荧光免疫层析试剂技术要点及生产工艺流程

荧光免疫层析试剂技术要点及生产工艺流程

定量技术部：张赛

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荧光免疫层析技术平台

荧光免疫层析试剂的制备荧光免疫层析技术要点荧光免疫层析试剂生产工艺流程

荧光免疫层析技术平台

荧光免疫层析技术平台 定量试剂开发程序阶段划分开题

工作内容预实验&开发计划书确定工艺和反应体系

备注立项评审

阶段1

实验室研究

预临床实验( 100例)稳定性验证(破坏试验)

转化评审

阶段2阶段3结题

生产转化临床验证

三批试生产(3000人份/批)临床验证( 200例)结项评审

荧光免疫层析技术平台 与金标免疫层析法的区别：标记物金标免疫层析金颗粒荧光素

国内首家荧光免疫层析

显色光信号

荧光免疫层析技术平台 LFIA Lateral Flow Immunochromatographic Assay stripControl line对照线

横向流动的免疫诊断试剂条Test line检测线

Sample prefilter pad样品垫

Conjugate pad结合垫 Plastic backing塑料衬垫

Absorbent pad吸水垫 Cellulose nitrate membrane硝酸纤维素膜

荧光免疫层析技术平台 反应模式检测抗体：间接法双抗原夹心法检测抗原：双抗体夹心法——受样本干扰最多检测小分子抗原：竞争法

荧光免疫层析技术平台 检测原理

图谱检测

发射光 (525nm)光源

(蓝光)

激发光 (470nm)

光学系统

荧光免疫层析技术平台 定量方法

以荧光仪检测的T/C比值作为指标进行定标和计算，消除试条间/批内/操作等方面偏差

技术先进性：快速:免疫层析技术----操作简便准确:信号比值定量----降低偏差灵敏:荧光标记技术----信号放大

荧光免疫层析试剂的制备

荧光免疫层析试剂的制备 荧光标记物：荧光微球(Fluorescence Microparticle)粒径：300~500nm(适用于常规免疫层析)

表面修饰基团：-COOH(抗体标记为主)/ -NH3···标记方式：蛋白(Ab)与荧光微球通过共价键结合

荧光标记结合物：以一定稀释比喷涂于样品垫或包被膜上——标记垫、标记膜

荧光免疫层析试剂的制备 标记垫的制备荧光标记物最佳浓度

样品垫buffer玻璃纤维/聚酯纤维喷垫

离子强度，pH值，蛋白保护剂，聚合物，表面活性剂，阻断剂等

干燥24h,湿度<20%

干燥

保存备用

温度4-30℃湿度<20%

荧光免疫层析试剂的制备 包被膜的制备Ab/Ag最佳浓度

包被buffer NC膜孔径喷膜离子强度，pH值，蛋白保护剂

干燥72-144h湿度<20%

干燥

保存备用

温度4-30℃湿度<20%

荧光免疫层析技术要点

荧光免疫层析技术要点 膜的筛选：(1)厂家：Sartorius 95/135 Millipore 90/140

(2)特性：小孔径膜——反应更充分，灵敏度(低浓度)更高大孔

径膜——反应更快速，线性水平(高浓度)更佳与不同粒径胶乳协同筛选★保存条件：原料膜：15~30℃/RH 45~65%包被膜：15~30℃<RH 15%

荧光免疫层析技术要点

荧光免疫层析技术要点 包被工艺：(1)作用力：疏水作用力、静电作用(IgG-Fc段) (2)过程：溶液中的蛋白

蛋白转移到表面区域

蛋白在表面重排吸附

荧光免疫层析技术要点 包被缓冲液：(1) pH:接近MAb等电点

PBS(pH7.4)Tris-Cl(pH8.0) (2)离子强度：确保MAb完全溶解离子强度尽量低——离子强度↗,MAb结合膜稳定性↘ 0.01~0.02M

(3)保护剂：糖类、惰性蛋白类、防腐剂···——选择性使用)★包被buffer不具备液态MAb保存和保护功能，包被工作液必须于喷膜前现配

荧光免疫层析技术要点 抗体要求：纯度>90%——杂蛋白干扰

MAb通常优于PAb

干燥条件：温度：RT (18~26℃)/ 37℃/ 50℃

湿度：<20%;<10%为佳时间：12~48h★湿度越低，干燥速度越快，效果越好液态下的MAb——构象变化非最低能态(分子运动增加)易氧化易长菌

荧光免疫层析技术要点 缓冲系统优化思路：样本稀释液、样品垫处理液、包被液目的：消除、降低个体样本之间的基质、pH差异 pH:8.0? 7.4? 6.0? 4.5?离子强度：100mM? 50mM? 10mM?

思路：①先选pH (选择有效缓冲范围对应的缓冲体系&具备一定离子强度)→②再调离子强度→③添加功能性物质

荧光免疫层析技术要点 基本成分及功能： 1)缓冲系统：磷酸，碳酸，硼酸，Tris,生物缓冲液等。没有通用的缓冲液，不同的系统必须分别优化。 2)表面活性剂，具有增加亲水性，促进结合等作用，常用的有Tween-20, Tritonx-100等。 3)大分子物质，作为胶乳微球干燥后均匀散布的骨架，常用的有PEG4000, PEG20000,PVP,PVA等 4)惰性蛋白，它是保护目的蛋白的活性，消除非特异性的封闭物质，也起着有分散胶乳微球颗粒的骨架作用。 BSA、OVA、Casein。 5)小分子保护物质对蛋白活性保护，蛋白储存常用的甘油、蔗糖、海藻糖、各类低聚糖等，对产品的储存稳定性有帮助。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/7fnm.html