薄层菌膜，随后倾斜玻片，使悬菌液缓慢流向另一端，用吸水纸在载玻片边缘处吸去多余菌悬液，自然干燥。

（3） 染色：

滴加硝酸银染液A液覆盖菌面3-5min后用蒸馏水充分洗去A液，之后用B液洗去残留水分，再滴加B液覆盖菌面数秒至1min，其间可用微火加热，当菌面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗，自然干燥。

（4） 镜检：

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先低倍，再高倍，最后用油镜检查，菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。 荚膜染色步骤：

推荐以下四种染色法，其中以湿墨水方法较简便，并且适用于各种有荚膜的细菌。如用相差显微镜检查则效果更佳。

负染色法：

（1）制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取少量菌体放入水滴中混匀并涂布。

（2）干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。 （3）染色：在涂面上加复红染色液染色2—3min。 （4）水洗：用水洗去复红染液。

（5）干燥：将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。

（6）涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使黑素沿玻片边缘散开，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干。

（7）镜检：先低倍镜，再高倍镜观察。 结果：背影灰色，菌体红色，荚膜无色透明。

湿墨水法

（1）制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。 （2）加盖玻片 放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液。

（3）镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察。

结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。 干墨水法

（1）制菌液：加1滴6%葡萄糖液于洁净载玻片一端，挑少量胶质芽胞杆菌与其充分混合，再加1环墨水，充分混匀。

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（2）制片：左手执玻片，右手另拿一边缘光滑的载玻片，将载玻片的一边与菌液接触，使菌液沿玻片接触处散开，然后以30度角，迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端，使菌液铺成一薄膜。

（3）干燥：空气中自然干燥。

（4）固定：用甲醇浸没涂片，固定1 min，立即倾去甲醇。 （5）干燥：在酒精灯上方，用文火干燥。 （6）染色：用甲基紫染1—2min。 （7）水洗：用自来水轻洗，自然干燥。

（8）镜检：先用低倍镜再高倍镜观察。 结果：背景灰色，菌体紫色，荚膜呈一清晰透明圈。

Tyler法

（1）涂片：按常规法涂片，可多挑些菌体与水充分混合，并将粘稠的菌液尽量涂开，但涂布的面积不宜过大。

（2）干燥：在空气中自然干燥。 （3）染色：用Tyler染色液染5—7min。

（4）脱色：用20%CuSO4水溶液洗去结晶紫，脱色要适度（冲洗2遍）。用吸水纸吸干，并立即加1—2滴香柏油于涂片处，以防止CuSO4结晶的形成。

（5）镜检：先用低倍镜再用高倍镜观察。观察完毕后注意用二甲苯擦去镜头上的香柏油。 结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。

2、放线菌细胞形态观察

插片法观察放线菌的基内菌丝、气生菌丝以及孢子丝的着生状态，并绘图。 （1）倒平板

将高氏1号培养基熔化后，倒10~12 mL左右于灭菌培养皿内，凝固后使用。 （2）插片

将灭菌的盖玻片以45度角插入培养皿内的培养基中，插入深度约为盖玻片的1/2或1/3。

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（3）接种与培养

用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿线，放置28 ℃培养箱内培养3～7 天。

（4）观察

培养后菌丝体生长在培养基及盖玻片上，小心用镊子将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一面的菌丝体，将生长良好的菌丝体面向载玻片，压放于载玻片上。直接在显微镜下观察。

3、霉菌细胞形态观察

水浸片法观察霉菌的基内菌丝、气生菌丝以及气生菌丝的特化状态，并绘图。 水浸片法 （1） 制片

取干净载玻片一张，于中央滴加乳酸石碳酸棉蓝液一滴，用解剖针从菌落边缘划取菌丝体一小块，放入乳酸石碳酸棉蓝液中，小心地加盖玻片一张，并轻压盖玻片（勿使产生气泡）

（2） 镜检

在低倍镜或高倍镜下观察。观察时注意菌丝体有无隔膜、假根、足细胞等特殊构造，并观察孢子的形态、大小和着生方式。

（三）生理生化特性鉴定 1、细菌

由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。

(1) 淀粉水解试验：

在含2%淀粉的牛肉膏蛋白胨琼脂固体培养基上接种细菌，培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。

(2) 糖发酵试验：

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不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。酸在加入溴甲酚紫指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。

操作步骤：

A、用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌菌名。 B、取葡萄糖发酵培养基试管多支，分别接入各待测菌 并做一支不接种的对照。 在接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。

C、将接种过和作为对照的6支试管均置37℃培养24～48h。

D、观察德汉氏小管中有无气泡并加入指示剂后观察各试管颜色变化。 IMVC实验

用来测定菌的生理生化特征的4个实验，I:吲哚试验；M: 甲基红试验； V:V.P.试验；C:柠檬酸实验，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。

（1） 吲哚试验：

① 试验菌用蛋白胨水培养基37℃培养24小时.

② 在培养液中加入乙醚1ml(使呈明显的乙醚层)充分振荡,使吲哚试剂溶于乙醚.静置片刻,待乙醚浮于培养液上面时沿管壁慢慢加入吲哚试剂10滴.呈玫瑰红的为阳性,不变色的为阴. (注:加入吲哚试剂后,不可再摇动,否则红色不明显)

（2） 甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者

进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，使培养液pH值降至4.5以下，加入甲基红后溶液呈红色。

① 试验菌用葡萄糖蛋白胨培养基37℃培养24小时。

② 沿管壁加入M.R.(甲基红)试剂3-4滴.红的为阳性,黄的为阴性。 （3） V.P.试验

① 试验菌用葡萄糖蛋白胨培养基37℃培养24小时。

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② 加入40%KOH 10-20滴,再加入等量α-茶酚,用力振荡(拔去棉塞)再放入37℃4h后再观察,仍无色产生为阴。

（4） 柠檬酸实验

① 将试验菌培养在柠檬酸盐培养基斜面上37℃培养24-28小时. ② 观察有无细菌生长与培养基颜色变化.如果含有溴麝香草酚蓝的斜面蓝色者为阳性反应,呈绿色的为阴性反应;含苯酚红的斜面如果呈红色为阳性反应,呈黄色为阴性反应.

2、放线菌

牛奶凝固与胨化：将供试放线菌接入灭菌脱脂牛奶中，28℃下培养，在5、10、15、20、25d各观察1次。参考对照记录凝固和胨化情况。

明胶液化：将供试放线菌菌种接种于灭菌明胶培养基表面。28℃下培养，在5、10、20、30d各观察1次。观察前将试管在自来水槽中冷却20min。待对照完全凝固后，再观察记录其液化过程。

淀粉水解：用点接法将供试放线菌菌种点接在淀粉水解培养基平板上，培养7d后，将碘液滴在培养基上。测量菌落和水解圈直径。

纤维素分解：将菌种接种在试管中的一半浸在无碳源合成培养基内的滤纸条上，28℃下培养，第30天时观察。

（三）分子生物学鉴定

菌种鉴定一般就只要提取基因组DNA，然后PCR扩增16srDNA片段，上GeneBank对比即可。一般序列相似度在97%以上就可以认为是同种细菌（当然也有例外，DNA序列仅仅是一个参考指标）

细菌基因组DNA的提取与纯化

（1）摇菌过夜30℃、180r/min摇床振荡培养8~12h；

（2）沉淀菌体，取菌液于1.5mL EP管中5000r/min离心5min，无菌水洗涤1~2次；

（3）400μL TE重悬菌体，加入20μL溶菌酶（50mg/ml），37℃过夜；

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（4）加400μL CTAB提取液，轻轻摇匀，65℃水浴40min（每10min轻摇一次）； （5）冷却至室温，加400μL酚-氯仿(1:1)，轻轻摇匀，12000r/min，4℃离心10min； （6）吸取上层清液，加400μL氯仿，轻轻摇匀，12000r/min，4℃离心10min； （7）吸取上层清液，加入等体积冰冻异丙醇，轻轻摇匀，-20℃静置30min~24h沉淀DNA，12000r/min，4℃离心20min；

（8）小心倒掉水相，75%乙醇洗涤2次，风干。

（9）200μL TE溶解沉淀，加入20μL RNA酶（20mg/ml），37℃保温30min，以等体积的酚-氯仿和氯仿各抽提一次；

（10）吸取上清液，加入1/10体积3mol/L NaAc（pH5.2）和2倍体积的无水乙醇，轻轻摇匀至出现絮状沉淀，1000r/min离心30min；

（11）倒掉上清液，用75%乙醇洗涤DNA沉淀2次，风干。加入20~30μL TE缓冲液，-20℃保存待用。

16S rDNA的扩增和序列测定

将提出的基因组DNA进行琼脂糖电泳检测，验证有目的产物后，用特定的引物进行16S rDNA的分离及PCR扩增，并电泳检测，将样品放入4℃保存待用。

扩增条件： Step1 Step2 Step3 Step4 Step5 Step6 扩增体系：

样品DNA

1 μL

94℃ 94℃ 57℃ 72℃ GOTO Step2 72℃

5 min 30 sec 40 sec 90 sec 32循环 10 min

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10×Taq buffer 2.5 mmol/L dNTP 引物1：1495 R 引物2：27 F Taq酶（2.5 U/μL） 加双蒸水

（四）菌种的长期保藏

1.5 μL 1.3 μL 0.5 μL 0.5 μL 0.4 μL 15 μL

无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。

1、斜面低温保藏法

将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4℃冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。这一改进可使菌种的保藏期延长。

该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。

2、石蜡油封藏法

此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端lcm，使培养物与空气隔绝，加

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胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。

由于液体石蜡阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而且又防止了水分挥发，使培养物不会干裂，因而能使保藏期达1～2年，或更长。这种方法操作简单，它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等，对霉菌和酵母菌的保藏效果较好，可保存几年，甚至长达10年。但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差，尤其不适用于某些能分解烃类的菌种。

3、砂土管保藏法

这是一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的放线菌、霉菌及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的细菌如奈氏球菌、弧菌和假单胞杆菌及酵母则不适用。

其制作方法是，先将砂与土分别洗净、烘干、过筛(一般砂用60目筛，土用120目筛)，按砂与土的比例为(1～2)：1混匀，分装于小试管中，砂土的高度约1cm，以121℃蒸汽灭菌1～1.5h，间歇灭菌3次。50℃烘干后经检查无误后备用。也有只用砂或土作载体进行保藏的。需要保藏的菌株先用斜面培养基充分培养，再以无菌水制成108～1010个/ml菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约2～4h，用火焰熔封管口(或用石蜡封口)，置于干燥器中，在室温或4℃冰箱内保藏，后者效果更好。

砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物移接方便，经济简便。它比石蜡油封藏法的保藏期长，约1～10年。中国科学院微生物研究所用砂土管保藏法保藏放线菌。

4、麸皮保藏法

麸皮保藏法亦称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥条件下保存。其制作方法是按照不同菌种对水分要求的不同将麸皮与水以一定的比例1：(0.8～1.5)拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔封，再保藏，则效果更好。

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此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏期在1年以上。因操作简单，经济实惠，工厂较多采用。中国科学院微生物研究所采用麸皮保藏法保藏曲霉，如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等，其保藏期可达数年至数十年。

5、冷冻真空干燥保藏法

冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。

由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。但该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。

保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。

6、甘油管低温保藏法

A、将要保存菌种接种于LB液体培养至对数生长期（肉眼见培养体系内浑浊即可）； B、将甘油稀释至浓度为50%（等体积蒸馏水加等体积甘油，甘油需要慢慢吸）； C、将甘油、2 ml离心管、枪头等试验用品于121℃灭菌20min

D、无菌条件下将菌液与50%浓度甘油1:1等体积混合于离心管中，甘油终浓度为25% 5 于-20℃或-80℃冰箱内保存

7、液氮超低温保藏法

液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。美国ATCC菌种保藏中心采用该法时，把菌悬液或带菌丝的琼脂块

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经控制致冷速度，以每分钟下降1℃/min 的速度从0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。如果降温速度过快，由于细胞内自由水来不及渗出胞外，形成冰晶就会损伤细胞。据研究认为降温的速度控制在(1～10)℃/min，细胞死亡率低；随着速度加快，死亡率则相应提高。

液氮低温保藏的保护剂，一般是选择甘油、二甲基亚砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊环、吐温80等，但最常用的是甘油（10%～20%）。不同微生物要选择不同的保护剂，再通过试验加以确定保护剂的浓度，原则上是控制在不足以造成微生物致死的浓度。

此法操作简便、高效、保藏期一般可达到15年以上，是目前被公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。除了少数对低温损伤敏感的微生物外，该法适用于各种微生物菌种的保藏，甚至连藻类、原生动物、支原体等都能用此法获得有效的保藏。此法的另一大优点是可使用各种培养形式的微生物进行保藏，无论是孢子或菌体、液体培养物或固体培养物均可采用该保藏法。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。

要使用菌种时，从液氮罐中取出安瓿瓶，并迅速放到35～40℃温水中，使之冰冻熔化，以无菌操作打开安瓿瓶，移接到保藏前使用的同一种培养基斜面上进行培养。从液氮罐中取出安瓿瓶时速度要快，一般不超过1min，以防其他安瓿瓶升温而影响保藏质量。并且取样时一定要戴专用手套以防止意外爆炸和冻伤。

五、注意事项

1、革兰氏染色是载玻片要洁净无油滴，滴水和取菌不宜过多，涂片是量应少而薄，并且要涂抹均匀，但不要反复涂布。固定时应注意防止温度过高，以玻片背面不烫手为宜。用水冲洗时不要 直接冲在样品涂布面上，而应使水从载玻片一端流下，且水流要缓慢，不宜过急、过大。

2、荚膜染色时，荚膜薄，含水量在90%以上，易变形，在制片过程中不能用加热方法固定，以免荚膜皱缩变形。墨汁负染色法时加盖玻片不要有气泡，否则会影响观察。

3、培养放线菌时要注意，放线菌的生长速度较慢，培养期较长，在操作过程中应特别注意无菌操作，防止杂菌污染。

4、霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以制作标本时常用乳酸石碳酸棉蓝染色液。

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六、思考题

1、细菌利用糖类的过程中，产生的酸性物质和气体可能是什么？ 2、如果区别细菌、放线菌、霉菌菌落？

3、在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？ 4、淀粉水解的原理是什么？本方法是否适用于所有的微生物？ 5、菌种保藏工作的重要意义何在？各方面的基本原理是什么？

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实验三 变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析技术及其在微

生物种群多样性研究中的应用

一、实验目的

1、了解并掌握变性梯度凝胶电泳的原理。

2、掌握变性梯度凝胶电泳分析植物内生菌种群多样性。

二、实验原理及其应用

1、实验原理

变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）是一种根据DNA片段在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60 ℃，变性剂0~100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。许多研究表明变性递度凝胶电泳分离能力很强，它可以把相差仅1bp 的DNA 片段分开。

为了提高DGGE的突变检出率，可以人为地加入一个高熔点区——GC夹。GC夹（GC clamp）就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构，这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%。 作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：

（1）突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上；

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（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段；

（3）非同位素性。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害；

（4）操作简便、快速。DGGE一般在24小时内即可获得结果；

（5）重复性好。但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。

2、应用

1993年Muzyers首次将DGGE技术应用于分子微生物学研究领域，目前已经被用于活性污泥生物膜、土壤、底泥等环境样品中的微生物多样性检测和种群演替的分析。该技术已经成为微生物群落动态和多样性分析的最有力工具之一。DGGE可以分辨出长度相同但序列不同的DNA片段，通过分离直接从样品中扩增出的16S rDNA片段分析群落结构。活性污泥在废水处理过程中被广泛应用，污泥中的菌群直接影响处理效果，只有了解微生物群落多样性和动态性等信息，才能提高对处理系统的控制能力。活性污泥微生物种类极其丰富，只有0.1%——1%的微生物种类通过常规方法能被培养，若以这极少部分的微生物来代表环境和处理系统中复杂的微生物群体将导致极大的误差。因此，用传统的微生物培养和鉴定方法不足以代表微环境中的真实情况。

该技术直接从样品中提取包括可培养和不可培养微生物在内的总DNA，再经过PCR扩增、电泳、统计分析，提供群落中优势种类信息和同时分析多个样品，具有可重复、快速和操作简便等优点，广泛应用于土壤、活性污泥等环境微生物生态以及植物内生菌多样性的研究中。

三、实验材料

1、实验材料 生长健壮的植株。 2、实验仪器

PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、变性梯度凝胶电泳仪（仪器型号：Decode Universal Mutation Detection System）、凝胶成像及分析系统、高速离心机。

3、实验试剂 （1）CTAB-NaCl

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4.1 g NaCl称溶解在80 mL水中，再缓慢加入10 g 的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热65℃溶解搅拌，定容至1000 mL。

（2）50×TAE 缓冲液

121 g Tris，18.6 g EDTA，量取28.6 mL冰醋酸，加水至500 mL，pH 8.5。 （3）10% APS（过硫酸铵贮存液）

10 mL 配制：1g 过硫酸铵加水至10mL 。 （4）TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺) 10% APS：TEMED = 4.5：1

（5）变性剂贮存液(0%)：6%丙烯酰胺

100 mL 溶液：15 mL 40% Arc/Bis，2 mL50×TAE 缓冲液，加水至100 mL。 （6）变性剂贮存液(100%)：6%丙烯酰胺

15 mL 40% Arc/Bis；2 mL 50×TAE 缓冲液；40 mL去离子甲酰胺；42 g尿素，加水至100 mL。

（7）溴化乙锭EB溶液

50mg溴化乙锭溶于100ml双蒸水，工作浓度为0.5μg/ml，避光保存。 （8）固定液1

50 mL无水乙醇加入去离子水至500 mL。 （9）固定液2

5 mL硝酸加入去离子水至500 mL。 （10）0.12%银染试剂

0.18g AgNO3加入去离子水至150 mL，同时加入110 μL 37%-40%的甲醛混匀即可，需新鲜配制。

（11）显色液

4.5g Na2CO3加入去离子水至150 mL，需新鲜配制，4℃冰箱保存备用，用前加入75 μL甲醛构成显影液。

（12）终止液

15 mL冰乙酸加入去离子水至500 mL。 4、PCR扩增引物

第一轮PCR引物：fM1: 5’-CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT-3’ 和rC5:

31

5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’

f515-GC:

5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGCACGGGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’ 和rC5: 5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’

四、实验步骤

（一）样品采集及预处理

采集生长健壮的植株并及时处理样品，先用流水将植株表面的基质冲洗干净，用吸水纸把植株表面的水分吸干，样品的根、茎、叶2 g（用于提取总基因组），进行标记。在超净工作台内，首先用无菌水清洗两次，每次约1 min；再用70-75%（V/V）的酒精进行消毒处理20 sec，用3% NaClO消毒液浸泡2 min，最后用无菌水清洗三次，放进无菌瓶中备用。

（二）基因组提取及PCR扩增 1、总基因组的提取

采用改良的CTAB法提取植物样品的总基因组DNA，方法如下：

（1）将预处理后的2 g样品在无菌研钵内用液氮充分研磨至细粉末状，称取0.2 g样品装入1.5 ml 无菌的eppendorf管中。

（2）加入1 mL CTAB提取液（65℃预热），立即混匀，65℃水浴90 min，每间隔20-30 min轻轻颠倒eppendorf管混匀一次，12000 rpm 4℃离心10 min。

（3）取上清，加2/3体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒数次充分混匀，12000 rpm，4℃，离心10 min，如此重复至上层变澄清。

（4）取上清，加2/3体积的氯仿/异戊醇（24：1），颠倒数次充分混匀，12000 rpm，4℃离心10 min。

（5）取上清，加1/10体积的NaAC溶液和1个体积的无水乙醇（-20℃预冷），在-20℃下沉淀30 min以上，8000 rpm离心5 min。

（6）弃上清，用70%酒精洗涤沉淀2次，8000 rpm离心5 min，真空干燥15 min。 （7）加50 μL TE溶液或ddH2O溶解DNA，取5 μL 上样，1%琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存。

2、16srDNA基因序列的PCR扩增

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巢式PCR（Nested PCR）是使用两对PCR引物扩增目的DNA片段，第二对引物称为巢式引物，扩增的目的片段包含在第一次PCR扩增片段的内部，保证第二次PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增。因为第二对引物要用于DGGE电泳分析，根据DGGE电泳的原理，上游引物的5’端加上一段40 bp 左右的GC碱基序列（5’-CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG-3’）。

巢式PCR第一次PCR以总基因组为模板，扩增出内生菌的目的基因片段，第二次PCR以第一次PCR产物为模板，并且退火温度较高。

反应体系如下：

10×PCR Buffer dNTP Mixture(10 mM) Primer1 (10 pmol/μL) Primer2 (10 pmol/μL) DNA模板 Taq （5 U/μL） ddH2O Total

反应条件为：

94℃ 794℃ 50℃ 72℃ 2℃

4min 1min 1min 1min 8min

2.5 μL 0.5 μL 1.0 μL 1.0 μL 1.0 μL 0.2 μL 18.8 μL 25 μL 30cycles 33

8℃ ∞

（三）DGGE电泳

采用Decode Universal Mutation Detection System（Bio-Rad，USA）对PCR扩增产物进行电泳分离。具体步骤如下：

1、胶槽的组装

先用95%乙醇清洗两块玻璃板及两个间隔条，再用蒸馏水清洗一遍，干燥。将间隔条置于大玻璃板两侧边缘并且缺口处放在内侧，再将小玻璃板放在上面并与之对齐，用夹子将两块玻璃板固定，并调水平及垂直平衡。

2、DGGE胶的制做

采用6%丙烯酰胺凝胶，根据不同目的片段的大小将0%和100%的变性剂按照相应的比例配置不同的高浓度和低浓度的变性缓冲液，分别取高浓度和低浓度的变性剂溶液20 mL，加90 μL的 4.5 μL/mL 10% APS和20 μL的lμL/mL的TEMED（APS：TEMED =4.5:1），立即颠倒混合均匀。将高浓度变性剂溶液和低浓度变性剂溶液分别吸入相应的针筒，并固定在梯度形成器对应的高低浓度两侧，将出胶针头置于胶板之间。推动梯度形成器，将胶灌入两个玻璃板之间，注意避免产生气泡。灌胶结束后，在胶板顶部小心倾斜插入梳子(避免产生气泡)，静置1.5-2 hr待胶凝固。及时将针筒中剩余的溶液排净并清洗干净。

3、电泳

在DGGE电泳槽中加入7L新鲜配置的1×TAE缓冲液，使电泳槽中的缓冲液页面至“Full”和“Run”中间的位置，将胶板固定在黄色的凝胶板架上，放进电泳槽中，最后将温度控制器盖在电泳槽上。接通电源，打开电泳仪预热使缓冲液的温度达到60℃。轻轻将梳子拔出，将加样孔中的缓冲液用加样针吸出，缓缓加入约30 μL 第二次PCR产物与6×Loading Buffer的混合液，100V电压电泳12 hr。

4、染色

DNA染色采用银染试剂盒进行银染，具体过程包括以下步骤：

a) 固定1：将凝胶加入固定液1，轻轻摇动孵育10 min，小心弃掉液体； b) 固定2：加入固定液2，轻轻摇动孵育3 min，小心弃掉液体； c）用去离子水漂洗三次，每次5 min；

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d）银染：加入0.12%银染试剂暗处孵育20 min，弃液； e）去离子水冲洗两次，每次2 min，充分倒掉去离子水； f）显色：加入显色液，轻轻摇动孵育5-20 min，进行显色；

g）终止反应：当显色步骤中凝胶条带清晰时，立即倒掉显色液，加入入终止液。 5、拍照

快速银染后，进行DGGE凝胶图片的拍照。 （四）条带回收、纯化与测序 1、DGGE条带的回收与纯化

将DGGE条带割胶之后，采用DGGE条带回收试剂盒（溶液法）进行回收，步骤如下：

（1）切下的胶条放入1.5 mL离心管，加入1 mL去离子水上下混匀，离心，用枪头小心将离心管内的水吸取出；重复此步骤一次。

（2）加入1 mL DGGE回收专用的Buffer，颠倒混匀，离心，弃去。

（3）再加入 150 μL DGGE回收专用的Buffer，采用无菌研磨棒将凝胶充分研磨；然后50℃水浴2 hr，期间上下颠倒混匀。

（4）4℃，12000 rpm离心8 min，用移液器小心轻轻吸取上清的 80%至新的1.5 mL离心管，注意不要吸取到离心管底部的沉淀。

（5）计算上清液体体积，加入1/10V NaAc和10 μL 糖原（RNase & DNase-Free），以及加入2.5V预冷的无水乙醇，-80℃冰箱放置1hr或-20℃放置过夜。

（6）4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清；然后加入1 mL -20℃预冷的75 %乙醇，并且上下轻轻颠倒混匀5次。

（7）4℃，12000 rpm离心8 min，弃去上清，倒扣在吸水纸上，然后用2-10 μL枪头小心吸去残余酒精，真空干燥15 min。

（8） 加入10 μL 无菌TE洗脱液，混匀，-20℃保存备用。 2、克隆及测序

以上述获得的DGGE割胶回收产物为模板，采用不含GC夹的巢式引物进行PCR，按照AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒的操作步骤回收目的条带。

（1）PCR产物的连接

将以上回收产物与克隆载体连接，连接反应体系如下：

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2×Ligation buffer

pGEM-T easy Vector（60ng/μL）

T4 DNA Ligase(5 U/μL)

PCR回收产物

Total

4 μL 0.5 μL 0.5 μL 3 μL 8 μL

将以上反应体系混匀后离心2-3 sec，于4℃冰箱放置12-20 hr进行连接。 （2）连接产物的转化

将以上8 μL连接产物全部转化入感受态细胞，具体步骤如下：

a）从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，室温解冻立即放置于冰上。 b）将8 μL连接产物全部加入到200 μL感受态细胞中，轻轻倾斜着转动离心管10圈左右，在冰上放置20-30 min。

c）42℃水浴热击60 sec，迅速拿出平稳地置于冰上3 min，期间勿晃动。 d）加入不含Amp的液体LB培养基600 μL，在掌心平衡至37℃，于37℃，200 rpm摇床振荡培养2 hr（在加液体LB培养基时，需在冰上及超净工作台内操作）。

e）震荡培养结束后，5000 rpm离心1 min，在超净工作台内，将离心管内的上清吸去600 μL，剩下的200 μL轻轻吹打均匀并全部加入到含Amp、IPTG、X-gal的LB固体培养基上，使用无菌的玻璃涂布棒将200 μL混合液轻轻均匀涂开，37℃生化培养箱放置30 min后倒置培养过夜（12 hr-14 hr）。（涂板前将含Amp、IPTG、X-gal的LB固体培养基平衡至室温）。

f）根据蓝白斑筛选原理，挑取培养基上的白斑，接种于3 mL含有Amp 的液体LB培养基中，在37℃，200 rpm 摇床震荡培养12 -14 hr。

（3）重组质粒的提取

采用改进的碱法提取重组大肠杆菌质粒，方法如下：

a）在超净工作台内，将培养12-14 hr的菌液取1 mL于无菌离心管中，并保存两份（一份用于提取重组质粒，一份用于送样测序）。

b）4℃，5500 rpm离心1 min，弃去上清，加入600 TE μL洗涤菌体2-3次。 c）加入100 μL Solution I溶液，涡旋振荡，使菌体悬浮。

d）加入200 μL SolutionⅡ溶液（宜现配现用），快速温和颠倒混匀至澄清，在冰上放置2-5 min。

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e）加入150 μL预冷的SolutionⅢ溶液，温和颠倒数次混匀，有白色絮状沉淀产生，在冰上放置5 min后，4℃、13000 rpm离心15 min。

f）吸取上清液400 μL，加入等体积的异丙醇（或二倍体积的无水乙醇），室温沉淀40 min（或室温沉淀10-15 min），4℃、12000 rpm离心10 min。

g）弃去上清液，加入500 μL 75%的乙醇洗涤沉淀两次，4℃、12000 rpm离心1 min。 h） 真空干燥10-15 min。

i）加入30-35 μL的RTE溶液（0.1% RNase A酶，10 mmol·L-1 Tris·Cl，4 mmol·L-1EDTA）溶解沉淀，37℃水浴反应30 min；

j） 取5 μL重组质粒样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测。 （4）重组质粒的鉴定

根据以上电泳检测的结果，选取提取质粒的质量较好的进行酶切，酶切反应体系如下表：

10×Buffer EcoRⅠ EcoRⅠ（10 U/μL）

Plasmid dd H2O Total

2 μL 1 μL 9 μL 8 μL 20 μL

加完试剂离心2-3 sec，37℃水浴酶切反应2 hr，将20 μL酶切反应液加样到1%琼脂糖凝胶，进行电泳检测。

（5）测序

将DGGE电泳条带的克隆产物送上海桑尼生物科技有限公司进行测序。测序所得结果用DNAStar软件和MEGA4.0软件进行序列分析，并在NCBI网站上进行BLAST比对，确定近缘株细菌的种属特征。

（五）种群多样性分析

根据DGGE电泳条带的数量以及条带的亮度评估植物内生菌的多样性及优势种群，采用辛普森指数（Simpson's diversity index）初步分析内生细菌的生物多样性，辛普森指数是一种快速简便较为准确的能评估生物多样性的有效方法。其公式如下：D=1-∑(Ni(Ni-1))/(N(N-1))，其中Ni为群落中第i种的个体数，N为群落中所有种的个体数。

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六、注意事项

1、在混合和灌胶时应避免产生气泡；

2、有时聚丙烯酰胺凝胶的左侧会出现缩水现象以致在胶的顶部到底部之间会产生空气通道，可用2%熔化的琼脂糖凝胶将其充满；

3、所有溶液应保存于4℃棕色瓶中，一般几个月到一年内有效；

4、电泳时凝胶温度必须保持恒定，把胶板浸没于充分搅拌的温控缓冲液槽内。对于缺乏变性剂时比较容易变性的DNA 来说，槽内的温度选择在60℃稍微超过熔点，并且大部分的工作都在60℃下进行(但温度稍高或低一点都可采用)。温度保持恒定可将电泳缓冲液加热到60℃，并把胶浸入其中进行电泳即可；

5、该实验中提取DNA，以及DGGE操作中接触到得很多药品都有毒，还有致癌、变性等毒害，一定要严格操作，做好防护保护自己；

七、结果分析

1、根据DGGE电泳条带的数量结合辛普森指数评估样品内生菌的丰富度和群落结构，条带数量越多以及辛普森指数值越高说明样品内生菌多样性较丰富。

2、根据电泳条带的亮度强弱推断样品中的优势菌群，电泳条带亮度越强说明该种类内生菌在植物体内的数量越多，为植物的优势菌群。

八、思考题

1、如何确证你所提取的植物基因组DNA的完整性？ 2、PCR扩增效果对DGGE分析的影响？

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附录 各种培养基、试剂的配制

1.培养基

牛肉膏蛋白胨培养基（营养琼脂）

蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 氯化钠 5g 琼脂 15~20g 1000mL

制法：将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2ML，校正PH7.2—7.4，加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装在三角锥瓶中，在121℃下高压灭菌20分钟。 高氏一号培养基

可溶性淀粉20g KNO3 1g NaCl 0.5g K2HPO4 FeSO4·7H2O 0.01 g 琼脂20g 水1000mL pH7.4~7.6

先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到100ml，调pH，121℃灭菌20min。 马铃薯培养基(PDA)

马铃薯（去皮）200g 葡萄糖（或蔗糖）20g 琼脂 15~25g 水 1000ml 自然pH 将去皮的马铃薯切片后放入锅中，然后加少许少于所需的水量在电磁炉上加热20 min，然后用双层砂布过滤，滤液重新放入锅中煮沸，然后加入称量好的蔗糖和琼脂，待各成分溶解后，补充水分至所需体积。 糖发酵实验培养基

蛋白胨 10g NaCl 2g 糖 10 蒸馏水 1000ml pH 7.6 加入1%溴百里酚蓝（溴麝香草酚蓝）水溶液5ml，分子并于试管中倒置一小套管，用以收集细菌产生的气体 1%溴百里酚蓝水溶液 先用少量95%乙醇溶解，再用水配成1%的水溶液 2.染色液、指示剂等

齐氏（Ziehl）石炭酸品红染液

甲液 取石炭酸5克，溶解在95毫升蒸馏水中。

乙液 取0.3克碱性品红，放入研钵中研磨，逐渐加入10毫升95%酒精，继续淹没，使它溶解。

将甲液和乙液混合后，摇匀，过滤，装瓶，备用。

0.5g MgSO4·7H2O 0.5g

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罗氏（Loeffler's）美蓝染液

甲液 取5克美蓝，溶于100毫升95%酒精中，制成美蓝-酒精饱和液。

乙液 取氢氧化钾0.01克（或1%氢氧化钾溶液1毫升），溶液也可用于放线菌染色，0.1%浓度可用于酵母菌染色。 革兰氏（Gram's）染液

用此液染色因先用甲液染色，再加乙液固定，用丙液处理，最后用丁液复染。四种液体的配方如下： 甲液（结晶紫液）

（1）结晶紫 2克 95%酒精 20毫升 （2）草酸铵 0.8克 蒸馏水 80毫升

使用钱江（1）、（2）液相混，静置48小时后使用。 乙液(碘液)

碘 1克 碘化钾 2克 蒸馏水 300毫升

将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘，待碘全部溶解后，加水稀释至300毫升。 丙液 95%酒精溶液 丁液（番红花红液）

2.5%番红花红酒精溶液 10毫升 蒸馏水 100毫升 芽孢染液

用此配方染色是用甲液染色后，用乙液复染。

甲液 取5克孔雀绿，加入少量蒸馏水，使它溶解后，用蒸馏水稀释到100毫升，即成孔雀绿染液。

乙液 取番红花红0.5克，加入少量蒸馏水，使它溶解后，用蒸馏水稀释到100毫升，集成番红花红复染液。 鞭毛染液

——硝酸银染色法

A液：单宁酸5.0g，FeCl3 1.5g，福尔马林(15%) 2.0mL，1%NaOH 1.0mL，蒸馏水100mL。 B液：AgNO3 2.0g,蒸馏水100mL乙液

乳酸石炭酸棉蓝染色液(用于真菌固定和染色)

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石炭酸(结晶酚)20g，乳酸20mL，甘油40mL，棉蓝0.05g，蒸馏水20mL。将棉蓝溶于蒸馏水中，再加入其他成分，微加热使其溶解，冷却后用。滴少量染液于真菌涂片上，加上盖玻片即可观察。霉菌菌丝和孢子均可染成蓝色。染色后的标本可用树脂封固，能长期保存。 中性红指示剂

中性红0.04 g 95%乙醇28 ml 蒸馏水72 ml

中性红pH6.8-8，颜色由红变黄，常用浓度为0.04%。 淀粉水解试验用碘液（卢戈氏碘液） 碘片1 g 碘化钾2 g 蒸馏水300 ml

先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘溶后，加足水分即成。 溴甲酚紫指示剂

溴甲酚紫0.04 g 0.01 mol/L NaOH 7.4 ml 蒸馏水92.6 ml 溴甲酚紫pH5.2~6.8，颜色由黄变紫，常用浓度为0.04%。 溴麝香草酚蓝指示剂

溴麝香草酚蓝0.04 g 0.01 mol/L NaOH 6.4 ml 蒸馏水93.6 ml 溴麝香草酚蓝pH6.0~7.6，颜色由黄变蓝，常用浓度为0.04%。 甲基红试剂

甲基红（Methylred）0.04 g 95%酒精60 ml 蒸馏水40 ml 先将甲基红溶于95%酒精中，然后加入蒸馏水即可。 V.P.试剂

5%α-萘酚无水酒精溶液 α-萘酚5 g 无水乙醇100 ml 40%KOH溶液

KOH 40 g蒸馏水定容至100 ml 吲哚试剂

对二甲基氨基苯甲醛2 g 95%乙醇190 ml 浓盐酸40 ml

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石炭酸(结晶酚)20g，乳酸20mL，甘油40mL，棉蓝0.05g，蒸馏水20mL。将棉蓝溶于蒸馏水中，再加入其他成分，微加热使其溶解，冷却后用。滴少量染液于真菌涂片上，加上盖玻片即可观察。霉菌菌丝和孢子均可染成蓝色。染色后的标本可用树脂封固，能长期保存。 中性红指示剂

中性红0.04 g 95%乙醇28 ml 蒸馏水72 ml

中性红pH6.8-8，颜色由红变黄，常用浓度为0.04%。 淀粉水解试验用碘液（卢戈氏碘液） 碘片1 g 碘化钾2 g 蒸馏水300 ml

先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘溶后，加足水分即成。 溴甲酚紫指示剂

溴甲酚紫0.04 g 0.01 mol/L NaOH 7.4 ml 蒸馏水92.6 ml 溴甲酚紫pH5.2~6.8，颜色由黄变紫，常用浓度为0.04%。 溴麝香草酚蓝指示剂

溴麝香草酚蓝0.04 g 0.01 mol/L NaOH 6.4 ml 蒸馏水93.6 ml 溴麝香草酚蓝pH6.0~7.6，颜色由黄变蓝，常用浓度为0.04%。 甲基红试剂

甲基红（Methylred）0.04 g 95%酒精60 ml 蒸馏水40 ml 先将甲基红溶于95%酒精中，然后加入蒸馏水即可。 V.P.试剂

5%α-萘酚无水酒精溶液 α-萘酚5 g 无水乙醇100 ml 40%KOH溶液

KOH 40 g蒸馏水定容至100 ml 吲哚试剂

对二甲基氨基苯甲醛2 g 95%乙醇190 ml 浓盐酸40 ml

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