2011引物设计作业范例

《基因工程药物与基因工程技术》作业（二）范例：

作业题目：参考作业范例，设计克隆大肠杆菌中某个酶的基因，注明ORF，预测引物的二级结构。

要求检查正反向引物是否配对，如果有配对，需重新设计引物。

范例：设法克隆色氨酸酶（tryptophanase）的基因 1、 序列

在大肠杆菌基因解析文件中搜索找到tryptophanase相关信息，摘录如下： gene 3886753..3888168 /gene=\ /locus_tag=\

/note=\ /db_xref=\ /db_xref=\ /db_xref=\ CDS 3886753..3888168 /gene=\ /locus_tag=\ /EC_number=\

/function=\ acids\

/GO_process=\ /note=\ /codon_start=1 /transl_table=11

/product=\ PLP-dependent\

/protein_id=\ /db_xref=\ /db_xref=\

/db_xref=\ /db_xref=\ /db_xref=\ /db_xref=\

/translation=\ DVFIDLLTDSGTGAVTQSMQAAMMRGDEAYSGSRSYYALAESVKNIFGYQYTIPTHQG RGAEQIYIPVLIKKREQEKGLDRSKMVAFSNYFFDTTQGHSQINGCTVRNVYIKEAFD TGVRYDFKGNFDLEGLERGIEEVGPNNVPYIVATITSNSAGGQPVSLANLKAMYSIAK KYDIPVVMDSARFAENAYFIKQREAEYKDWTIEQITRETYKYADMLAMSAKKDAMVPM GGLLCMKDDSFFDVYTECRTLCVVQEGFPTYGGLEGGAMERLAVGLYDGMNLDWLAYR IAQVQYLVDGLEEIGVVCQQAGGHAAFVDAGKLLPHIPADQFPAQALACELYKVAGIR AVEIGSFLLGRDPKTGKQLPCPAELLRLTIPRATYTQTHMDFIIEAFKHVKENAANIK GLTFTYEPKVLRHFTAKLKEV\

在DNA序列文件中找到相应的序列3886753..3888168

3886741 aaggattatg taatggaaaa ctttaaacat ctccctgaac cgttccgcat tcgtgttatt 3886801 gagccagtaa aacgtaccac tcgcgcttat cgtgaagagg caattattaa atccggtatg 3886861 aacccgttcc tgctggatag cgaagatgtt tttatcgatt tactgaccga cagcggcacc 3886921 ggggcggtga cgcagagcat gcaggctgcg atgatgcgcg gcgacgaagc ctacagcggc 3886981 agtcgtagct actatgcgtt agccgagtca gtgaaaaata tctttggtta tcaatacacc 3887041 attccgactc accagggccg tggcgcagag caaatctata ttccggtact gattaaaaaa 3887101 cgcgagcagg aaaaaggcct ggatcgcagc aaaatggtgg cgttctctaa ctatttcttt 3887161 gataccacgc agggccatag ccagatcaac ggctgtaccg tgcgtaacgt ctatatcaaa 3887221 gaagccttcg atacgggcgt gcgttacgac tttaaaggca actttgacct tgagggatta 3887281 gaacgcggta ttgaagaagt tggtccgaat aacgtgccgt atatcgttgc aaccatcacc 3887341 agtaactctg caggtggtca gccggtttca ctggcaaact taaaagcgat gtacagcatc 3887401 gcgaagaaat acgatattcc ggtggtaatg gactccgcgc gctttgctga aaacgcctat 3887461 ttcatcaagc agcgtgaagc agaatacaaa gactggacca tcgagcagat cacccgcgaa 3887521 acctacaaat atgccgatat gctggcgatg tccgccaaga aagatgcgat ggtgccgatg 3887581 ggcggcctgc tgtgcatgaa agacgacagc ttctttgatg tgtacaccga gtgcagaacc 3887641 ctttgcgtgg tgcaggaagg cttcccgaca tatggcggcc tggaaggcgg cgcgatggag 3887701 cgtctggcgg taggtctgta tgacggcatg aatctcgact ggctggctta tcgtatcgcg 3887761 caggtacagt atctggtcga tggtctggaa gagattggcg ttgtctgcca gcaggcgggc 3887821 ggtcacgcgg cattcgttga tgccggtaaa ctgttgccgc atatcccggc agaccagttc 3887881 ccggcacagg cgctggcctg cgagctgtat aaagtcgccg gtatccgtgc ggtagaaatt 3887941 ggctctttcc tgttaggccg cgatccgaaa accggtaaac aactgccatg cccggctgaa 3888001 ctgctgcgtt taaccattcc gcgcgcaaca tatactcaaa cacatatgga cttcattatt 3888061 gaagccttta aacatgtgaa agagaacgcg gcgaatatta aaggattaac ctttacgtac 3888121 gaaccgaaag tattgcgtca cttcaccgca aaacttaaag aagtttaatt aatactacag

ORF去除空格、回车键和数字后的序列

aaggattatgtaatggaaaactttaaacatctccctgaaccgttccgcattcgtgttattgagccagtaaaacgtaccactcgcgcttatcgtgaagaggcaattattaaatccggtatgaacccgttcctgctggatagcgaagatgtttttatcgatttactgaccgacagcggcaccggggcggtgacgcagagcatgcaggctgcgatgatgcgcggcgacgaagcctacagcggcagtcgtagctactatgcgttagccgagtcagtgaaaaatatctttggttatcaatacaccattccgactcaccagggccgtggcgcagagcaaatctatattccggtactgattaaaaaacgcgagcaggaaaaaggcctggatcgcagcaaaatggtggcgttctctaactatttctttgataccacgcagggccatagccagatcaacggctgtaccgtgcgtaacgtctatatcaaagaagccttcgatacgggcgtgcgttacgactttaaaggcaactttgaccttgagggattagaacgcggtattgaagaagttggtccgaataacgtgccgtatatcgttgcaaccatcaccagtaactctgcaggtggtcagccggtttcactggcaaacttaaaagcgatgtacagcatcgcgaagaaatacgatattccggtggtaatggactccgcgcgctttgctgaaaacgcctatttcatcaagcagcgtgaagcagaatacaaagactggaccatcgagcagatcacccgcgaaacctacaaatatgccgatatgctggcgatgtccgccaagaaagatgcgatggtgccgatgggcggcctgctgtgcatgaaagacgacagcttctttgatgtgtacaccgagtgcagaaccctttgcgtggtgcaggaaggcttcccgacatatggcggcctggaaggcggcgcgatggagcgtctggcggtaggtctgtatgacggcatgaatctcgactggctggcttatcgtatcgcgcaggtacagtatctggtcgatggtctggaagagattggcgttgtctgccagcaggcgggcggtcacgcggcattcgttgatgccggtaaactgttgccgcatatcccggcagaccagttcccggcacaggcgctggcctgcgagctgtataaagtcgccggtatccgtgcggtagaaattggctctttcctgttaggccgcgatccgaaaaccggtaaacaactgccatgcccggctgaactgc

tgcgtttaaccattccgcgcgcaacatatactcaaacacatatggacttcattattgaagcctttaaacatgtgaaagagaacgcggcgaatattaaaggattaacctttacgtacgaaccgaaagtattgcgtcacttcaccgcaaaacttaaagaagtttaattaatactacag （其中的蓝色序列为ORF） 为了方便PCR产物重组至载体中，考虑在PCR产物中引入两个价格便宜的限制性内切酶位点，比如BamHI和HindIII 位点，首先要搜索一下这个目标序列里是否有这两个酶的识别位点。用DNASIS搜索限制性内切酶位点，开启QQ程序，方便截图。

搜索结果

发现基因中不存在BamHI和HindIII 位点，故正反向引物的5’端分别引入BamHI和HindIII序列

ORF的检查：利用DNASIS软件的Translate功能将核苷酸

Internet Explorer.lnk信

息翻译成为氨基酸序列，ATG为起始密码子。氨基酸分别用单字母和三字母表示。（建议使用word格式呈现氨基酸序列）

三字母表示氨基酸（部分）

单字母表示氨基酸：

2、 引物设计：

正向引物：5’ gccggatccatggaaaactttaaacatct 3’

Tm 1= ℃ （蓝色部分序列 at算2℃，gc算4℃ ） Tm2= ℃ （全长序列at算2℃，gc算4℃）

二级结构预测：采用“Print Screen Sys Rq”键截屏，在“画图”软件中编辑的方法获得 或者采用QQ工具：“Ctrl+Alt+A” 截屏，双击复制、粘贴得到。

选取ORF3’末端的序列，“反向+互补”，在5’末端添加保护性碱基和HindIII的识别序列AAGCTT。

反向引物：5’ gggaagcttttaaacttctttaagttttgcggtg3’ Tm 1= ℃ Tm2= ℃（计算方法同正向引物）

二级结构预测：

虽然内部有发夹结构，3’末端还是游离的。

正反向引物互补配对情况的检查：

取正向引物末端的四个碱基atct 反向互补后的序列为agat，在反向引物中没有找到

取反向引物末端的四个碱基ggtg

反向互补后的序列为cacc，在反向引物中没有找到 说明正反向引物没有互补配对配对现象。

PCR产物理论长度为： （3888168-3886753）+1+9+9= 1432 bp 蛋白质分子量预测：（3888168-3886753+1-3）/3*110= 51，810D （约52 KD） 110为氨基酸平均分子量

引物委托合成之E-mail

XXX公司：

请合成以下引物: TnaA-1（引物编号）：5’ gccggatccatggaaaactttaaacatct 3’ 29 bp

TnaA-2（引物编号）：5’ gggaagcttttaaacttctttaagttttgcggtg 3’ 34 bp 共合成2OD，每支1OD，价格1.2元/bp

送货地点：月亮大学药学院生物制药02班； 发票开：月亮大学 联系电话：1234567890

奥巴马

2105年13月32日

以下PCR卡片为林陈水课题组设计使用，版权所有，除作业外，不得翻印！！！！！！！

PCR卡片 No.

DNA产物名称 产物理论长度 模板 正向引物（10uM） 反向引物（10uM） dNTP 10X Buffer Mg2+ DNA Polymerase H2O Total Volume 采用程序所在目录 加量 μL μL μL μL μL μL μL μL μL bp 课题 目的 终浓度 种类： 备注 引物名称： 引物名称： 进货日期： 进货日期： 公司 公司 PCR过程设定

步 骤 1 2 3 4 5 6 7 8 9 温 度 94℃ 94℃ 55 ℃ ℃ GOTO 2 94℃ ℃ ℃ GOTO 5 72℃ 4℃ 步骤 1 2 3 4 5 6 温度 94℃ 94℃ ℃ ℃ GOTO2 72℃ 4℃ 10 min 10 min ----------- ------------ 时间 3min 30s s s 循环数 --------- 10 min 10 min ---------- ---------- s s s 时 间 3min 30 s s s 循 环 数 -------- 实验耗时： 小时 分 实验起始时间： ： 实验耗时： 小时 分 实验起始时间： ： 实验结果：□阳性： □阴性 实验者：_______________________ 结果分析：_胶浓度_ ％________________________________________________ 琼脂糖电泳结果示意： 日期：200 年_____月__ _日

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