食品检测技术实验指导书（修）

实验五 脂肪含量的测定（索氏提取法）

一、实验原理

将已经过预处理而干燥分散的样品，用无水乙醚或石油醚等溶剂进行提取，使样品中的脂肪进入溶剂当中，然后从提取液中回收溶剂，最后所得到的残留物即为脂肪（或粗脂肪）。由于残留物中除了主要含游离脂肪外，还含有磷脂、色素、树脂、蜡状物、挥发油、糖脂等物质，所以用索氏提取法测得的为粗脂肪。由于索氏提取法中所使用的无水乙醚或石油醚等有机溶剂，只能提取样品中的游离脂肪。故该法测得的仅仅是游离态脂肪，而结合态脂肪未能测出来。

此法是经典方法，适用于脂类含量较高，含结合态脂肪较少，能烘干磨细，不易吸潮结块的样品的测定。

二、材料、仪器与试剂

1. 材料：谷物、豆类等。

2. 仪器：索氏提取器、烧瓶（150ml）、恒温水浴。 3. 试剂：无水乙醚或石油醚；海砂。 三、测定方法

滤纸筒的准备：取20cm × 8cm的滤纸一张，卷在光滑的圆形木棒上，木棒直径比索氏抽提器中滤纸筒的直径小l～1.5mm，将一端约3cm纸边摺入，用手捏紧，形成袋底。除中间纸筒底部衬一块脱脂棉，用木棒压紧，纸筒外面用脱脂线捆好，在100～105℃烘干至恒重。

1. 样品处理

①固体样品：精确称取于100～105℃烘干并研细的样品2～5g（可取测定水分后的试样），装入脂肪抽提器滤纸筒内。

②半固体或液体样品：精确称取5.0～10.0g样品于蒸发皿中加入海砂约20g，于沸水浴上蒸干后，再于95～105℃烘干、磨细全部移入滤纸筒内，蒸发皿及部有样品的玻璃棒用洁有乙醚（或石油醚）的脱脂棉擦净，将棉花一同放入滤纸筒内。

2. 抽提

将滤纸筒放入索氏抽提器内，连接已干燥至恒重脂肪接收瓶，倒入乙醚（或石油醚），其量为接收瓶的2/3体积，于水浴上加热，进行回流抽提，控制每分钟滴下乙醚（或石油醚）80滴左右（夏天约65℃，冬天约80℃），根据样品含油量的高低，一般需回流提取3～12h，直至抽提完全为止。

3. 回收溶剂、烘干、称重

取出滤纸筒，用抽提器回收乙醚待接收瓶内的乙醚剩下1～2mL时，取下接收瓶，于水浴上蒸干，再在100～105℃的烘箱中烘至恒重。

4. 计算结果

W?m2?m1?100%m式中：

w——脂类质量分数，％

m2——接收瓶和脂肪的质量，g； m1 ——接收瓶的质量，g； m ——样品的质量，g。

四、说明及注意事项

1. 样品必须干燥，样品中含水分会影响溶剂提取效果，造成非脂成分的溶出。滤纸筒的高度不要超过回流弯管，否则超过弯管中的样品的脂肪不能提尽，带来测定误差。

2. 乙醚回收后，剩下的乙醚必须在水浴上彻底挥净，否则放入烘箱中有爆炸的危险。乙醚在使用过程中，室内应保持良好的通风状态，仪器周围不能有明火，以防空气中有乙醚蒸气而引起着火或爆炸。

3. 脂肪接收瓶反复加热时，会因脂类氧化而增重。质量增加时，应以增重前的质量为恒重。对富含脂肪的样品，可在真空烘箱中进行干燥，这样可避免因脂肪氧化所造成的误差。

4. 抽提所用的乙醚或石油醚要求无水、无醇、无过氧化物，挥发残渣含量低。因水和醇会导致糖类及水溶性盐类等物质的溶出，使测定结果偏高。过氧化物会导致脂肪氧化，在烘干时还有引起爆炸的危险。

5. 抽提是否完全，可凭经验，也可用滤纸或毛玻璃检查，由提脂管下口滴下的乙醚（或石油醚）滴在滤纸或毛玻璃上，挥发后不留下痕迹即表明已抽提完全。

6. 过氧化物的检查方法：取乙醚10ml，加2mL100g/L的碘化钾溶液，用力振摇，放置lmin，若出现黄色，则证明有过氧化物存在。此乙醚应经处理后方可使用。

实验六 还原糖的测定

一、实验内容

直接滴定法测食品中还原糖的含量。 二、实验目的与要求

1. 进一步巩固和规范氧化还原滴定操作。 2. 理解还原糖测定原理及操作要点。

3. 掌握水果硬糖中还原糖的测定的操作技能。

4. 学会控制反应条件，掌握提高还原糖测定精密度的方法。 三、实验原理

样品经除去蛋白质后，在加热条件下，直接滴定标定过的碱性洒石酸铜溶液，还原糖将二价铜还原为氧化亚铜。以次甲基蓝作指示剂、在终点稍过量的还原糖将蓝色的氧化型次甲基蓝还原为无色的还原型次甲基蓝。最后根据样品液消耗体积，计算还原糖量(用还原糖标准溶液标定碱性酒石酸铜溶液)。 四、试剂

1. 碱性洒石酸铜甲液：称取15.00g硫酸铜(CuSO4.5H2O)及0.05g次甲基蓝，溶于水中并稀释至1000mL。

2. 碱性酒石酸铜乙液：称取50.00g酒石酸钾钠及75g氢氧化钠，溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000mL，贮存于橡胶塞玻璃瓶中。

3. 盐酸。

4. 葡萄糖标准溶液：相确称取1.0000g经过(99±1)℃干燥至恒重的纯葡萄糖，加水溶解后加入5mL盐酸，并以水稀释至1000mL。此溶液每毫升相当于1.0mg葡萄糖。 五、仪器

酸式滴定管，可调式电炉(带石棉板)。 六、操作方法

1. 样品处理

准确称取1g样品置于250mL容量瓶中加水溶解定容，摇匀为样液。

2. 标定碱性酒石酸铜溶液

吸取5.00mL碱性酒石酸铜甲液及5.00mL乙液，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠2粒，从滴定管满加约9mL葡萄糖标准溶液，控制在2min内加热至沸，趁沸以每2s1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液或其他还原糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好退去为终点，记录消耗葡萄糖或其他还原糖标准溶液的总体积，同时平行操作3份，取其平均值，计算每10mL(甲、乙液各5mL)碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量或其他还原糖的质量(mg)。

m1＝Vl×m2 式中：

m1——10mI碱性酒石酸铜溶液(甲、乙浓各5 mL)相当于还原糖(以葡萄糖计)的质量，m g；

Vl——平均消耗还原糖标准溶液的体积，mL；

m2——1mL还原糖标准溶液相当于还原糠的质量，1mg。

3. 样品液预测

吸取5.00mL碱性酒石酸铜甲液及5.00mL乙液，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠2粒，控制在2min内加热至沸，趁沸以先快后慢的速度，从滴定管中滴加样品溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每2s1滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好退去为终点，记录样浓消耗体积(样品中还原糖浓度根据预测加以调节，以0.1g／100g为宜，即控制样液消耗体积在10mL左右，否则误差大)。

4. 样品溶液的测定

吸取5.00mL碱性酒石酸铜甲波及5.00mL乙液，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠2粒，从滴定管加比预测体积少1mL的样品溶液，控制在2min内加热至沸，趁沸继续以每2sl滴的速度滴定，直至蓝色刚好退去为终点，记录样液消耗体积。同法平行操作3次，待平均消耗体积。 七、结果处理

1. 数据记录 标定10mL酒石酸铜液 葡萄糖液用量／mL 10mL酒石酸铜相当于葡萄糖的量／mg 测定时消耗样品溶液的量／mL 1 2 3 平均值 2. 结果计算 X?m1?100 V2m?250?100式中：

X——样品中还原糖的含量(以某种还原糖计)，g／100g；

ml——10mL碱性酒石酸铜溶液相当于还原糖(以葡萄糖计)的质量，mg；

m——样品质量(或体积)，g(mL)；

V2——测定时平均消耗样品溶液体积，mL； 250——样品液总体积，mL。 八、说明与注意事项

1. 碱性酒石酸铜甲液、乙液应分别配制贮存，用时才混合。

2. 碱性酒石酸铜的氧化能力较强，可将醛糖和酮糖都氧化，测得的是总还原糖量。

2+

3. 本法对糖进行定量的基础是碱性酒石酸铜溶液中Cu 的量，所以，样品处理时不能采用硫酸铜——氢氧化钠作为澄清剂，以免样液中误入Cu2+得出错误的结果。

4. 在碱性酒石酸铜乙液中加入亚铁氰化钾，是为了使所生成的Cu2 O对的红色沉淀与之形成可溶性的无色络合物，使终点便于观察。

5. 次甲基蓝也是一种氧化剂，但在测定条件下其氧化能力比Cu2+弱，故还原糖先与2+2+Cu反应，待Cu完全反应后，稍过量的还原糖才会与次甲基蓝发生反应，溶液蓝色消失，指示到达终点。

6. 整个滴定过程必须在沸腾条件下进行，其目的是为了加快反应速度和防止空气进入，避免氧化亚铜和还原型的次甲基蓝被空气氧化从而使得耗糖量增加。

7. 预测定与正式测定的检测条件应一致。平行实验中消耗样液量应不超过0.1mL。 8. 测定中还原糖液浓度、滴定速度、热源强度及煮沸时间等都对测定精密度有很大的影响。还原糖液浓度要求在0.l％左右，与标准葡萄糖溶液的浓度相近；继续滴定至终点的体积数应控制在0.5～1mL以内，以保证在1min内完成续滴定的工作；热源一般采用800W电炉，热源强度和煮沸时间应严格按照操作中规定的执行，否则，加热至煮沸时间不同，蒸发量不同，反应液的碱度也不同，从而影响反应的速度、反应进行的程度及最终测定的结果。

4. 2，6-二氯靛酚溶液：称取碳酸氢钠 52mg，溶于200ml沸水中，然后称取2，6-二氯靛酚50mg溶解在上述碳酸氢钠的溶液中，待冷，置于冰箱中过夜。次日过滤置于250ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。此液应贮于棕色瓶中并冷藏。每星期至少标定1次。

标定方法：取5ml已知浓度的抗坏血酸标准溶液，加入1％草酸溶液5ml，摇匀，用上述

配制的染料溶液滴定至溶液呈粉红色于15s不退色为止。计算如下：

5. 0.1M碘酸钾溶液：精确称取干燥的碘酸钾0.3567g，用水稀释至100ml。

6. 0.001M碘酸钾溶液：吸取0.3567g碘酸钾溶液lml，用水稀释至100ml。此溶液lml相当于抗坏血酸0.088mg。

7. 1％淀粉溶液。 8. 6％碘化钾溶液。 三、操作方法

1. 称取适量(50.0～100.0g）样品，加等量的 2％草酸溶液，倒入组织捣碎机中捣成匀浆。称取10.00～30.00g浆状样品（使其含有抗坏血酸1～5mg),于小烧杯中，用1％草酸溶液将样品移入100ml容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。

2. 将样液过滤，弃去最初数毫升滤液。若样液具有颜色，用白陶土（应选择脱色力强但对抗坏血酸无损失的白陶土）去色，然后迅速吸取5～10ml滤液，置于50ml三角烧瓶中，用标定过的2，6-二氯靛酚染料溶液滴定之，直至溶液是粉红色于15s内不退色为止。 四、计算

每百克样品中抗坏血酸的克数=V.T.100/W

式中：

V——滴定时所耗去染料溶液的量（ml）

T——1ml染料相当于抗坏血酸溶液的量（mg）； W——滴定时所取的溶液中含样品的量（g） 五、说明

1. 所有试剂配制最好用重蒸馏水。

2. 样品取样后，应浸泡在已知量的2％草酸溶液中，以免发生氧化，使抗坏血酸受损失。 3. 对动物性的样品可用10％三氯醋酸代替2％草酸溶液提取；对含有大量Fe的样品，如储藏过久的罐头食品可用8％醋酸溶液代替草酸溶液提取。

4. 整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。

5. 若样品滤液无色，可不加白陶土。须用白陶土的，要对每批新的白陶土测定回收率。加白陶土脱色过滤后，样品要迅速滴定。

6. 滴定开始时，染料溶液要迅速加入，直至红色不立即消失，而后尽可能一滴一滴地加入，并要不断摇动三角烧瓶，直至呈粉红色于15s内不消失为止。样品中可能有其他杂质也

能还原2，6-二氯靛酚，但一般杂质还原该染料的速度均较抗坏血酸慢，所以滴定时以15s秒粉红色不退为终点。

7. 测定样品溶液时必须同时作一空白对照，样品溶液滴定的毫升数须扣除空白液滴定的毫升数。

Ⅱ 2，4－二硝基苯肼比色法

一、原理

总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸，样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4－二硝基苯肼作用生成红色脎，根据脎在硫酸溶液中的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色定量。 二、试剂

本实验用水均为蒸馏水。试剂纯度均为分析纯。

1. 4.5mol/L硫酸：谨慎地加250mL硫酸(比重1.84)于700mL水中，冷却后用水稀释至1000mL。

2. 85%硫酸：谨慎地加900mL硫酸(比重1.84)于100mL水中。

3. 2%2，4－二硝基苯肼溶液：溶解2g2，4－二硝基苯肼于100mL4.5mol/L硫酸内，过滤。不用时存干冰箱内，每次用前必须过滤。

4. 2%草酸溶液：溶解20g草酸(H2C2O4)于700mL水中，稀释至1000mL。 5. 1%草酸溶液：稀释500mL 2%草酸溶液到1000mL。 6. 1%硫脲溶液：溶解5g硫脲于500mL 1%草酸溶液中。 7. 2%硫脲溶液：溶解10g硫脲于500mL 1%草酸溶液中。

8. 1mol/L盐酸：取100mL盐酸，加入水中，并稀释至1200mL。

9. 抗坏血酸标准溶液：溶解100mg纯抗坏血酸于100mL1%草酸中，配成每毫升相当于1mg抗坏血酸。

10. 活性炭：将100g活性炭加到750mL1mol/L盐酸中，回流1～2h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子(Fe3+)为止，然后置于110℃烘箱中烘干。

11. 检验铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将2%亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。 三、仪器和设备

恒温箱：37±0.5℃；可见－紫外分光光度计；捣碎机。 四、操作步骤

1. 样品的制备

全部实验过程应避光。 1.1 鲜样的制备：称100g鲜样和100g2%草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆，取10～40g匀浆(含1～2mg抗坏血酸)倒入100mL容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。

1.2 干样制备：称1～4g干样(含1～2mg抗坏血酸)放入乳钵内，加入1%草酸溶液磨成匀浆，倒入100mL容量瓶内，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。

1.3 将(1.1)和(1.2)液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。

2. 氧化处理：取25mL上述滤液，加入2g活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10mL此氧化提取液，加入10mL2%硫脲溶液，混匀。 3 呈色反应

3.1 于三个试管中各加入4mL稀释液(1.2)。一个试管作为空白，在其余试管中加入1.0mL2%2，4－二硝基苯肼溶液，将所有试管放入37±0.5℃恒温箱或水浴中，保温3h。 3.2 3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，

然后加入1.0mL2%2，4－二硝基苯肼溶液，在室温中放置10～15min后放入冰水内。其余步骤同样品。

4 85%硫酸处理：当试管放人冰水后，向每一试管中加入5mL85%硫酸，滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。 5 比色：用1cm比色杯，以空白液调零点，于500nm波长测吸光值。 6 标准曲线绘制

6.1 加2g活性炭于50mL标准溶液中，摇动1min，过滤。

6.2 取10mL滤液放入500mL容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度20μg/mL。

6.3 取5，10，20，25，40，50，60mL稀释液，分别放入7个100mL容量瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1，2，4，5，8，10，12μg/mL。 6.4 按样品测定步骤形成脎并比色。

6.5 以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线。 五、计算

X?C?V100?F? m1000

式中：

X——样品中总抗坏血酸含量，mg/100g；

c——由标准曲线查得或由回归方程算得“样品氧化液”中总抗坏血酸的浓度，μg/mL； V——试样用1%草酸溶液定容的体积，mL； F——样品氧化处理过程中的稀释倍数； m——试样质量，g。 六、结果的允许差

同一实验室平行或重复测定相对偏差绝对值≤10%。

实验十一 VB1的测定

一、主题内容与适用范围

本标准规定了用荧光测定法测定食物中硫胺素含量的方法。

本标准适用于各类食物中硫胺素的测定，但不适用于有吸附硫胺素能力的物质和含有影响嚷嘧色素荧光物质的样品。本方法的最小检出限为0.05μg。 二、实验原理

硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外线下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。

如样品中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后以所得溶液作测定。 三、试剂

1. 正丁醇：优级纯或重蒸馏的分析纯。 2. 无水硫酸钠：分析纯。 3. 淀粉酶。

4. 去离子水或蒸馏水。

5. 0.1mol/L盐酸：8.5mL浓盐酸用水稀释至1000mL。 6. 0.3mol/L盐酸：25.5mL浓盐酸用水稀释至1000mL。

7. 2mol/L乙酸钠溶液：164g无水乙酸钠或2728含水乙酸钠溶于水中稀释至1000mL。 8. 25%氯化钾溶液：250g氯化钾溶于水中稀释至1000mL。

9. 25%酸性氯化钾溶液：8.5mL浓盐酸用25%氯化钾溶液稀释至1000mL。 10. 15%氢氧化钠溶液：15g氢氧化钠溶于水中稀释至100mL。

11. 1%铁氰化钾溶液：1g铁氰化钾溶于水中稀释至100mL。放于棕色瓶内保存。 12. 碱性铁氰化钾溶液：取4mL 1%铁氰化钾溶液，用15%氢氧化钠溶液稀释至60mL。用时现配，避光使用。

13. 3%乙酸溶液：30mL冰乙酸用水稀释至1000mL。

14. 活性人造浮石：称取100g经40目筛的人造浮石，以10倍于其容积的3%热乙酸搅洗2次，每次10min；再用5倍于其容积的25%热氯化钾搅洗15min；然后再用3%热乙酸搅洗10min；最后用热蒸馏水洗至没有氯离子。于蒸馏水中保存。

15. 硫胺素标准贮备液：准确称取100mg经氯化钙干燥24h的硫胺素，溶于0.01mol/L盐酸中，并稀释至1000mL。此溶液每毫升相当0.1mg硫胺素。于冰箱中避光可保存数月。 16. 硫胺素标准中间液：将硫胺素标准贮备液用0.01mol/L盐酸稀释10倍。此溶液每毫升相当10μg硫胺素。于冰箱中避光可保存数月。

17. 硫胺素标准使用液：将硫胺素标准中间液用水稀释100倍，此溶液每毫升相当0.1μg硫胺素。用时现配。

18. 0.04%溴甲酚绿溶液：称取0.1g溴甲酚绿，置于小研钵中，加入1.4mL 0.1mol/L氢氧化钠研磨片刻，再加入少许水继续研磨至完全溶解，用水稀释至250mL。 四、仪器设备

1. 实验室常用仪器设备。 2. 荧光分光光度计。

3. Maizel－Gerson反应瓶。

4. 盐基交换管。 五、操作步骤 1.试样处理

样品采集后用匀浆机打成匀浆(或者将样品尽量粉碎)于低温冰箱中冷冻保存，用时将其解冻后使用。 2.提取

2.1 精确称取一定量试样(估计其硫胺素含量约为10～30μg，一般称取5～20g试样)，置于150mL三角瓶中，加入50～75mL 0.1mol/L或0.3mol/L盐酸使其溶解，瓶口加盖小烧杯

4

后放入高压锅中加热水解10.3×10Pa 30min，凉后取出。

2.2 用2mol/L乙酸钠调其pH值为4.5(以0.04%溴甲酚绿为外指示剂)。

2.3 按每克试样加入20mg淀粉酶的比例加入淀粉酶。于45～50℃温箱过夜，保温(约16h)。

2.4 冷至室温，定容至100mL，然后混匀过滤，即为提取液。 3 净化

3.1 用少许脱脂棉铺于盐基交换管的交换柱底部，加水将棉纤维中气泡排出，再加约1g活性人造浮石使之达到交换柱的三分之一高度。保持盐基交换管中液面始终高于活性人造浮石。

3.2 用移液管加入提取液20～80mL(使通过活性人造浮石的硫胺素总量约为2～5μg)。 3.3 加入约10mL热水冲洗交换柱，弃去洗液。如此重复三次。

3.4 加入25%酸性氯化钾(温度为90℃左右)20mL，收集此液于25mL刻度试管内。冷至室温，用25%酸性氯化钾定容至25mL，即为试样净化液。 3.5 重复5.3.1～5.3.4，将20mL硫胺素标准使用液加入盐基交换管以代替样品提取液，即得到标准净化液。 4. 氧化

4.1 将5mL试样净化液分别加入A、B两个Maizel－Gerson反应瓶。

4.2 在避光暗环境中将3mL 15%氢氧化钠加入反应瓶A，振摇约15s，然后加入10mL正丁醇；将3mL碱性铁氰化钾溶液加入反应瓶B，振摇约15s，然后加入10mL正丁醇；将A、B两个反应瓶同时用力振摇，准确计时1.5min。

4.3 重复4.1～4.2，用标准净化液代替试样净化液。

4.4 用黑布遮盖A、B反应瓶，静置分层后弃去下层碱性溶液，加入2～3g无水硫酸钠使溶液脱水。

5. 荧光强度的测定 5.1 荧光测定条件：

激发波长365nm；发射波长435nm；激发波狭缝5nm；发射波狭缝5nm。 5.2 依次测定下列荧光强度：

a. 试样空白荧光强度(试样反应瓶A)； b. 标准空白荧光强度(标准反应瓶A)； c. 试样荧光强度(试样反应瓶B)； d. 标准荧光强度(标准反应瓶B)。 六、计算

X?(U?Ub)?

式中：

X——样品中硫胺素含量，mg/100g；

U——试样荧光强度；

Ub——试样空白荧光强度； S——标准荧光强度；

Sb——标准空白荧光强度；

V1100C?V?1??(S?Sb)V2m100 0

c——硫胺素标准使用液浓度，μg/mL；

V——用于净化的硫胺素标准使用液体积，mL； V1——试样水解后定容之体积，mL；

V2——试样用于净化的提取液体积，mL； m——试样质量，g；

七、结果的允许误差

同一实验室同时或重复两次测定结果的相对偏差绝对值≤10%。

实验十二 铅含量的测定（二硫腙比色法）

一、实验原理

样品经消化后，在pH8.5～9.0时，铅离子与二硫腙生成红色络合物，溶于三氯甲烷。加入柠檬酸铵、氰化钾和盐酸羟胺等，防止铁、铜、锌等离子干扰，与标准系列比较定量。 二、试剂

1. 氨水(1+1)。

2. 盐酸(1+1)：量取100mL盐酸，加入100mL水中。

3. 酚红指示液(1g/L)：称取0.10g酚红，用少量多次乙醇溶解后移入100mL容量瓶中并定容至刻度。

4. 盐酸羟胺溶液(200g/L)：称取20g盐酸羟胺，加水溶解至50mL，加2滴酚红指示液，加氨水(1+1)，调pH至8.5～9.0(由黄变红，再多加2滴)，用二硫腙－—三氯甲烷溶液提取至三氯甲烷层绿色不变为止，再用三氯甲烷洗二次，弃去三氯甲烷层，水层加盐酸(1+1)呈酸性，加水至100mL。

5. 柠檬酸铵溶液(200g/L)：称取50g柠檬酸铵，溶于100mL水中，加2滴酚红指示液，加氨水(1+1)，调pH至8.5～9.0，用二硫腙—三氯甲烷溶液提取数次，每次10～20mL，至三氯甲烷层绿色不变为止，弃去三氯甲烷层，再用三氯甲烷洗二次，每次5mL，弃去三氯甲烷层，加水稀释至250mL。

6. 氰化钾溶液(100g/L)：称取10.0g氰化钾，用水溶解后稀释至100mL。 7. 三氯甲烷：不应含氧化物。

7.1 检查方法：量取10mL三氯甲烷，加25mL新煮沸过的水，振摇3min，静置分层后，取10mL水液，加数滴碘化钾溶液(150g/L)及淀粉指示液，振摇后应不显蓝色。

7.2 处理方法：于三氯甲烷中加入1/10～1/20体积的硫代硫酸钠溶液(200g/L)洗涤，再用水洗后加入少量无水氯化钙脱水后进行蒸馏，弃去最初及最后的1/10馏出液，收集中间馏出液备用。

8. 淀粉指示液：称取0.5g可溶性淀粉，加5mL水搅匀后，慢慢倒入100mL沸水中，随倒随搅拌，煮沸，放冷备用。临用时配制。

9. 硝酸(1＋99)：量取1mL硝酸，加入99mL水中。

10. 二硫腙三氯甲烷溶液(0.5g/L)：保存冰箱中，必要时用下述方法纯化。

称取0.5g研细的二硫腙，溶于50mL三氯甲烷中，如不全溶，可用滤纸过滤于250mL分液漏斗中，用氨水(1+99)提取三次，每次100mL，将提取液用棉花过滤至500mL分液漏斗中，用盐酸(1+1)

调至酸性，将沉淀出的二硫腙用三氯甲烷提取2～3次，每次20mL，合并三氯甲烷层，用等量水洗涤二次，弃去洗涤液，在50℃水浴上蒸去三氯甲烷。精制的二硫踪置硫酸干燥器中，干燥备用。或将沉淀出的二硫腙用200，200，100mL三氯甲烷提取三次，合并三氯甲烷层为二硫腙溶液。

11. 二硫腙使用液：吸取1.0mL二硫腙溶液，加三氯甲烷至10mL混匀。用1cm比色杯，以三氯甲烷调节零点，于波长510nm处测吸光度(A)，用式(3)算出配制100mL二硫腙使用液(70%透光率)所需二硫腙溶液的毫升数(V)。

12. 硝酸-硫酸混合液(4+1)。

13. 铅标准溶液：精密称取0.1598g硝酸铅，加10mL硝酸(1+99)，全部溶解后，移入100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于1.0mg铅。

14. 铅标准使用液：吸取1.0mL铅标准溶液，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于10.0μg铅。

三、仪器

所用玻璃仪器均用硝酸(10%～20%)浸泡24h以上，用自来水反复冲洗，最后用水冲洗干净；分光光度计。 四、分析步骤

1. 样品预处理

1.1 在采样和制备过程中，应注意不使样品污染。

1.2 粮食、豆类去杂物后，磨碎，过20目筛，储于塑料瓶中，保存备用。

1.3 蔬菜、水果、鱼类、肉类及蛋类等水分含量高的鲜样，用食品加工机或匀浆机打成匀浆，储于塑料瓶中，保存备用。

2. 样品消化

2.1 硝酸—硫酸法：湿式消解法：称取样品1.00～5.00g于三角瓶或高脚烧杯中，放数粒玻璃珠，加10mL混合酸(或再加1～2mL硝酸)，加盖浸泡过夜，加一小漏斗电炉上消解，若变棕黑色，再加混合酸，直至冒白烟，消化液呈无色透明或略带黄色，放冷用滴管将样品消化液洗入或过滤入(视消化后样品的盐分而定)10～25mL容量瓶中，用水少量多次洗涤三角瓶或高脚烧杯，洗液合并于容量瓶中并定容至刻度，混匀备用；同时作试剂空白。

2.2 灰化法

2.2.1 粮食及其他含水分少的食品：称取5.00g样品，置于石英或瓷坩埚中，加热至炭化，然后移入马弗炉中，500℃灰化3h，放冷，取出坩埚，加硝酸(1+1)，润湿灰分，用小火蒸干，在500℃灼烧1h，放冷，取出坩埚。加1mL硝酸(1+1)，加热，使灰分溶解，移入50mL容量瓶中，用水洗涤坩埚，洗液并入容量瓶中，加水至刻度，混匀备用。

2.2.2 含水分多的食品或液体样品：称取5.0g或吸取5.00mL样品，置于蒸发皿中，先在水浴上蒸干，加热至炭化，然后移入马弗炉中，500℃灰化3h，放冷，取出坩埚，加硝酸(1+1)，润湿灰分，用小火蒸干，在500℃灼烧1h，放冷，取出坩埚。加1mL硝酸(1+1)，加热，使灰分溶解，移入50mL容量瓶中，用水洗涤坩埚，洗液并入容量瓶中，加水至刻度，混匀备用。

3. 测定

吸取10.0mL消化后的定容溶液和同量的试剂空白液，分别置于125mL分液漏斗中，各加水至20mL。

吸取0，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50mL铅标准使用液(相当0，1，2，3，4，5μg铅)，分别置于125mL分液漏斗中，各加1mL硝酸(15.9)至20mL。

于样品消化液、试剂空白液和铅标准液中各加2mL柠檬酸铵溶液(20g/L)，1mL盐酸羟胺溶液(200g/L)和2滴酚红指示液，用氨水(1十1)调至红色，再各加2mL氰化钾溶液(100g/L)，混匀。各加5.0mL二硫腙使用液，剧烈振摇1min，静置分层后，三氯甲烷层经脱脂棉滤入1cm比色杯中，以三氯甲烷调节零点于波长510nm处测吸光度，各点减去零管吸收值后，绘制标准曲线或计算一元回归方程，样品与曲线比较。 五、计算

式中：

X3——样品中铅的含量，mg/Kg或mg/L； m7——测定用样品消化液中铅的质量，μg； m8——试剂空白液中铅的质量，μg； m9——样品质量(体积)，g(mL)； V6——样品消化液的总体积，mL； V7——测定用样品消化液体积，mL。

结果的表述：报告平行测定算术平均值的二位有效数。

实验十三 胆碱酯酶抑制法测定有机磷农药残留

一、目的与要求

1．掌握胆碱酯酶抑制法测定有机磷农药残留的原理。 2．学习食品中有机磷农药残留量的快速检测法。 二、实验原理

在一定条件下，有机磷农药对胆碱酯酶的正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酸胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应产生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，可计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否有高剂量有机磷农药的存在。 三、仪器与试剂 1. 仪器

分光光度计；常量天平；恒温水浴或恒温箱。 2. 试剂

（1）pH5.O缓冲溶液 分别取11.9g无水磷酸氢二钾与与3.2g磷酸二氢钾，用蒸馏水溶解。

（2）显色剂 分别取16Omg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氢钠，用20ml缓冲溶液溶解，4℃冰箱中保存。

（3）底物 取25.0mg硫代乙酰胆碱，加3.0mL蒸馏水溶解，摇匀后置4℃冰箱中保存备用。保存期不超过两周。

（4）乙酸胆碱酯酶 根据酶的活性情况，用缓冲溶液溶解，3min的吸光度变化△A0值应控制在0.3以上。摇匀后置4℃冰箱中保存备用，保存期不超过4d。 四、实验步骤 1．样品处理

选取有代表性的蔬菜样品，去掉不可食部分后称取蔬菜试样，冲洗掉表面泥土，剪成1cm左右碎片。取样品1g，放入烧杯或提取瓶中，加入5ml缓冲溶液，振荡l～2min，倒出提取液，静置3～5min，待用。 2．对照溶液测试

先于试管中加入2.5ml缓冲溶液，再加入0.lml酶液、0.lml显色剂，摇匀后于37℃放置15min以上（每批样品的控制时间应一致）。加入0.1mL底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反应3min的吸光度变化值△A0

3．样品溶液测试

先于试管中加入2.5ml样品提取液，其他操作与对照溶液测试相同，记录反应3min的吸光度变化值凸△At。 五、结果计算 抑制率(%)=

?Ao??At?100

?Ao式中:

△Ao——对照溶液反应3mh吸光度的变化值； △At——样品溶液反应3min吸光度的变化值。 六、结果判定

当蔬菜样品提取液对酶的抑制率大于50％时，表示样品中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在，可判定样品为阳性结果（需重复检测两次以上），然后用其他方法进一步定性和定量。

七、注意事项

1．葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整株（体）蔬菜浸提。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提的方法，减少色素的于扰。

2．当温度低于37℃，酶反应的速度随之放慢，加入酶液和显色剂后放置反应的时间应相对延长，延长时间的确定，应以胆碱酯酶空白对照测试的吸光度变化面A0值在0.3以上为准。注意样品放置时间应与空白对照溶液放置时间一致才有可比性。酶的活性不够和温度太低都可能造成胆碱酯酶空白对照溶液3min的吸光度变化面A0值不足0.3。

3．该法适用于大量蔬菜样本的筛测，不适于最后仲裁检测方法。 八、思考题

1. 影响胆碱酶法测定有机农药残留量准确性的因素有哪些？如何减少其影响？ 2. 是否还能用其他的酶来设定测定有机磷农药的方法？ 3. 胆碱酯酶抑制法和气相色谱法各有什么优缺点？

实验十四 油脂的品质检验

一、目的与要求 1．学习实际样品的分析方法，通过对食用植物油脂主要特性的分析，包括试样的制备（包括分离提纯）、分析条件及方法的选择、标准溶液的配制及标定、标准曲线的制作以及数据处理等内容，综合训练食品分析的基本技能。

2．掌握鉴别食用植物油脂品质好坏的基本检验方法。 二、实验原理

食用植物油脂品质的好坏可通过测定其酸价、碘价、过氧化值、羰基价等理化特性来判断。

1．油脂酸价

酸价（酸值）是指中和1.0g油脂所含游离脂肪酸所需氢氧化钾的毫克数。酸价是反映油脂质量的主要技术指标之一，同一种植物油酸价越高，说明其质量越差越不新鲜。测定酸价可以评定油脂品质的好坏和贮藏方法是否恰当。中国《食用植物油卫生标准》规定：花生油、菜子油、大豆油酸价≤4，棉子油酸价≤1。 2．碘价

测定碘价可以了解油脂脂肪酸的组成是否正常有无掺杂等。最常用的是氯化碘-乙酸溶液法（韦氏法）。在溶剂中溶解试样并加入韦氏碘液，氯化碘则与油脂中的不饱和脂肪酸起加成反应，游离的碘可用硫代硫酸钠溶液滴定，从而计算出被测样品所吸收的氯化碘（以碘计）的克数，求出碘价。常见油脂的碘价为：大豆油120～141；棉子油99～113；花生油84～100；菜子油97～103；芝麻油103～116；葵花子油125～135；茶子油80～90；核桃油140～152；棕桐油44～54；可可脂35～40；牛脂40～48；猪油52～77。碘价大的油脂，说明其组成中不饱和脂肪酸含量高或不饱和程度高。 3．过氧化值

检测油脂中是否存在过氧化物以及含量的大小，即可判断油脂是否新鲜和酸败的程度。常用滴定法的原理是：油脂氧化过程中产生过氧化物，与碘化钾作用，生成游离碘，以硫代硫酸钠溶液滴定，计算含量。中国“食用植物油卫生标准（GB2716—85）”规定：过氧化值（出厂）≤0.15％。 4．碳基价

羰基价是指每千克样品中含醛类物质的毫摩尔数。用羰基价来评价油脂中氧化产物的含量和酸败劣度的程度，具有较好的灵敏度和准确性。我国已把羰基价列为油脂的一项食品卫生检测项目。大多数国家都采用羰基价作为评价油脂氧化酸败的一项指标。常用比色法测定总羰基价的原理是：羰基化合物和2，4-二硝基苯胺的反应产物在碱性溶液中形成褐红色或酒红色，在440nm下测定吸光度，可计算出油样中的总羰基价。中国《食用植物油卫生标准》规定：羰基价≤20mmol/kg。 三、仪器与试剂 1．仪器

碘量瓶（250ml）；多种分析天平；分光光度计；10mL具塞玻璃比色管；其他常用玻璃仪器。

2．试剂

（1）酚酞指示剂 （10g／L）溶解1g酚酞于90mL（95％）乙醇与10ml水中。 （2）0.05mol／L氢氧化钾标准溶液。

（3）碘化钾溶液（150g／L）称取15.0g碘化钾，加水溶解至100mL，贮于棕色瓶中。 （4）硫代硫酸钠标准溶液（0.lmol／L）按GB601配制与标定。

（5）韦氏碘液试剂 分别在两个烧杯内称入三氯化碘7.9g和碘8.9g，加入冰醋酸，微热使其溶解，冷却后将两溶液充分混合，然后加冰醋酸并定容至1000ml。

（6）三氯甲烷（A.R.）。 （7）环己烷（A.R.）。 （8）冰醋酸（A.R.）。 （9）可溶性淀粉（A.R.）。

（10）饱和碘化钾溶液 称取14g碘化钾，加10ml水溶解，必要时微热使其溶解，冷却后贮于棕色瓶中。

(11)精制乙醇溶液 取1000ml．无水乙醇，置于2000ml。圆底烧瓶中，加入5g铝粉、10g氢氧化钾，接好标准磨口的回流冷凝管，水浴中加热回流lh，然后用全玻璃蒸馏装置，蒸馏收集馏液。 （12）精制苯溶液 取500ml苯，置于1000mL分液漏斗中，加入50ml硫酸，小心振摇5min，开始振摇时注意放气。静置分层，弃除硫酸层，再加50ml硫酸重复处理一次，将苯层移入另一分液漏斗，用水洗涤3次，然后经无水硫酸钠脱水，用全玻璃蒸馏装置蒸馏收集馏液。 （13）2，4-二硝基苯肼溶液 称取50mg2，4-二硝基苯肼，溶于100ml精制苯中。 （14）三氯乙酸溶液 称取4.3g固体三氯乙酸，加100ml精制苯溶解。

（15）氢氧化钾-乙醇溶液 称取4g氢氧化钾，加100ml精制乙醇使其溶解，置冷暗处过夜，取上部澄清液使用。溶液变黄褐色则应重新配制。 3．学生自配及标定试剂

（1）氢氧化钾标准溶液(0.05mol／L)的标定（按GB601标定或用标准酸标定）.

（2）中性乙醚-乙醇混合液 乙醚-乙醇以体积比2：1混合，以酚酞为指示剂，用所配的KOH溶液中和至刚呈淡红色，且30s内不退色为止。

（3）三氯甲烷-冰醋酸混合液的配制 量取40mL三氯甲烷，加60ml冰醋酸，混匀。 （4）（10g／L）淀粉指示剂的配制 称取可溶性淀粉0.50g，加少许水，调成糊状，倒入50ml沸水中调匀，煮沸至透明，冷却。 （5）0.0020mol／L硫代硫酸钠标准溶液的配制 用0.1mol／L硫代硫酸钠标准溶液稀释。 四、实验步骤

l．酸价测定（参照GB／T5009.37——2003）

（1）分析步骤 称取3.00～5.00g混匀的试样置于锥形瓶中，加入50mL中性乙醚-乙醇混合液，振摇使油溶解，必要时可置于热水中，温热使其溶解。冷至室温，加入酚酞指示剂2～3滴，以氢氧化钾标准溶液滴定，至初现微红色，且0.5min内部退色为终点。 （2）结果计算

试样酸价下列公式计算，结果保留两位有效数字。

X?V?c?56.11 m式中：

X——试样的酸价（以氢氧化钾计），mg/g；

V——试样消耗氢氧化钾标准溶液体积，mL； C——氢氧化钾标准溶液实际浓度，mol/L； M——试样质量，g；

56.11——与1.0mL 1.000mol／L氢氧化钾标准溶液相当的氢氧化钾毫克数。

2．韦氏法碘价测定（参照GB／T5532-1995）

（1）分析步骤 试样的量根据估计的碘价而异（碘价高，所取油样量减少；碘价低，取油样量增多），一般在0.25g左右。将称好的试样放入500mL锥形瓶中，加入20mL环己烷-冰醋酸等体积混合液，溶解试样。准确加入25.00ml韦氏试剂，盖好塞子，摇匀后放于暗处30min以上（碘价低于150的样品，应放1h；碘价高于150的样品，应放2h），反应时间结束后，加入20ml碘化钾溶液（150g／L）和150mL水。用0.lmol／L硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加

几滴淀粉指示剂，继续滴定至剧烈摇动后蓝色刚好消失。在相同条件下，同时做空白对照实验。

（2）结果计算

试样的碘价由下列公式计算：

X?(V2?V1)?c?0.1269?100

m式中：

V1——试样消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL； V2——空白试剂消耗硫代硫酸钠的体积，mL； c——硫代硫酸钠的实际浓度，mol／L； m——试样的质量，g；

0.1269——1／2I2的毫摩尔质量，g／mmol。

3．过氧化值的测定（参考GB／T5009.37——2003第一法）

（1）分析步骤 称取2.00～3.00g混匀的试样（必要时过滤）,置于250ml碘瓶中，加30ml三氯甲烷-冰醋酸混合液，使试样完全溶解。加入1.00mL饱和碘化钾溶液，紧密塞好瓶盖，并轻轻摇匀0.5min,然后在暗处放置3min取出加100mL水，摇匀后，立即用硫代硫酸钠标准滴定溶液（0.0020mol／L）滴定，至淡黄色时，加1ml淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失为终点，用相同量三氯甲烷-冰醋酸溶液、碘化钾溶液、水，按同一方法，做试剂空白试验。 (2)结果计算 试样的过氧化值按下列公式进行计算。 X1?(V2?V1)?c?0.1269?100

m X2=X1×78.8

式中：

X1——每百克试样的过氧化值，g； X2——试样的过氧化值，mmol/kg；

V1——试样消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液体积，mL；

V2——试剂空白消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液体积，mL； c——硫代硫酸钠标准滴定溶液的浓度，mol／mL； m——试样质量，g；

0.1269——于1.00ml1.000mol／L硫代硫酸钠标准滴定溶液相当的碘的质量，g； 78．8——换算因子。

计算结果保留两位有效数字。 （3）精密度要求 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。

4．羰基价测定（参考GB／T5009.37——2003）

（1）分析步骤 精密称取约0.025～0.5g试样置于25mL容量瓶中，加苯溶解试样并稀释至刻度。吸取5.0ml置于25mL具塞试管中，加3mL三氯乙酸溶液及5mL2，4-二硝基苯肼溶液，仔细振摇混匀，在60℃水浴中加热30min冷却后沿试管壁慢慢加入10ml氢氧化钾-乙醇溶液，使成为二液层，塞好并剧烈振摇混匀，放置10min。以1cm比色杯，用试剂空白作参比，于440nm处测吸光度。 （2）结果计算

试样的羰基价按下列公式进行计算。

X?AV854?m?2V1×1000

式中：

X——试样的羰基价，mmol／kg； A——测定时样液吸光度； m——试样质量，g；

V——试样稀释后的总体积，mL； V——测定用试样稀释液的体积，mL；

854——各种醛的毫克当量吸光系数的平均值。 结果保留三位有效数字。

(3)精密度要求 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5％。

五、实验结果综合分析

实验结果综合分析记录于下表。 分析项目 分析方法 分析结果 结论 六、注意事项 1．测定酸价，当样液颜色较深时，可减少试样用量，或适当增加混合溶剂的用量。 2．测定碘价时，光线和水分对氯化钾起作用，影响很大，要求所用仪器必须清洁、干燥，碘液试剂必须用棕色瓶盛装且放于暗处。

3．测定过氧化值时，饱和碘化钾溶液中不可存在游离碘和碘酸盐。 4．光线会促进空气对试剂的氧化，应注意避光存放试剂。

5．在过氧化值的测定中，三氯甲烷，乙酸的比例以及加入碘化钾后静置时间的长短、加水量的多少等对测定结果均有影响，应严格控制试样与空白对照测定条件的一致性；

6．测定羰基价时，所用仪器必须洁净、干燥，所用试剂若含有干扰试验的物质时，必须控制后才能用于实验，空白对照的吸收值（在440nm处，以水对照）超过0.20时，实验所用试剂的纯度就不够理想。 七、思考题

1．油脂中游离脂肪酸与酸价有何关系？测定酸价时加入乙醇有何目的？ 2．哪些指标可以表明油脂的特点？它们表明了油脂哪方面的特点？ 3．本实验中用了哪几种滴定法？它们各有什么特点？有哪些因素影响准确度和精密度？ 4．你对本实验有什么体会？（包括成功的经验及失败的教训）

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