根系表面积及其活性的测定方法

根系表面积的测定

测定根系表面积的方法很多，可归纳为直接测量法和间接测量法两类。直接测量法是测定大量的单根的平均直径以及测量每个样品的总根长，按s=∏RL（R：直径；L：总长）公式来估算根系表面积。此法工作量大，精度差。间接测量法有染色液蘸根法、重量法、滴定法和叶面积仪法。

重量法是将洗净风干根浸入浓硝酸钙溶液中10秒钟后捞出，由浸根前后硝酸钙溶液的重量差做为相对值来表示根系的表面积。

滴定法是将洗净风干的根系浸入3mol.L-1的HCl溶液中（500ml）15秒钟后捞出，将根悬吊放置5分钟，除去多余的盐酸后再浸入蒸馏水（250ml）漂洗10分钟以上，取浸过根系的盐酸和水各100ml，用0.3mol.L-1的NaOH进行滴定（以酚酞为指示剂），以NaOH的滴定值（ml单位）相对表示根系的面积。如果选用完整而已知面积的根系，即可作出标准曲线进行绝对测定。

叶面积仪法是将洗净吸干附着水的根系，浸入到0.2 mmol.L-1的甲烯蓝溶液中1.5分钟，捞出用吸水纸吸干附着溶液，将根散铺在透明塑料薄膜上成长条形注意不能重叠，再把多余的塑料薄膜折盖并夹住根系，用光电叶面积仪（如用L1-3000型叶面积仪）象测叶面积一样测定，所的测定值再乘以∏值（假定根为圆拄形），即为根系总面积。据此认为此法对于根直径小于1mm是误差较大。如果根系不透明时不必染色。

应用比较普遍的是染色液蘸根法，这种方法不仅可以测定总吸收面积还可以区分活跃吸收面积。 1． 方法原理

根据沙比宁等的理论，认为植物根系对物质的吸收最初具有吸附的特性，并假定此时被吸附物质是以单分子层形式均匀的覆盖在根系表面。之后在根系的活跃部分把原来吸附着的物质解吸到细胞中去，根系又可以继续吸附。因此可以根据根系对某种物质的吸附量来测定根的吸收面积。一般用甲烯蓝作为被吸附物质，其被吸附的数量可以根据供试液浓度的变化用比色法准确的测出。据沙比宁测定1mg甲烯蓝成单分子层时可覆盖1.1平方米的面积，据此可以求出根系的总吸收面积。当根系在甲烯蓝溶液中已经达到吸附饱和而仍留在溶液中时，根系的活跃部分能把原来吸附的物质吸收到细胞中去，因而可以继续吸附甲烯蓝。从后一个吸附量可求出活跃吸收面积，可作为根系活力的指标。 2． 仪器药品

分光光度计；小烧杯；量筒（50ml）;移液管；容量瓶；试管；试管架；吸水纸；剪刀；镊子；0.0002mol.L-1甲烯蓝溶液：75mg甲烯蓝溶解定容至1000ml(0.075mg.ml-1)；0.01mg.ml-1甲烯蓝溶液：取0.0002 mol.L-1的甲烯蓝溶液13.4ml加水定容至100ml。 3． 测定方法

（1）绘制甲烯蓝溶液标准曲线。取7支试管编号，按下表配成甲烯蓝系列标准液：

试管号 1 2 3 4 5 6 7

0.01mg.ml-1甲烯蓝液加入量（ml）

加蒸馏水量（ml） 甲烯蓝液浓度（mg.ml-1）

0

10 0 1 9 0.001 2 8 0.002 3 7 0.003 4 6 0.004 5 5 0.005 6 4 0.006

把各管混匀后，用分光光度计在660nm下测定光密度并绘制浓度光密度曲线。

（2）将根系洗净用吸水纸吸干表面附着水，将根浸在盛水的量筒中测定根系的体积（或用根系体积测定装置）。

（3）把0.0002mol.L-1的甲烯蓝溶液，分别倒入3个编号的烧杯中，每杯中溶液的量约10倍于根系体积，准确记下每杯的溶液用量。

（4）从量筒中取出根系，用吸水纸把水吸干，注意勿伤根系。然后放入第一个盛有甲烯蓝溶液的小烧杯中，浸1.5分钟后立即取出，使根系上多余的甲烯蓝溶液流回到原烧杯中去。再放入第二个小烧杯中浸1.5分钟，取出后同样使根系上多余的甲烯蓝溶液流回到原烧杯中去。最后再浸入第三个小烧杯中1.5分钟，取出后使根系上多余液体流回到烧杯中去。 （5）从上述三个烧杯中各取出1ml甲烯蓝溶液，分别加入三个试管各稀释1-10倍，摇匀后在660nm下测定光密度，并在标准曲线上查出相应的浓度（mg.ml-1）。再乘以稀释倍数，即为浸根后溶液的甲烯蓝浓度，如浸根后溶液浓度降低很多，也可不经稀释直接测定光密度。 （6）结果计算

总吸收面积 （m2）=【（C0-C1）×V1＋（C0-C2）×V2】×1.1

2

活跃吸收面积 （m）=【（C0-C3）×V3】×1.1

活跃吸收面积 （%）=活跃吸收面积（m2）/总吸收面积（m2）×100 比表面积 =根系总吸收面积（cm2）/根的体积（cm3） 式中： C0---------------甲烯蓝溶液原浓度（0.075mg.ml-1）

C1、C2、C3---分别为1、2、3烧杯浸根后溶液的浓度（mg.ml-1） V1、V2、V3----分别为1、2、3烧杯中加入的0.0002mol.L-1甲烯蓝溶液的体积（ml）。

根系氧化还原力的测定

根系氧化还原力与呼吸作用有着密切的关系，它是根系活力的重要表现。

α-萘胺能被根系所氧化，当根系的氧化力增大时，有氧呼吸旺盛，吸收养分的能力也增强，所以对α-萘胺的氧化力可作为根系活力的重要指标。 1． 方法原理

吸附在根表面的α-萘胺会被根系所氧化，生成红色的2-羟基-1-萘胺而沉淀于有氧化力的根的表面，使这部分根染成红色。据认为该反应是在过氧化物酶的催化下进行的，该酶的活力愈强，对α-萘胺的氧化力也愈强，染色也愈深。故可根据根表面染色的深浅，定性的判断根的活力。定量测定是根据α-萘胺与根系接触一定时间后α-萘胺量的减少量来确定。α-萘胺在酸性环境中与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐作用生成红色的偶氮燃料，就可以用比色法来测量α-萘胺含量。 2． 仪器药品

分光光度计；天平（1/万）；烧杯（500ml）；移液管（10ml,2ml,1ml）；刻度试管（20ml）；试剂瓶（60ml或100ml）；试管架；容量瓶（100和1000ml）；量筒；三角瓶（100ml）；黑蜡光纸；滤纸；棕色瓶。

1) 40ppmα-萘胺：准确称取0.1gα-萘胺溶于5ml左右酒精，溶解后加水定容至100ml，成

1000ppm母液贮于棕色瓶中暗处保存。用前稀释25倍。

2) 1%对氨基苯磺酸溶液：称1g对氨基苯磺酸溶于100ml30%乙酸中，水浴加热。 3) 100ppm亚硝酸钠溶液：称0.1g亚硝酸钠溶于1000ml蒸馏水中。 4) 067mol.L-1的磷酸缓冲液（pH7）：称取分析纯磷酸氢二钠11.864g溶于1000ml蒸馏水

中，为A液。称取磷酸二氢钾9.073g溶于1000ml蒸馏水中为B液，用时A液60ml,B液40ml混合而成。 3． 测定方法

定性观察：取20ppmα-萘胺α-萘胺溶液500ml加入烧杯，把带有地上部的根（离体根染色程度降低）浸入其中，并在烧杯周围用黑纸包住，在室温下静置24-26小时后观察染色程度。新根和稍老的侧根都能染成分红色。变黑根及烂根不染色。 定量测定：

（1）绘制α-萘胺标准曲线：用40ppmα-萘胺溶液配成5、10、20、30、40ppm的系列溶液，取6支20ml的刻度试管编号，1号加1ml水和1ml磷酸缓冲液为对照。2-6号分别加入不同浓度的α-萘胺溶液各1ml，磷酸缓冲液1ml。然后再向各管加入10ml蒸馏水、1%对氨基苯磺酸1ml和100ppm亚硝酸钠溶液1ml，混匀置室温（20-25℃）下5分钟使之显色。最后加蒸馏水使整个容积为20ml。摇匀后20-60分钟内在510nm波长下测定光密度，以α-萘胺含量（ppm即ug.ml-1）为横坐标，以光密度为纵坐标，绘制标准曲线。 （2）将待测根系洗净吸干附着水称取1g放入100ml三角瓶中，加40ppmα-萘胺溶液和磷酸缓冲液各25ml混匀。

（3）静置5-10分钟后（根的迅速吸附已经完毕），从瓶中取出2ml 溶液放入20ml刻度试管。将其余的溶液塞好瓶塞后，放在振荡器上，在25℃下振荡3-6小时（如无振荡器时要在反应期间，定时的摇动）。反应时间完毕后再取2 ml溶液放入另一刻度试管。因为α-萘胺溶液会自动氧化，同时要同时做无限的同样操作的空白实验（根样最好是用整根；用切碎的根，α-萘胺的氧化量会意外增加）。

（4）在上述两次及空白试验所吸取的2ml测定液中，各加入10ml蒸馏水，混匀后再加入1%对氨基苯磺酸1ml和100ppm的亚硝酸钠溶液1ml混匀，置于室温下5分钟使之显色，然后加入蒸馏水，使整个容积为20ml，在20-60分钟内用510nm波长下进行比色，读取光密度，由标准曲线查出α-萘胺含量。 （5）结果计算

根系对α-萘胺的生物氧化量Y（ug.g-1.hr-1）按下式进行计算

Y=【（A-B）-（C-D）】×E/t.w

式中：

A------第一次取液测定值（ug.ml-1），作为开始值，这是根表面氧化物质的氧化作用而不是

根的酶促反应；

B------第二次取液测定值，是根的酶促反应后（如3小时）剩余的α-萘胺浓度（ug.ml-1）。 A-B---即α-萘胺氧化总量；

C------第一次空白测定值（ug.ml-1）； D------第二次空白测定值； C-D---即α-萘胺自发氧化量； E------稀释倍数24（48÷2）； t-------3小时 w------1g样品

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