激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解

激光共聚焦显微镜的原理与应用范围

激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和 装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。

1 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM ）的原理

从基本原理上讲, 共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜, 它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:

1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好, 光源波束的波长相同, 从根本上消除了色差。

1． 2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板, 将焦平面以外的杂散光挡住, 消除了球差; 并进一步消除了色差

1． 3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点, 用十分细小的激光束(点光源 逐点逐行扫描成像, 再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的, 标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。

1．4用计算机采集和处理光信号, 并利用光电倍增管放大信号图

在共聚焦显微镜中, 计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像, 得到的图像是数字化的, 可以在电脑中进行处理, 再一次提高图像的清晰度。而且利用了光电倍增管, 可以将很微弱的信号放大, 灵敏度大大提高。由于综合利用了以上技术。可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合, 是现代技术发展的必然产物。

2 ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用

目前, 一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜, 它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合, 如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ 、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ 等, 因此被称为万能显微镜, 通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。

2．1观察活细胞、活组织ＬＳＣＭ在不损伤细胞的前提下, 对活组织、活细胞进行观察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期处理过程(如脱水、脱蜡、染色等; 而且观察过的样品还可以继续用于其他的研究。这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为重要。这可以说是ＬＳＣＭ最大的优势。

2．2 生化成分精确定位观察配合专用的分子探针, 对于要检测的成分不仅可以定位到细胞水平, 还可以定位到亚细胞水平和分子水平

2．3 动态观察在同一样品平面上随时间进行连续扫描, 就可分析细胞结构、内含、和标记等动力学变化。目前在这方面做得最多的是使用ＬＳＣＭ观察心肌或平滑肌细胞内游离钙、钠、钾离子浓度或ｐＨ的动态变化。

2．4 数据、图像的数字化用计算机代替了普通的照相机, 得到的图像是数字化的, 可及时输出或长期储存, 而且还可进一步加工处理。

2．5 定量测量首先应用专一的荧光探针对样品进行染色, 样品的荧光强度和所测成分的含量呈正比, 如果其余条件固定, 通过对比各组样品之间的荧光强度值, 可得出特定成分的含量比。

3 华中地区有激光共聚焦显微镜机构的品牌和技术参数 3．1中国科学院武汉病毒研究所，

3．2湖南中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所

LSCM(BIO-ROD1024,HOMEL HEMPSTEAD,UK

发表过应用激光扫描共聚焦显微镜观察骨组织为损伤的实验研究 3．3华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科

激光扫描共聚焦显微镜(ＭＲＣ 1024型, 美国ＢｉｏＲａｄ公司生产 发表过激光扫描共聚焦显微镜检测核因子κＢ

4 激光扫描共聚焦显微镜的使用（cAMP 在体测量为例） 4．1样品制备

4．1．1切片 实验标本要求单层，并能很好地贴附在样品池中。所以，组织标本无论

是石蜡切片还是冰冻切片，均为越薄越好。常用的贴附剂有：多聚赖氨 酸，伴刀豆球蛋白，蛋清，琼脂明胶cell-Tak, vectabond等。

4．1．2培养细胞 培养细胞可以满足要求，如果用购置仪器时所带的薄底培养瓶进行培养

则更佳

4．1．3激光共聚焦观察样品处理注意事项

首先要尽量保持生物材料的天然状态，避免赝像、变形和失真，因此须将生物材料做固定处理；制片必须薄而透明，才能在显微镜下成像，除将材料切成薄片或通过轻压或其他手段使之分散外，还需采用其他方法使它透明和染色，以便更好地观察到结构的细节。需长期

保存的制片，还应进行脱水和封固。

显微制片法一般包括切片法、整体封片法、涂片法和压片法4类。 4．2荧光探针的选择

荧光探针的发展非常迅速，目前仅美国Molecular Probes公司就可提供1800多种荧光探针[3，每年该公司还不断推出新的荧光探针。通常每项检测内容或被测物质都有几种或几十种有关的或特异的荧光探针。选择合适的荧光探针是有效地进行实验并获取理想实验结果的保障。荧光探针的选择主要从以下几个方面考虑：(1现有仪器所采用的激光器。如我校购进的激光扫描共聚焦显微镜(ACAS ULTMA312，美国Meridian 公司产品 采用氩离子激光器，激发波长为351～364nm ，488nm ，514nm ，可激发多种荧光探针；(2荧光探针的光稳定性和光漂白性。在进行荧光定量和动态荧光监测时，要求荧光探针有较好的光稳定性越高越好，也可通过减少激光扫描次数或降低激光强度的方法，来减轻光漂白的程度。但在进行膜流动性或细胞间通讯检测时则需要荧光探针既有一定的光稳定性又要有一定的光漂白性；

(3荧光的定性或定量。仅做荧光定性或仅是观察荧光动态变化时，选择单波长激发探针，无需制作工作曲线。做定量测量时最好选用双波长激发比率探针，利于制定工作曲线；(4荧光探针的特异性和毒性。尽量选用毒性小、特异性高的探针；(5荧光探针适用的pH 。大多数情况下细胞的pH 在生理条件下，但当pH 不在此范围时，考虑适用该环境pH 的荧光探针是有必要的。同时应注意染液自身的pH 值会影响带电荷的荧光探针与胞内组份之间的结合，因此在染液的配备时需加以考虑。

不同的荧光探针在不同标本的效果常有差异，除综合考虑以上因素以外，有条件者应进行染料的筛选，以找出最适的荧光探针。此外，许多荧光探针是疏水性的，很难或不能进入细胞，需使用其乙酰羟甲基酯(acetoxymethyl,AM形式，也就是荧光探针与AM 结合后变成不带电荷的亲脂性化合物方易于通过质膜进入细胞，在细胞内荧光探针上的AM 被非特异性酯酶水解，去掉AM 后的荧光探针不仅可与细胞内的靶结构或靶分子结合且不易透出质膜，从而能有效的发挥作用。

4．2．1细胞内游离钙

美国分子公司提供的钙荧光探针有20多种，激光扫描共聚焦显微镜常用的有Fluo-3、Rhod-1、Indo-1、Fura-2等，前两者为单波长激光探针，利用其单波长激发特点可直接测量细胞内Ca2+动态变化，为钙定性探针；后两者为双波长激发探针，利用其双波长激发特点和比率技术，能定量细胞内［Ca2+］i ，为钙定量探针

4．2．2 DNA和RNA

核酸的荧光探针有50多种［2］，用于激光扫描共聚焦显微镜的主要有Acridine Orange(吖啶橙，AO 、Propidium Iodide(碘化丙啶，PI 。

4．2．3 膜电位

DiBAC4(3为最常用的膜电位荧光探针［5］，DiBAC4(3为带负电荷的阴离子慢反应染料。该探针本身无荧光，当进入细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光，测量时要求细胞浸在荧光染料中。当细胞内荧光强度增加即膜电位增加示细胞去极化；反之，细胞内荧光强度降低即膜电位降低示细胞超极化。Rhodamine 123主要用于线粒体膜电位测量［6］。Rhodamine123是一种亲脂性阳离子荧光探针，当线粒体膜内侧负电荷增多时，荧光强度增加，与DiBAC4(3的表示形式相反。

4．2．4 pH值

常用于偏中性pH 即细胞胞浆pH 检测的荧光探针有SNARF 类(SNARF-1SNARF-calcein、SNAFL 类(SNAFL-1、SNAFL-calcein 、BCECF 等，这些探针均为疏水性探针，需使用其AM 形式。FITC-dextran 则适用于pH 范围4～6之间［7］，如溶酶体pH 的检测，该探针也不能透过质膜，但可通过细胞胞饮作用进入溶酶体，因此应选择分子量稍小的Dextran(葡聚糖 。

4．2．5 细胞内活性氧基

活性氧(active oxygen species可影响细胞代谢，与蛋白质、核酸、脂类等发生反应，有些反应是有害的，因此测量活性氧在毒理学研究中有一定的意义。根据检

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