植物生理学实验指导

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实验一叶绿体色素提取分离与理化性质及含量测定

一、实验目的和意义

绿色植物的光合作用是在叶绿体中的叶绿体色素中进行的，了解叶绿体色素的组成、性质及测定对于理解光合作用的本质很有帮助。因此，测定叶绿素含量便成为研究光合作用与氮代谢必不可少的手段，在作物育种、科学施肥、看叶诊断中有着广泛的应用

二、实验原理

植物叶绿体色素是吸收太阳光能，进行光合作用的重要物质。它一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。色素分离的方法有多种，纸层析是最简便的一种。当溶剂（有机推动剂）不断从纸上流过时，由于混合物（叶绿素提取液）中各种成分在固定相（滤纸纤维素所吸附的水分）和流动相（有机推动剂）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。

叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。

叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。

叶绿素中的镁可以被氢离子所取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜则成为

铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。

测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度D，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。

Ca=12.7D663 –2.69 D645（3）

Cb=22.9 D645 –4.68D663（4）

Ck=4.7D440- 0.27Ca+b

三、实验材料和器材

1、实验材料

菠菜或白菜叶片

2、器材：722型分光光度计、电子天平、量筒、研钵、剪刀、漏斗、滤纸、移液管（1mL）、试管及试管架、洗耳球、酒精灯、电筒等。

试剂：丙酮、80%丙酮、醋酸酮、5%盐酸、碳酸钙、石英砂等

四、实验步骤

1.叶绿体色素的提取

（1）取植物新鲜叶片1克，洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放人研钵中。

2-3 mL95％（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，2-3 mL95%乙醇，研磨至糊状，再加

乙醇，过滤，即得色素提取液。

2.叶绿体色素的分离

点样：取前端剪成三角形的滤纸条，用毛细管取叶绿素提取液点样，注意每次所点溶液不可过多，点样后晾干，再重复操作数次。

分离：在大试管中加入推动剂，然后将滤纸固定于胶塞的小钩上，插入试管中，使尖端浸入溶剂内（色点要高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁），盖紧胶塞，直立于阴暗处层析。

当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，观察色带的分布。叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为黄色，胡萝卜素为橙黄色。用铅笔标出各种色素的位置和名称。

将上一个实验中提取的叶绿体色素溶液适当稀释后，进行以下实验：

3.荧光现象的观察。

取l支试管加入浓的叶绿体色素提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同，可观察到反射出暗红色的荧光。

4.氢和铜对叶绿素分子中镁的取代作用

方法一；取两支试管。第一支试管加叶绿体色素提取液2mL，作为对照。第二支试管加叶绿体色素提取液2 mL，再加入稀盐酸1滴，摇匀，观察溶液颜色变化。当溶液变竭后，再加入少量醋酸铜粉末，微微加热，观察记录溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。解释其颜色变化原因。

5.皂化作用（绿色素与黄色素的分离）

取叶绿体色素提取液2 mL于大试管中，加入4mL乙醚，摇匀，再沿试管壁慢慢加人3～6mL蒸馏水，轻轻混匀，静置片刻，溶液即分为两层，色素已全部转入上层乙醚中。用滴管吸取上层绿色层溶液，放入另一试管中，再用蒸馏水冲洗一、二次。在色素乙醚溶液中加入30％KOH－甲醇溶液1mL（？？），充分摇匀，再加入蒸馏水约3 mL，摇匀静置。可以看到溶液逐渐分为两层，下层是水溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b，上层是乙醚溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。将上下层放入两试管中，可供观察吸收光谱用。

5.叶绿体色素吸收光谱曲线

将上述叶绿体色素提取液注入1cm比色杯中，另取95%乙醇作空白，于400-700nm之间，每间隔10nm读取光密度值。根据测定结果，以波长为横坐标绘制曲线，此即叶绿体色素的吸收光谱曲线。用同样的方法测定皂化作用中分离出绿色素与黄色素的吸收光谱曲线，并对结果进行分析。

6. 叶绿体色素含量测定

（1）取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎，混匀。

（2）称取剪碎的新鲜样品0.5g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3mL80％丙酮，研成匀浆，再加80％丙酮5mL，继续研磨至组织变白。

(3）转移到25mL棕色容量瓶中，用少量80％丙酮冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入容量瓶中。最后用80％丙酮定容至25mL，摇匀。离心或过滤。

(4）将上述色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以80％丙酮为空白，在波长663nm、645nm、652nm和440nm下测定光密度。

四、实验结果计算

将测得的光密度值代入公式，分别计算叶绿素a、b、a+b和类胡萝卜素的浓度（mg／L）。 Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645…………(5)

Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663…………(6)

叶绿素总量CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663……(7)

Ck=4.7D440- 0.27Ca+b

并按下式计算组织中单位鲜重或干重的各色素的含量：

色素浓度（mg／L）×提取液总体积×稀释倍数

色素在叶片中的含量（%）= ×100% 样品重量（mg）×1000

稀释倍数：若提取液未经稀释，则取1

1.试述叶绿体色素的吸收光谱特点及生理意义。

2.在皂化反应中加入乙醚有什么作用？

实验二改良半叶法测光合作用强度

改良半叶法是将植物对称叶片的一部分遮光或取下置于暗处, 另一部分则留在光下进行光合作用, 过一定时间后, 在这两部分叶片的对应部位取同等面积, 分别烘干称重。因为对称叶片的两对应部位的等面积的干重, 开始时被视为相等, 照光后叶片重量超过暗中的叶重, 超过部分即为光合作用产物的产量, 并通过一定的计算可得到光合作用强度。

2 . 实验试剂三氯乙酸

3 . 实验材料田间有代表性的植物叶片

实验三种子生命力的快速测定

Ⅰ．TTC法

一、原理

TTC（2，3，5-三苯基氯化四氮唑）的氧化态是无色的，可被氢还原成不溶性的红色三苯甲月替（TTF）。应用TTC的水溶液浸泡种子，使之渗入种胚的细胞内，如果种胚具有生命力，其中的脱氢酶就可以将TTC作为受氢体使之还原成为三苯甲月替而呈红色，如果种胚死亡便不能染色，种胚生命力衰退或部分丧失生活力则染色较浅或局部被染色，因此，可以根据种胚染色的部位或染色的深浅程度来鉴定种子的生命力。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：水稻、小麦、玉米、棉花、油菜等待测种子。

（二）仪器设备：1）小烧杯；2）刀片；3）镊子；4）温箱。

（三）试剂：0.12％～0.5％TTC溶液（TTC可直接溶于水，溶于水后，呈中性，pH7±0.5，不宜久藏，应随用随配）。

三、实验步骤

1）将种子用温水（约30℃）浸泡2～6h，使种子充分吸胀。

2）随机取种子100粒，水稻种子要去壳，豆类种子要去皮，然后沿种胚中央准确切开，取其一半备用。

3）将准备好的种子浸于TTC试剂中，于恒温箱（30～35℃）中保温30min。

4）染色结束后要立即进行鉴定，因放久会褪色。倒出TTC溶液，再用清水将种子冲洗1～2次，观察种胚被染色的情况，凡种胚全部或大

部分被染成红色的即为具有生命力的种子。种胚不被染色的为死种子，如果种胚中非关键性部位（如子叶的一部分）被染色，而胚根或

胚芽的尖端不染色都属于不能正常发芽的种子。

Ⅱ．染料染色法

一、原理

有生命力种子胚细胞的原生质膜具有半透性，有选择吸收外界物质的能力，一般染料不能进入细胞内，胚部不染色。而丧失生命力

的种子，其胚部细胞原生质膜丧失了选择吸收能力，染料可自由进入细胞内使胚部染色。所以可根据种子胚部是否被染色来判断种子的

生命力。

二、材料、设备及试剂

（一）材料：水稻、玉米、大豆、棉花、小麦及一些树木种子。

（二）设备：1）小烧杯；2）刀片；3）镊子；

（三）试剂：0.02％～0.2％靛红溶液或5％红墨水（酸性大红G）。

三、实验步骤同TTC法。

Ⅲ、荧光法

一、原理

植物种子中常含有一些能够在紫外线照射下产生荧光的物质如某些黄酮类、香豆素类、酚类物质等，在种子衰老过程中，这些荧光物质的结构和成分往往发生变化，因而荧光的颜色也相应地有所改变；而且这些种子在衰老死亡时，内含荧光物质虽然没有改变，但由于生命力衰退或已经死亡的细胞原生质之透性增加，当浸泡种子时，细胞内的荧光物质很容易外渗。因此，可以根据前一种情况直接观察种胚荧光的方法来鉴定种子的生命力，或根据后一种情况通过观察荧光物质渗出的多少来鉴定种子的生命力。

二、材料及设备

1）待测的植物种子；2）紫外光灯；3）白纸（不产生荧光的）；4）刀子；5）镊子；6）培养皿；7）烧杯。

三、实验步骤

1）直接观察法：这种方法适用于禾谷类、松柏类及某些蔷薇科果树的种子生命力的鉴定，但种间的差异较大。用刀片沿种子的中心线将

种子切为两半，使其切面向上放在无荧光的白纸上，置于紫外光灯下照射并进行观察、记载。有生命力的种子在紫外光的照射下将产生

明亮的蓝色、蓝紫色或蓝绿色的荧光；丧失生命力的死种子在紫外光照射下多呈黄色、褐色以至暗淡无光，并带有多种斑点。随机选取

20粒待测种子按上述方法进行观察并记载有生命力及丧失生命力的种子的数目，然后计算有生命力种子所占百分数。与此同时也作一平

行的常规发芽试验，计算其发芽率作为对照。

2）纸上荧光：随机选取50粒完整无损的种子置烧杯内加蒸馏水浸泡10~15min令种子吸胀，然后将种子沥干，再按0.5cm的距离摆放在湿

滤纸上（滤纸上水分不宜过多，防止荧光物质流散）以培养皿覆盖静置数h后将滤纸（或连同上面摆放的种子）风干（或用电吹风吹干）。

置紫外光灯下照射，可以看到摆过死种子的周围有一圈明亮的荧光团，而具有生命力的种子周围则无此现象。根据滤纸上显现的荧光团

的数目就可以测出丧失生命力的种子的数量，并由此计算出有生命力种子所占的百分率。此外，可与此同时作一平行的常规种子萌发试

验计算其发芽率作为对照。这个方法应用于白菜、萝卜等十字花科植物种子生命力的鉴定上效果很好。但对于一些在衰老、死亡后减弱

或失去荧光的种子便不适用此法，因此，对它们只宜采用直接察法。

实验四植物抗逆性的鉴定（电导仪法）

一、原理

植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要的作用。在正常情况下，细胞膜对物质具有选择透性能力。当植物受到逆境

影响时，如高温或低温，干旱、盐渍、病原菌侵染后，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以致植物细胞浸提

液的电导率增大。膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也与植物抗逆性的强弱有关。这样，比较不同作物或同一作物不同品种在相

同胁迫温度下膜透性的增大程度，即可比较作物间或品种间的抗逆性强弱，因此，电导法目前已成为作物抗性栽培、育种上鉴定植物抗

逆性强弱的一个精确而实用的方法。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：小麦、女贞叶片；

（二）仪器设备：1）电导仪；2）天平；3）温箱；4）真空干燥器；5）抽气机；6）恒温水浴锅；7）注射器。

（三）试剂：NaCl溶液

四、实验步骤

1）制作标准曲线：如需定量测定透性变化，可用纯NaCl配成0、10、20、40、60、80、100μg/ml的标准液，在20～25℃恒温下用电导仪测

定，可读出电导度。

2）选取小麦或其他植物在一定部位上生长叶龄相似的叶子若干，剪下后，先用纱布拭净，称取二份，各重2g。

3）一份插入小杯中放在40℃恒温箱内萎蔫0.5～1h，另一份插入水杯中放在室温下做对照。处理后分别用蒸馏水冲洗二次，并用洁净滤纸

吸干。然后剪成长约1cm小段放入小玻杯中（大小以够容电极为度），并用玻棒或干净尼龙网压住，在杯中准确加入蒸馏水20ml，浸没叶片。

4）放入真空干燥器，用抽气机抽气7～8min以抽出细胞间隙中的空气；重新缓缓放入空气，水即被压入组织中而使叶下沉。

5）将抽过气的小玻杯取出，放在实验桌上静置20min，然后用玻棒轻轻搅动叶片，在20～25℃恒温下，用电导仪测定溶液电导率。

6）测过电导率的之后，再，放入100℃沸水浴中15min，以杀死植物组织，取出放入自来水冷却10min，在20～25℃恒温下测其煮沸电导率。

五、实验结果及分析

比较不同处理（萎蔫处理与对照）的叶片细胞透性的变化情况，记录结果，并加解释。

实验五植物激素及生长调节剂的生理效应观察

(选做实验)

II 生长调节对果实发育的影响

[实验目的]

1.了解赤霉素对茎伸长作用。

2.了解乙烯对果实的催熟作用。

3. 植物生长调节剂对植物插条不定根发生的影响

[实验原理]

赤霉素对种子萌发及茎伸长有促进作用；适当浓度的乙烯利能促进果实成熟。用

植物生长调节剂（生长素类、生长延缓剂等）处理插条，可以促进细胞恢复分裂能力，诱导根原基发生，促进不定根的生长；容易生根的植物经处理后，发根提早，成活率提高；对木本植物进行插条处理，提高生根率。移栽的幼苗被生长调节剂处理后，移栽后的成活率提高，根深苗壮。本实验通过测定植物生长的重要生理指标——根的活力和过氧化物酶活性，以了解生长调节剂促进不定根发生作用。

[器材与试剂]

1.实验仪器塑料盆，量筒，移液管，容量瓶，烧杯，标签，天平，称量纸，滴管，

角匙

2.实验试剂 100mg/L 赤霉素GA3，40%乙烯利，1000mg/L吲哚丁酸溶液（称取100mg

吲哚丁酸,加90%酒精0.2mL溶解,用蒸馏水定容至100mL）

3.实验材料番茄或白菜种子和幼苗，没成熟大蕉或柿子，非洲蓬琪菊枝条等

[实验步骤]

1. 赤霉素对种子萌发及对茎伸长作用

（1）用100mg/L喷或涂在小苗的地上部分，过两天观察结果。

2.乙烯利对果实的催熟作用

（1）将采收后的大蕉（或香蕉、柿子、芒果等）用500mg/L乙烯溶液浸泡5s，以蒸

馏水浸泡作对照，取出果实分别放在箩筐或纸箱内，室温保存。