碱性磷酸酶特性及其应用的研究进展

碱性磷酸酶特性及其应用的研究进展

王秋颖

(河北旅游职业学院,河北承德 067000)

摘要:碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)是一种非特异性磷酸单酯酶,能催化磷酸单酯的水解反应,产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖,也能催化磷酸基团的转移反应。A P广泛存在于微生物和动物体内,在磷生物地球化学循环过程中有重要作用,并广泛应用于诊断学、生物化学及分子生物学等领域。作者对碱性磷酸酶的研究历史、催化作用机制及其应用进行了综述。

关键词:碱性磷酸酶;非特异性磷酸单酯酶;催化作用机制

中图分类号:Q50 文献标识码:A 文章编号:1671 7236(2011)01 0157 04

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,EC3.1.3. 1,AP)是非特异性磷酸单酯酶,可以催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应,生成无机磷酸和相应的醇、酚、糖等,还可以催化磷酸基团的转移反应,且大肠杆菌A P还是一种依赖亚磷酸盐的氢化酶(Yang 等,2004)。AP存在于除高等植物外几乎所有的生物体内,可直接参加磷代谢,在钙、磷的消化、吸收、分泌及骨化过程中发挥了重要的作用。1911年Levene等、1912年Grosser等分离到(碱性)磷酸酯酶;1934年,Davis提出了碱性磷酸酶这一命名; 1958年,Agr en等用同位素标记的方法分离到磷酸丝氨酸;1961年,Schw artz在大肠杆菌中也发现了这一复合物,并认为丝氨酸可能是AP活性部位的组成成分;1962年,Plocke等证实AP是一种金属酶;1981年,Bradshaw测定了大肠杆菌AP氨基酸全序列,并克隆了大肠杆菌AP的基因p hoA;之后多种生物AP的基因相继被克隆,近些年对AP的结构、作用机制和功能的研究越发深入,使AP的应用更加广泛。作者对碱性磷酸酶的研究历史、催化作用机制及其应用进行了综述。

1 大肠杆菌碱性磷酸酶

20世纪80年代相继完成了大肠杆菌AP、人胎盘型AP、人肝/骨/肾型A P、人小肠型AP和酿酒酵母AP氨基酸序列的测定,通过序列比较发现相似性为25%~30%,活性部位高度保守,都保留了Ser102残基、A rg166及金属离子配体,这些保守的与催化活性相关的基团暗示了不同来源的AP具有

收稿日期:2010 07 08

作者简介:王秋颖(1976-),女,河北人,硕士,讲师,主要从事生物大分子结构与功能关系研究。相似的作用机制。另外,功能相似的磷酸二酯酶,如蜡状芽孢杆菌中的磷脂酶C、桔青霉中核酸酶P1,它们的活性部位和金属离子结合位点与大肠杆菌AP相似。所以,大肠杆菌A P还可作为其它磷酸酯酶和以金属离子作辅助因子的磷酸酯酶的研究模型。

1.1 大肠杆菌碱性磷酸酶的一级结构 大肠杆菌AP是由两条多肽链组成的同型二聚体金属蛋白酶,每个单体包含449个氨基酸,单体分子质量47 ku,有3种同工酶:同工酶1的NH2 末端有一个Arg残基,同工酶3的NH2 末端无Arg残基,同工酶2是这两种形式的异源二聚体。AP单体在细胞中合成后,在富含亮氨酸的N末端信号序列的引导下,定位在周质间隙并二聚化,成为有催化活性的酶分子。大肠杆菌A P分泌过程是由具有AT P酶活性的分泌蛋白SecA和陪伴蛋白SecB催化(Khokhlova等,2004)。Kononova等(2000)研究结果证明,AP输出信号不仅存在于AP前体,也存在于成熟AP的N 末端,且其一级结构会影响AP分泌功能和酶活力。

1.2 大肠杆菌碱性磷酸酶的空间结构 1973年, Knox等首先解析了大肠杆菌AP的7.7 三维结构;1985年,So w adski得到

2.8 结构;1991年, Kim等将分辨提高至2.0 ;2000年,Stec等得出1.75 结构,更详细的阐明了酶分子的活性部位和催化反应机制。大肠杆菌A P整个分子约100 50 50 ,每个单体各有一个活性部位;酶分子整体上呈现出 / 拓扑结构,分子中央是10层 折叠片,两侧有15个长度不等的 螺旋,分子顶部还有一个3层 折叠和一个小的 螺旋;每个活性部位都是一个凹槽,在酶表面开口,活性部位对磷酸

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中国畜牧兽医 2011年第38卷第1期遗传繁育

基、反应产物和竞争性抑制剂有很强的亲和性,但没有磷酸单酯R 基团的明显结合位点,符合AP 是非特异性磷酸单酯酶这一特点(Kim 等,1991)。活性部位由Asp101 Ser102 A la103、3个在空间上相靠近的金属离子及配体、Arg 166及其它一些相邻氨基酸残基组成。3个金属离子Zn1、Zn2和M g 2+的大肠杆菌AP 的活性最强,如果被其它离子代替,活性将会降低约5000倍,但枯草芽孢杆菌等的AP 在Co 离子存在下才表现出最大活性(W ang 等,2005)。大肠杆菌AP 中金属离子排列成一个三角,创造了一个正电性环境,为吸引和稳定底物创造了条件,其中Zn1位点的Zn

2+

在催化反应中激活一个

水分子作为亲核物质进攻磷酸丝氨酸共价中间物,并有助于RO -基团的解离;Zn2位点的Zn 2+靠近Ser102,在反应中激活Ser102作为亲核物质进攻底物;M g 2+

对于Ser102亲核物质的形成,稳定酶分子在它的最大活性构型上发挥了重要作用(Stec 等,2000)。

1.3 大肠杆菌碱性磷酸酶的催化作用机制 AP 催化磷酸单酯水解或磷酸基转移的反应如图1。首先形成共价中间体(E P),这一共价中间体随后水解为非共价复合物(E Pi)。如果有磷酸受体存在(如T ris 或乙醇胺),该酶就会表现出催化磷酸基转移的活性,将磷酸基转移给醇生成新的磷酸单酯。反应的限速步骤受pH 的影响,酸性条件下,E P 水解是限速步骤,而碱性条件下的限速步骤是E Pi 中磷酸基的解离(H o ltz 等,1999)

。

图1 碱性磷酸酶催化磷酸单酯水解或

磷酸基转移的反应示意图

单纯酶的活性部位是被3个水分子占据,和镁配位的氢氧根离子与Ser102的羟基O

形成氢键,酶与底物(ROP)结合成复合物(E ROP),Ser102位于解离基团的对面,为了亲核进攻O 需要脱质子化,为此它将质子转移给与镁配位的羟基,形成镁与水分子的配位,同时,Zn2也与Ser102的O 配位,使之稳定在亲核状态。AP 的催化机制包括两

次置换反应: 被激活的Ser102羟基进攻E ROP 复合物的磷中心,形成共价酶磷中间体(E Pi),E Pi 的形成引起磷中心构象的改变,RO -基团解离,Zn1通过底物的桥接氧原子参与此步置换促使RO -基团离开; 与Zn1配位的亲核氢氧根进攻E Pi,水解磷酸丝氨酸中间物,生成非共价酶磷复合物E Pi,同时亲核的Ser102再生,并导致第二次磷中心构象的变化。

1.4 大肠杆菌碱性磷酸酶的功能 AP 确切的生理功能还不十分清楚,但认为它对有机体内磷代谢的调节有重要作用。大肠杆菌AP 的结构基因是pho A,它是pho 调节子的一部分,pho 调节子主要调节磷的转运和代谢。Pho bo x 是pho 调节子所有基因启动子区域的共有序列,受PhoB 蛋白的调控。p hoB 基因产物直接激活pho 调节子的转录,而PhoB 蛋白又被PhoR 蛋白磷酸化激活。细胞外磷的水平是调控PhoR 的信号,信号传递通过大肠杆菌Pst 系统实现。当接收到环境信号后,PhoR 再去调节PhoB,而PhoB 就是大肠杆菌AP 结构基因p hoA 的直接转录调节者。当处于低磷状态时,PhoR 使PhoB 磷酸化,激活大肠杆菌AP 结构基因p hoA 的转录;当处于高磷状态时,PhoR 会使PhoB 去磷酸化以阻止p hoA 大肠杆菌AP 结构基因的转录。

2 哺乳动物碱性磷酸酶特点

哺乳类AP 和大肠杆菌A P 基本三维结构框架非常相似,与催化活性相关的部位高度保守,2001年获得PLAP 的X-射线晶体结构也证实了这一点(Le Du 等,2001),所以哺乳类AP 与大肠杆菌AP 应具有相似的催化机制。但哺乳类A P 也有其特点,如哺乳类AP 主要为膜结合蛋白,它们通过磷脂酰肌醇葡聚糖锚定在细胞膜外侧;另外,细菌AP 是由单基因编码,而哺乳类AP 则是多基因编码的,细菌的AP 分子两个亚基完全相同,而哺乳类A P 分子两个亚基可能不同;哺乳类AP 还是糖基化的分子;大肠杆菌A P 每个亚基只有4个Cys 残基,形成两个链内二硫键,而哺乳类AP 有5个Cy s 残基,表明至少有一个是自由的Cy s;H o ylaw ets 等(2006)的研究结果还表明,哺乳类AP N 末端的正确折叠及其微环境对于整个分子结构的完整性和催化过程中分子内转变是极其重要的;与大肠杆菌AP 结构相比,在人类AP 的活性部位,细菌AP 的Asp153和Lys328被H is 替代,T hr155被Ser 替代。

目前已知人类A P 同工酶包括: 组织非特异

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性AP(T NAP),来源于肝脏、肾脏、骨及其它脏器和组织,即肝/骨/肾型A P,其中骨型AP是成骨细胞的一种细胞外酶,能被释放到血液循环中,在机体的生理功能主要是在成骨过程中水解磷酸酯,为羟磷灰石的沉积提供必需的磷酸,同时水解焦磷酸盐,解除其对骨盐形成的抑制作用,有利于成骨过程。骨型AP在体内的其它生化功能有待进一步的阐明(Orimo,2010); 肠型AP(IA P)又分胎儿IAP和成人IAP,由肠黏膜上皮微绒毛、肾近曲小管远侧端和子宫分泌,胎儿IAP又称笠原同工酶,它作为肿瘤标志物,出现于肝癌及其它器官发生肿瘤的病人血清中; 胎盘型AP(PLAP)又分早期PLAP和末期PLAP两种形式,主要由孕8周后的胎盘合胞体滋养层细胞微绒毛分泌,肺脏、卵巢、子官、胃肠道及其它脏器也分泌少量的PLAP,PLAP在人体的生理功能主要是参与细胞膜对物质的主动运输及钙、磷代谢,提供胎儿生长发育所需营养,对胎儿的生长发育起着重要作用,动态观察胎盘型碱性磷酸酶活性可作为妊娠的一项指标; 类PLAP又称Nagao 同工酶,本质是精原细胞AP(GCAP),是一种肿瘤标记物,出现于多种癌症中,如精原细胞瘤、卵巢癌等。现在认为,人类AP的同工酶至少来源于4种不同的基因:PL A P基因、类PL A P基因、I A P基因和T N A P基因,其中TN A P基因表达后经过不同的修饰形成肝脏、肾脏、骨等次级同工酶,P L A P 基因也被认为是类P L AP基因复制与突变的产物。前3种基因位于染色体2q34 37,T N A P基因位于染色体的1q34 36。其它哺乳动物AP研究的报道多集中在鼠、猪、兔、猫、牛和犬等,主要研究和应用的是血清AP,动物血清AP和人体一样是一组同工酶,主要来源于骨骼、肝脏、胎盘和小肠等。

哺乳类AP确切的生物学功能和作用机制还不十分清楚。目前认为骨骼的矿化依赖于正常的AP 的活动,对此观点最直接的证据可能是低磷酸酯酶症。低磷酸酯酶症是一种先天性代谢紊乱的骨疾病,为T NAP编码的结构基因发生突变,使血液中AP活力低于正常水平,表现为骨化及骨发育不全,至今已有200多种T NAP突变基因型被报道,虽然还无法治愈,但最近间叶干细胞移植的成功为该病的治疗提供了新的途径(Orimo,2010)。另外,在运输营养物质的组织中如小肠上皮刷状缘表面、胎盘合胞体滋养层表面、胆小管表面细胞膜上AP的含量很高,提示AP与磷酸的转移和代谢有关。总之,不同组织和器官的AP有不同的生理功能,但有一些仍然是未知的。

3 碱性磷酸酶的应用

AP在医学和分子生物学等领域有广泛的用途。在临床医学上,测定血清中AP的活力已成为诊断和监测多种疾病重要手段。AP主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查,患这些疾病时,肝细胞过度制造AP,经淋巴道和肝窦进入血液,同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍,反流入血而引起血清AP明显升高(Fer nandez等,2007)。而血中肠型AP明显升高可见于各种肠道疾病,也有文献报道某些消化系统疾病、自身免疫性疾病及恶性肿瘤患者血中还可以出现免疫球蛋白复合物型AP,此种A P同工酶出现的机理尚未清楚。AP同工酶作为肿瘤组织的一个标志也逐渐为人们所认识,如肺脏、睾丸、卵巢、胰腺、结肠和淋巴组织等恶性肿瘤病人血清中含有PLA P。骨型AP作为骨代谢异常的标志物越来越受到临床重视;血清骨型A P活力的定量测定可作为监测骨形成变化的有效参数,在其他的骨代谢异常疾病(如骨软化症、佝偻病等)及早期甲状腺机能亢进的病人、慢性肾衰病人、接受肾脏移植的病人血清中的骨型AP活性均有不同程度的改变,对骨型AP活性的检测及动态观察将为疾病的早期诊断、治疗效果的监测、病情预后等提供有效的依据(周新等,2006)。

在动物饲养和疾病诊断方面,AP是反映成骨细胞活性、骨生成状况和钙、磷代谢的重要生化指标。钙、磷供应不足对动物的影响主要表现为骨结构异常、软骨病、食欲降低、生长迟缓、生产性能下降等。年幼动物血液AP主要来自骨骼,随着动物长大成熟和骨骼成年化,来自骨骼的AP逐渐减少。在动物营养研究中,血清AP活性常作为重要的生化检测指标协助评定日粮钙、磷水平的适宜程度。在动物疾病诊断上,依据骨质疏松等骨骼疾病发生时AP活性的变化规律,可应用血清AP活性来诊断因钙、磷及VD失调所引起的骨质疾病。临床骨型AP的检测比血钙测定体内钙营养水平更具敏感性,因此,国内外研究一致认为骨型AP是反映骨改变全过程最正确的指标,其特异性、灵敏度及准确性优于其它物质的检测(王石莹,2009)。另外,在动物患肝疾患、胃肠疾患、肾脏疾病和缺锌时,血清AP均会有改变,如果继续对脏器特异性、A P变化机制、AP在不同动物体内生理功能深入研究,会使AP在兽医临床上意义更大。

在免疫学研究方面,已广泛应用AP标记抗体

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进行酶联免疫荧光反应(ELISA)和W estern印迹分析,即将A P与显色剂或去磷酸化后能发光的底物相互作用来揭示靶与检测酶复合物的存在,与辣根过氧化物酶相比,AP用作标记酶的优点是稳定性高、灵敏度高,缺点是成本高、标记困难。

在生物化学和分子生物学方面,用AP催化除去DNA分子的5 末端磷酸基团以防止载体自连是基因克隆中的常规手段之一。用AP脱去5 末端磷酸基团,再用( 32P)AT P标记5 末端,可用于化学测序,RNA测序和特异性DNA或RN A片段的图谱构建。应用AP代替同位素标记核苷酸探针用于分子杂交。研究中最常用的AP有: 细菌碱性磷酸酶(BAP); SAP(来源于一种北极虾); 小牛肠碱性磷酸酶(CIAP); 胎盘碱性磷酸酶(PLAP)和分泌性碱性磷酸酶(SEAP),后者是前者的C末端短缺版,与PLAP相比,SEAP没有PLAP的C 末端最后24个氨基酸(这24个氨基酸构成了与糖基化磷脂酰肌醇靶向锚定的区域)。另外,将p hoA 基因与其它基因融合表达杂合蛋白可用于基因表达的研究。在1995年还报道了以AP作为识别元件的生物传感器。目前工业上一个普遍的应用是基于巴氏杀菌可破坏AP,因此将AP作为检验牛奶的巴氏灭菌的标志。

4 展望

AP的研究已经有近百年的历史,对于AP的结构、功能、性质、作用机理、活性调控等方面的研究均已取得了不小的成就。近年来,科研工作者将研究目光聚焦在AP的生理功能及应用上,取得了许多新成果,如Gom ez等(1995)应用对骨型AP特异很强的单克隆抗体建立的免疫分析法具有高度的敏感性和特异性,而且操作简便重复性好,被认为是目前鉴别和定量骨型AP的最佳方法;Lor enz等(2001)研究结果证实,小牛肠AP具有较强的外切多聚磷酸酶活性;Lall s(2010)研究结果认为,肠型AP在保持肠道平衡中发挥重要作用,膳食可以影响它的活性,肠型A P具有参与调节碳酸氢盐分泌和十二指肠pH、通过脱磷酸作用控制细菌内毒素诱发的肠道炎症等功能。但对该酶在生物体内确切的生物学功能、工作机理,以及哺乳类A P的晶体结构分析等方面还有待进一步研究,相信随着科学的发展、科研手段的进步、对AP认识的不断深入,将使AP在科研和临床诊断中发挥更大的作用。

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遗传繁育中国畜牧兽医 2011年第38卷第1期

奶牛乳质性状相关基因及其单核苷酸

多态性的研究进展

张磊1,2

,宋雪梅1

,石放雄2

,蒋永清

1

(1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江杭州 310021; 2.南京农业大学动物科技学院,江苏南京 210095)摘要:乳质性状为奶牛重要的经济性状,主要包括乳蛋白量、乳蛋白率、乳脂量和乳脂率等。乳质性状改良是当今遗传育种界的研究热点之一,利用候选基因策略寻找影响乳质性状的功能基因或功能性单核苷酸多态,并将其应用于奶牛乳质性状的分子育种实践已经成为后基因组时代的发展趋势。目前针对乳质性状的功能基因或功能性单核苷酸多态已经开展了大量的研究工作,作者就参与泌乳调控的乳质相关基因、脂肪合成与次生物质代谢通路,以及其他一些与乳质性状相关基因及功能性单核苷酸的研究现状进行简要综述。

关键词:奶牛;乳质相关基因;乳质性状

中图分类号:Q 78 文献标识码:A 文章编号:1671 7236(2011)01 0161 04

作为奶牛生产重要的经济性状,乳质性状主要包括乳蛋白量、乳蛋白率、乳脂量和乳脂率等,这些性状属典型的微效多基因控制的数量性状,可直接影响牛奶的营养、风味和牛奶产业的经济效益。虽然正常情况下乳成分基本保持稳定,但乳脂和乳蛋白等成分会因生理和遗传因素在一定范围内产生波动并影响乳品质。因此,亟需依据市场和人类营养学的需求,利用功能基因和功能性单核苷酸多态性分子标记改善牛奶品质。功能性分子标记是建立在

收稿日期:2010 07 09

作者简介:张磊(1986-),男,陕西人,硕士生,研究方向:动物遗

传育种。

通信作者:蒋永清(1961-),男,浙江人,硕士生导师,研究员,从

事反刍动物的营养与繁育技术研究和推广。E mail:jyq61@s oh 2020368c84868762caaed558;T el:0571 ********

基金项目:奶牛种质资源创新及选育技术研究(2008C 02002

(1));奶牛耐热性改良与营养调控关键技术研究(2006C12058)。

关联分析或基因系中等位基因的功能性基序中单核

苷酸多态性位点基础上的一类新型显性分子标记,这类分子标记不依赖于分子遗传作图,利用这种分子标记能够大大提高分子标记辅助选择的效率,为奶牛的分子标记育种奠定技术基础。作者综合近年乳质性状的相关功能基因及其功能性单核苷酸多态性分子标记研究进展,这些研究结果可为奶牛乳品质性状的高效选育、遗传资源的改良、开发和标记辅助选择的利用提供理论依据。1 参与泌乳调控的乳质相关基因

泌乳是由多种因素调控的复杂生理过程,其中催乳素(prolactin,PRL )是奶牛泌乳过程中最主要的调控因素。催乳素通过与靶细胞膜表面受体相结合,启动非受体型酪氨酸激酶2/信号转导与转录激活因子5(janus kinase 2/sig nal transducers and ac tivato rs of transcription 5,JA K2/STAT 5)信号传导途径,最终激活反式作用因子STAT 5A,使其作用于乳蛋白基因启动子区的靶序列,启动或增强以

Advances on C haracteristic and Application of Alkaline Phosphatase

WAN G Qiu ying

(Hebei T o urism V ocatio nal Colleg e,Chengde 067000,China)

Abstract:A lkaline phosphatase(AP )is a kind of hydro lase,w hich catalyzes the no nspecific hy dr olysis of pho sphate mo noester to produce pho sphate or transfer pho sphate.AP ex ists w idely in micr obial and animal kingdom.A P plays a vital impo r tant r ole in pho sphate cy cle of wo rld creatures,and has been used w idely in the fields of diag no st ics,biochemistry and mo lecular biolo gy.In this paper ,the histor y,the reaction mechanism and a pplicat ion of alka line pho sphatase was rev iewed.

Key words:alkaline phosphatase;nonspecif ic phosphomonoesterase;reaction mechanism

161 中国畜牧兽医 2011年第38卷第1期遗传繁育

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/7aal.html