液相

液相色谱培训

P基础篇

一、色谱起源 二、定义

色谱法(Chromatography)：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术 流动相：携带样品流过整个系统的流体 固定相：静止不动的一相 常见分离方式 应用

?已知有机物中仅20%不经预先化学处理，可用GC分析；而其余80%有机物可用HPLC分析。

?HPLC适于分离生物、医学大分子和离子化合物，不稳定的天然产物，种类繁多的其它高分子及不稳定化合物。

?2005年版药典HPLC法用于含量定品种479种涉及518项。

简 述

J高效液相色谱法是一种现代液体色谱法， 其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱， 注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。 HPLC有以下特点

?高压：压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 ?高速：流速为0.1~10.0 ml/min。

?高效：可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 ?高灵敏度：紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。

HPLC与经典液相色谱相比有以下优点 速度快 ：通常分析一个样品在15?a30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。 分辨率高 ：可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

灵敏度高 ：紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。。 柱子可反复使用 ：用一根色谱柱可分离不同的化合物。

样品量少，容易回收 ：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。 高效液相色谱仪的组成 ?高压输液系统：泵

?进样系统：进样器 ?分离系统：色谱柱 ?检测系统：检测器

?记录系统：色谱数据处理机或工作站 一、高压输液系统

高压输液系统由溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。

1.溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。

2.高压输液泵 功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。

?对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好。高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。

3. 梯度洗脱装置

即：在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。

梯度洗脱装置分为两类：

一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。

另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。

梯度洗脱在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温。 输液泵

§输液泵控制方式： 恒流控制 恒压控制 二、进样系统

进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。 三、分离系统

?分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2～6mm，柱长为10～50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。

三、分离系统——柱温箱 §分析结果重现性好 §提高柱效 §降低柱压 §保证检测稳定性

四、检测器

检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。

?在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等；另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。属于此类检测器有示差折光检测器等。 LC检测器

Y紫外可见检测器（UV/VIS） Y二极管阵列检测器（PDA） Y示差检测器（RID） Y电导检测器（CDD） Y荧光检测器（RF） Y电化学检测器（L-ECD） Y质谱检测器（MS）

Y蒸发光散射检测器（ELSD） 检测器-紫外可见检测器

原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：Lambert-Beer定律，A＝KCL 优点：

1）检测下限约为 10-10 g／ml，而且线性范围广。 2）对温度和流速变化不敏感。 3）可用于梯度分析。

缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质 检测器-二极管阵列检测器（SPD－M10AVP） 二十一世纪标准紫外检测器 色谱信息： 保留时间 常规紫外检测器 紫外光谱 二极管阵列检测器 检测器- 示差折光检测器

原理：是根据不同物质具有不同折射率来进行组分检测的。凡是具有与流动相折射率不同的组分，均可以使用这种检测器。 优点：通用性强，操作简便；

缺点：1）灵敏度低，最小检出限约为 10-7g/ml ，不能做痕量分析。

2）由于洗脱液组成的变化会使折射率变化很大，因此，这种检测器也不适用于梯度洗脱。 检测器- 蒸发光散射检测器（ELSD) 是通用型质量检测器

可用于梯度洗脱。 色谱信息的收集和处理工具

色谱数据工作站主要功能是对检测器的响应信号进行处理。 ?通过色谱峰面积或峰高作为定量计算依据 ?由保留时间定性

色谱信息的收集和处理工具 2记录仪、积分仪:

接收检测器输出的模拟信号，并对其进行处理，结果/数据不能以电子文档保存 3色谱数据工作站

通过A/D转换接口接受检测器输出的模拟信号，由安装在计算机上的软件进行出具处理，结果/数据以电子文档的形式保存。 4色谱系统工作站

与色谱系统同时设计的对系统实行PC界面操作/控制的专门软件，包含数据处理功能

P操作篇

操作前的准备1—流动相的制备 操作前的准备2—供试溶液的配制 操作前的准备3—查仪器系统 注意事项 操作1—泵 操作2—检测器 操作3—进样 操作4—数据工作站 注意：

I在药品检验中：含量测定的对照溶液和样品供试溶液每份至少注样2次，由全部注样结果(n≥4)，求得平均值，相对标准偏差(RSD)应不大于1.5%。 注意：

I药典正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。 液相色谱工作内容 F样品预处理 F溶剂前处理 F泵及进样器

F管路及接头 F色谱柱 F检测器

F记录器和数据系统 F分离问题 一、样品预处理 ?过滤 ?超滤法 ?萃取 ?柱前衍生 ?柱后衍生化 ?低压柱层析 ?自动化处理 二、溶剂前处理 流动相选择注意事项： §纯度：采用“ HPLC ”级溶剂

§避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 §对试样有适宜的溶解度 §溶剂粘度要小 §与检测器相匹配 §流动相配制时的顺序

过滤：0.45um或更小孔径滤膜

目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。 水系过滤膜 §过滤膜种类 有机系过滤膜 脱气

目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡

一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小 气泡对测定的影响： 1）柱压波动，流量偏小。 2）基线波动 贮液器的日常维护 ?过滤溶剂 ?保持贮液器的清洁

?定期更换吸滤头 ?保证溶剂质量 三、手动进样器的操作 §自动进样器 §手动进样器 原理：（六通阀） 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入

高效液相色谱仪的使用要求 ?流路中无堵塞或漏液。

?在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 注意：

I含量测定的对照溶液和样品供试溶液每份至少注样2次，由全部注样结果(n≥4)，求得平均值，相对标准偏差(RSD)应不大于1.5%。

药典正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。

P提高篇

正相色谱与反相色谱区别 正相色谱法(NPC)

?一般采用极性键合固定相，硅胶表面键合的是极性的有机基团，键合相的名称由键合上去的基团而定。最常用的有氰基（-CN）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）键合相。 ?流动相一般用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂，如烃类溶剂，或其中加入一定量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。

?常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 反相色谱法(RPC)

?一般采用非极性键合固定相，如硅胶-C18H37（简称ODS或C18）、硅胶-苯基等； ?用强极性的溶剂为流动相，流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。 ?适用于分离非极性和极性较弱的化合物。 色谱柱

1）柱压低于150kgf/cm2（15cm色谱柱） 2）柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃

3）流动相PH使用范围为2～7.5 流动相注意点 ?离子对试剂的使用

?具有缓冲盐流动相的使用 分析结束及开始 ?流动相平衡 加快平衡时间 ?异丙醇的使用

液相色谱常见问题及其对策 － A.压力异常

无压力，流动相不流动可能原因 |保险丝断或电源问题 |柱塞杆折断

|泵头内有空气或流动相不足 |单向阀损坏 |漏液

|压力传感器损坏(流动相流动正常，但无压力) 液相色谱常见问题及其对策 － A.压力异常

压力持续偏高或不断上升可能原因 |流速设定过高 |保护柱或柱子筛板堵塞 |流动相使用不当或有缓冲盐析出 |色谱柱选择不当 |进样阀损坏 |线路过滤器堵塞

液相色谱常见问题及其对策 － A.压力异常 压力持续偏低可能原因 |流速设定过低 |色谱柱选择不当 |柱温过高 |系统漏液

液相色谱常见问题及其对策 － A.压力异常 压力波动可能原因 |泵头中有气泡 |单向阀损坏

|柱塞密封圈损坏 |脱气不充分 |系统漏液 |使用了梯度洗脱

液相色谱常见问题及其对策 －B.漏液

接头处漏液可能原因 ?接头处松动 ?接头磨损 ?接头被污染 ?部件不匹配

液相色谱常见问题及其对策 －B.漏液 泵漏液可能原因 ?单向阀松动 ?泵密封损坏 ?放空阀损坏

?接头松动（不要拧的太紧） 液相色谱常见问题及其对策 －B.漏液

进样阀漏液可能原因 ?转子密封损坏 ?定量环堵塞 ?进样口密封松动 ?进样针尺寸不合适 ?废液管产生虹吸 ?废液管堵塞

液相色谱常见问题及其对策 －B.漏液

检测器漏液可能原因 ?流通池垫片损坏 ?流通池透镜破碎 ?手紧接头处漏液 ?废液管堵塞 ?流通池堵塞

液相色谱常见问题及其对策 －C.保留时间漂移 保留时间漂移可能原因 ☉柱温变化 ☉流动相组分变化 ☉色谱柱没有平衡 ☉流速变化 ☉泵中有气泡 ☉流动相选择不当 ☉键合相流失 ☉缓冲容量不够

液相色谱常见问题及其对策 －D.基线问题 基线漂移可能原因 Θ温度波动

Θ流动相不均匀(脱气，使用纯度更高的溶剂) Θ流通池被污染或有气泡 Θ流通池窗口破裂

Θ流动相配比不当或流速变化 Θ柱子平衡（约30－60min） 液相色谱常见问题及其对策 －D.基线问题 基线漂移可能原因

Θ流动相污染，变质或由低品质溶剂配成 Θ样品中有强保留的物质以馒头样峰被洗出 Θ检测器没有设定在最大吸收波长处 液相色谱常见问题及其对策 －D.基线问题

基线噪声（规则的）可能原因 Θ流动相、泵、检测器中有气泡 Θ有地方漏液 Θ流动相混和不均匀

Θ温度影响（检测器和柱温差别太大） Θ其他电子设备的影响 液相色谱常见问题及其对策 －D.基线问题

基线噪声（不规则的）可能原因 Θ流动相污染、变质或由低质溶剂配成 Θ有地方漏液

Θ流动相各溶剂不相溶或混和不均匀 Θ流通池污染 Θ检测池能量不足 Θ系统内有气泡

液相色谱常见问题及其对策 －E.峰形异常

前沿峰、拖尾峰可能原因 a柱塞板堵塞 a色谱柱塌陷 a柱外效应 a干扰峰

a缓冲不足或不合适

a化学或次级保留（硅羟基效应）液相色谱常见问题及其对策 a重金属污染 a样品溶剂选择不当 a样品过载 a柱温过低

a保护柱或分析柱污染 a样品溶剂不溶于流动相 a进样体积过大 a流动相粘度过高 a检测池体积过大 a保留时间过长 a柱外体积过大 a样品过载 a样品过载 a样品溶剂选择不当 鬼峰可能原因 a进样阀残余峰 a样品中未知物 a柱未平衡 a水污染 a三氟乙酸氧化

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