Ⅲ—01 血清γ球蛋白的分离与纯化知识讲解

Ⅲ—01血清γ球蛋白的分离与纯化

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Ⅲ—01 血清γ球蛋白的分离与纯化【目的要求】

1.掌握分离纯化蛋白质的基本原理和基本过程。

2.熟悉盐析、离心、层析、电泳、比色等生物化学基本技术在蛋白质分离纯化中的综合应用。

4.学会设计和制定分离纯化蛋白质的实验方案、技术路线和质量监控和保证措施。

【实验原理】

不同蛋白质的理化性质和生物学性质各有不同，利用这些不同便可获得分离纯化。

血清蛋白有300多种,可粗略分成清、球蛋白两大类，γ球蛋白只是球蛋白中的一个亚类。欲用常规方法获得，可先用半饱和硫酸铵从血清中盐析出球蛋白，接着用葡聚糖凝胶G—25（Sephadex—25）脱去球蛋白中的盐分（硫酸铵），最后用DEAE（二乙基氨基乙基）纤维素阴离子交换柱，便可直接从脱盐的球蛋白溶液中分离纯化出γ球蛋白，其反应机理如下：

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被柱层析交换结合的α球蛋白和β球蛋白，可通过增加洗脱液的离子强度或降低洗脱的pH值（也可两者同时改变），使其分部洗脱下来而被纯化。

纯化前后的γ球蛋白可用电泳方法进行比较鉴定。

【实验准备】

一、器材

1.离心机

2.层析柱(直径约1-1.2cm,长约30cm)

3.电泳仪

二、试剂

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精品资料

仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢4 1.饱和(NH 4)2SO 4溶液 称固体(NH 4)2SO 4（分析纯）850g 置于1,000ml 蒸馏水

中，在70～80℃水中搅拌溶解，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和(NH 4)2SO 4液。

2.葡聚糖凝胶G —25按每100ml 凝胶床需干的葡聚糖凝胶G —25 25g ，置于锥形瓶中，按每克干胶加入蒸馏水约30ml ，轻轻摇匀并于沸水浴中加热1小时，或于室温浸泡24小时，搅拌后稍静置，倾去上清细粒，用蒸馏水漂洗。

3.0.075mol/L pH6.3磷酸缓冲液(pH6.3 PBS)

⑴0.0175mol/L NaH 2PO 4液 秤取NaH 2PO 4 2H 2O 2.730g 溶于100ml 蒸馏水

中，转入1000cc 容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度即成。

⑵0.0175mol/L Na 2HPO 液 秤取Na 2HPO 4·12H 2O 6.269g ，如⑴配制即成。

取⑴液77.5ml 、⑵液22.5ml ，混匀后即成0.075mol/L pH6.3的磷酸缓冲液。

4.20%磺基水杨酸。

5.Nesseler 试剂

6.血清醋酸纤维薄膜电泳实验的全套仪器及试剂。

7.DEAE （二乙氨基乙基）纤维素处理 按100ml 柱床体积称取DEAE 纤维素14g ，每克加0.5mol HCl 15ml 搅拌，放置30分钟（HCl 处理时间不可太长，否则DEAE —纤维素变质），加约10倍量的蒸馏水搅匀，放置片刻，待纤维素下沉后，倾弃含细微悬浮物的上层液，如此反复2～3次，沉淀30分钟，虹吸吸去上清或布氏漏斗抽滤，如此水洗至清液pH>4为止。加等体积1mol NaOH ，使最终浓度约为0.5mol NaOH ，搅拌后，放置30分钟，以虹吸吸去上层液体，同上用蒸馏水反复洗至pH<7为止，虹吸吸去上层液体，然后加入0.0175mol/L pH6.3磷酸缓冲液使之平衡，置4℃冰箱内保存备用。

【实验操作】

1.(NH 4)2SO 4盐析 取血清

2.0ml ，缓慢滴入饱和（NH 4）2SO 4溶液2.0ml ，边加

边搅，混匀后于室温中放置10分钟，然后3000转离心10分钟，并小心倾去上

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