PCR-DGGE实验过程中常见问题的分析与改进

ＰＣＲ－ＤＧＧＥ实验过程中

常见问题的分析与改进

刘丹，凌云

（上海海洋大学水产与生命学院，上海２０１３０６）

■■：对ｐｃＲ．ＤＩＧＧＥ实验过程中常见问题，如条带的有无、多少、拖尾、重影、扭曲、集中等问题进行了归纳总结，并提供了详细的解

决方法，如加强实验前仪器的检查；进行时间进程实验；选择适当的扩增引物、电泳温度和电流等。

关ｔ词：ＰＣＲ－ＤＧＧＥ；实验过程常见问题；分析；改进中圈分类号：Ｑ７８

文献标识码：Ａ

１陀Ｒ—ＤＧＧＥ技术概述

变性梯度凝胶电泳（Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ

ＧｒａｄｉｅｎｔＧｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）技术是

由Ｆｉｓｃｈｅｒ和Ｌｅｎｎａｎ于１９７９年最先提出的一种用于检测ＤＮＡ突变的电泳技术，该技术可分辨出长度相同但序列不同的ＤＮＡ片段。Ｍｕｙｚｅｒ等在１９９３年首次将ＤＧＧＥ技术应用于微生物群落结构的研究。现在，这项技术广泛应用于各个领域的微生物分子生态学研究中。特别是细菌和真菌序列多态性的ＤＧＧＥ技术，已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。

２

ＰＣＲ—ＤＧＧＥ技术在实验过程中常见问晨的分析与改进

ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术在运用过程中，常出现图谱分辨率和结果分析偏差等问题，其中无条带或条带过少、重影或拖尾、扭曲、集中于某一区域和杂质干扰等是最为常见的问题。

２．１没有条带或者条带过少

如图１所示，ＤＧＧＥ图谱中点样孔的亮度很高，但泳道上却没有条带，很明显ＤＮＡ没有产生迁移效应。发生这种情况的原因有２种：①引物选择不正确导致扩增的片段

过长，无法在凝胶中迁移。因此。

ＤＧＧＥ选择的片段不宜太长，目前被广泛使用的细菌１６ＳｒＤＮＡ通用引物３４１ｆ／５３４ｒ（Ｖ３区）、３４１ｆ／９２６ｒ（Ｖ３～Ｖ５区）和９６８ｆｆｌ４０１ｒ（Ｖ６～Ｖ８区）一般都只有３００～５００ｂｐ左右。②点样孔变性

收稿日期：２０１０－１０－０４

基金项目：上海市教育委员会重点学科建设项

目资助（Ｊ５０７０１）

作者简介：刘丹（１９８９一），女，安徽马鞍山

市人，主要从事环境微生物领域的研究．

通讯作者：凌云

万方数据

剂浓度太高，导致ＤＮＡ直接变性后无了非常严重的重影和拖尾问题。一般

法向下迁移。因此，灌胶时一定要保，是由以下几个原因导致：①电泳的证高低胶的针筒不能装反，选用浓缩电压不稳或者在时间上未能连续：②

胶则可以采用Ｏ％交性剂梯度的胶进胶的浓度出现问题或分布不均匀。因行制备。如果在环境样品的检测中，此，实验人员在电泳之前应检查电泳只有少数几条条带（图２），则表明仪和导线是否正常，垂直电泳槽的两ＤＮＡ分离效果很差。这主要由以下玻璃极板间是否有电泳液渗漏等，如原因导致：①ＤＮＡ扩增环节出现问有渗漏可以通过更换橡胶条或者用丙题。解决方案是先对ＰＣＲ产物进行琼烯酰胺封口来避免。另外，灌胶时应脂糖电泳检测，出现明显条带后再做注意灌胶的连续性，以避免胶浓度不ＤＧＧＥ；②电泳过程中电流不稳定或均。

者温度未达到要求，导致ＤＮＡ分离不２．３条带扭曲

完全。因此，需要在ＤＧＧＥ电泳前将右侧泳道常出现条带扭曲（图缓冲液预热到６０℃，实验人员在电泳４）的问题，因此一般应避免在靠近开始后应该等ＤＮＡ跑出点样孔后再离

玻璃边缘的泳道点样。如图５所示，开。

谱图中的条带发生了倾斜扭曲。这主２．２条带重影或拖尾

要是因为一般灌胶都是高浓度的在下如图３（ａ）、３（ｂ）所示，图谱中出现

面，低浓度的在上面，如果胶体凝固

田１无惫带的ＤＧＧＥ田膏瞳２含有少ｌｌｍＡＤＧＧＥｍｍ

■４囊带扭●的ＤＧＧＥ嗣膏

■６囊帚集中在下方帕ＤＧＧＥ圈■

万方数据

圈５鲁带馈斜的ＤＧＧＥ圈鼍

圈７景带集中在中目的ＤＧＧＥ田■

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■南袁量并学 下串月簟广埘 ２７

PCR-DGGE实验过程中常见问题的分析与改进

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：

刘丹， 凌云

上海海洋大学水产与生命学院,上海,201306湖南农业科学

HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES2010(24)

参考文献(4条)

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