新型鸭呼肠孤病毒 - C蛋白间接ELISA检测方法的建立 - 王锦祥

第37卷第9期2015年9月

中国预防兽医学报

ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine

Vol.37，No.9Sep.2015

doi:10.3969/j.issn.1008-0589.2015.09.09

新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白间接ELISA检测方法的建立

王锦祥1,2，程晓霞1,2，陈少莺1,2*，陈仕龙1,2，林锋强1,2，王

劭1,2

(1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建福州350013)

摘要：为建立快速检测新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)抗体的方法，本研究以纯化的重组σC蛋白作为包被抗

原，并对该方法的反应条件进行优化，建立了NDRV间接ELISA抗体检测方法。该方法仅对NDRV血清检测为阳性，与番鸭呼肠孤病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、番鸭源鹅细小病毒阳性血清均无交叉反应，具有良好的特异性。其批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%，具有良好的重复性。利用建立的σC蛋白间接ELISA方法对80份疑似鸭血清样品进行检测，结果显示与NDRV全病毒间接ELISA的符合率为88.75%。本研究建立的ELISA方法为NDRV的流行病学调查提供了快速、特异的血清学检测方法。

关键词：新型鸭呼肠孤病毒；原核表达；重组σC蛋白；间接ELISA中图分类号：S852.65

文献标识码：A

文章编号：1008-0589(2015)09-0687-04

ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｎｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙ

ｔｏσＣｐｒｏｔｅｉｎｏｆＮｏｖｅｌｄｕｃｋｒｅｏｖｉｒｕｓ

WANGJin-xiang1,2,CHENXiao-xia1,2,CHENShao-ying1,2*,CHENShi-long1,2,

LINFeng-qiang1,2,WANGShao1,2

(1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,FujianAcademyofAgricultureSciences,Fuzhou350013,China;

2.FujianAnimalDiseasesControlTechnologyDevelopmentCenter,Fuzhou350013,China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ:ToestablishanassayfordetectionoftheantibodyagainstNovelduckreovirus(NDRV),anindirectELISAwasdevelopedwiththepurifiedrecombinantσCproteinascoatingantigenexpressedinE.coli.Theoptimalreactionconditionsweredeterminedasfollow:coatingwith625ngoftheσCproteinperwellforthemicroplate,blockingwith12?Sbuffer,dilutingtheserumsampleat1:80anddetectingwithgoatanti-duckHRP-IgGat1∶400.ThismethodwasspecificforNDRVdetection,andhadnocross-reactionswithseraagainstotherduckviruses.Thecoefficientofintra-andinter-assayvariationswasbothlessthan5%.Moreover,thecoincidenceoftheindirectELISAcoatedwithrecombinantσCproteinwas88.75%withtheELISAcoatedwiththeNDRV.TheresultsindicatedthattheindirectσC-ELISAwithsensitivity,specificityandrepeatabilitywouldprovidearapidassayfordetectionofNDRVinfectionandserosurveyofthedisease.

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Novelduckreovirus;prokaryoticexpression;recombinantσCprotein;indirectELISA

*Correspondingauthor

收稿日期：2014-12-29

基金项目：国家863项目(2011AA10A209)；福建省自然科学基金项目(2014J05036)

作者简介：王锦祥(1983-)，男，福建龙岩人，助理研究员，博士，主要从事分子病毒学研究.*通信作者：E-mail：chensy58@163.com

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鸭出血性坏死性肝炎是由新型鸭呼肠孤病毒(Novelduckreovirus，NDRV)引起鸭的一种新发传染病，其特征是肝脏不规则坏死和出血、心肌出血、脾脏肿大斑块状坏死、肾脏和法氏囊出血。NDRV主要感染雏鸭，感染鸭死亡率高，日龄愈小并发感染时其发病率、死亡率愈高，给养鸭业造成较大的经济损失。自陈少莺等首次将鸭出血性坏死性肝炎的病原鉴定为NDRV后[1]，在我国福建[2]、广东[3]和浙江[4]等地的鸭群中相继有该病发生的报道，疫区有逐年扩大的趋势。

目前，已报道的NDRV实验室检测方法尚未见ELISA方法报道。ELISA是一种简便、快速、敏感且适用于大批量样品检测的血清学方法[5]。本研究以原核表达的NDRV外衣壳蛋白σC为检测抗原，建立了检测NDRV抗体的间接ELISA方法，为NDRV抗体检测试剂盒的研制奠定基础。

底物，37℃作用3min～15min，2mol/LH2SO4终止反应，测定样品的OD490nm值。上述操作重复3次。以阳性血清OD490nm值大于1.0，P/N值(阳性血清OD490nm/阴性血清OD490nm)最大时的反应条件为最佳工作条件。1.5

间接ELISA判断标准的确定

参照文献[6]的

方法，将164份NDRV阴性血清在最佳工作条件下进行间接ELISA测定。计算每份血清的S/P值及平均值(X)和标准方差(SD)确定阴阳性临界值(X+3SD)。

S/P=(样品OD490nm值-阴性对照OD490nm值)/(阳性对照OD490nm值-阴性对照OD490nm值)1.6

阻断试验

将阳性血清按最佳稀释度进行稀

释，加入等体积最适稀释度的重组抗原，于37℃作用1h，将上述混合液加入已包被抗原的酶标板，同时设阳、阴性血清对照组，进行ELISA反应，测定其OD490nm。按(N-P)/N=(未阻断孔OD490nm值-阻断孔OD490nm值)/(未阻断孔OD490nm值)的公式计算，若结果大于0.5，则判断为阻断阳性。1.7

特异性试验

按照建立的ELISA方法，对本

1

1.1

材料和方法

菌株、血清和临床样品

重组菌pET-NDRV-

实验室保存的MDRV、DHV、MPV和MD-GPV的阳性血清进行检测，每份血清设3个重复，同时设置NDRV阳性和阴性血清对照，验证建立的ELISA方法的特异性。1.8

重复性试验

采用同一时间和不同时间包被

的ELISA反应板，选取NDRV抗体效价不同的8份血清，按建立的间接ELISA方法进行批内和批间重复性试验。每份血清重复检测3次，评价该方法的重复性。1.9

符合性试验

应用NDRV全病毒间接ELISA

σC/BL21由本实验室构建并保存；NDRV阳性和阴性血清、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、鸭肝炎病毒(DHV)、番鸭细小病毒(MPV)和番鸭源鹅细小病毒(MD-GPV)阳性血清均由本实验室保存；NDRV阴性血清为采自浙江、福建和广东等地区经NDRV全病毒间接ELISA检测为阴性的鸭血清；待检血清样品采自浙江、福建、广东等不同地区的212份疑似NDRV感染鸭。1.2

主要试剂

辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭IgG

(IgG-HRP)购自美国KPL公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；镍离子亲和纯化柱购自GE公司。1.3

重组蛋白的表达及纯化

将重组菌pET-NDRV-σC/BL21进行诱导表达，按照HisTrapFF蛋白纯化步骤纯化σC重组蛋白，通过SDS-PAGE及westernblot对重组蛋白进行鉴定。1.4

间接ELISA方法的建立

将重组蛋白经pH9.6

和建立的σC蛋白间接ELISA方法对80份疑似鸭血清样品进行检测，统计两者的符合率。1.10

临床血清样品的检测

应用建立的σC蛋白

间接ELISA方法，检测来自浙江、福建和广东等不同地区共132份疑似NDRV感染的血清样品，计算样品的阳性率。

2

2.1

结果

重组菌pET-NDRV-

的碳酸盐缓冲液倍比稀释(50μg/mL～3.12μg/mL)后包被96孔ELISA板，每孔100μL，4℃过夜。以NDRV阳性血清和阴性血清(1∶20～1∶320)倍比稀释后为一抗，每孔100μL，37℃作用90min。以羊抗鸭IgG-HRP(1∶400)为二抗，37℃作用60min。加入

重组蛋白的表达及鉴定

σC/BL21经IPTG诱导后对重组蛋白进行SDS-PAGE检测，结果显示重组蛋白获得表达，其分子量约为40ku，与预期结果相符，并且重组蛋白以包涵体形

第9期王锦祥，等.新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白间接ELISA检测方法的建立689

式存在。Westernblot结果表明，重组蛋白与NDRV阳性血清发生特异性反应，具有良好的反应原性(图1)。

M

175ku80ku58ku46ku30ku25ku

1

2

3

均为0.338，对照阳性血清的OD490nm值平均为1.560，计算阻断率为0.783，大于0.5，判定为阻断试验阳性，表明重组抗原可以阻断阳性血清与重组蛋白的反应。2.5

特异性试验

对MDRV、DHV、MPV和MD-GPV4份阳性血清进行检测，结果表明重组蛋白与这4种鸭病原的阳性血清均无交叉反应，表明该检测方法具有较好的特异性。2.6

重复性试验

采用同一时间和不同时间包被的

ELISA板，对NDRV抗体效价不同的8份血清进行

M:PrestainedproteinMarker;1-2:SDS-PAGEanalysisofthepurified

protein;3:Westernblotanalysisofthepurifiedprotein图1

NDRVσC纯化蛋白的SDS-PAGE和westernblot分析Fig.1SDS-PAGEandwesternblotanalysisofthepurifiedNDRVσCprotein检测，结果显示，批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%，表明该方法具有良好的重复性(表2)。

表2间接ELISA重复性试验

Table2RepeatabilityassayforindirectELISASerumsamples12345678

Intra-coefficientofvariation

X±SDCV(%)1.303±0.0073.870.583±0.0061.751.220±0.0072.170.714±0.0083.621.391±0.0084.33

3.280.986±0.007

2.921.324±0.024

3.170.367±0.010

Inter-coefficientofvariation

X±SDCV(%)1.322±0.0162.870.585±0.0082.801.263±0.0123.190.732±0.0194.081.387±0.0171.93

1.871.027±0.009

4.101.319±0.010

3.890.36±0.009

2.2间接ELISA反应条件的确定对间接ELISA

反应条件进行优化，结果见表1。

表1间接ELISA检测方法的反应条件优化结果

Table1TheoptimizedconditionsoftheindirectELISA羊抗鸭IgG-HRPNDRVσC蛋白为包被抗原封闭条件待检血清NDRVσCproteinasBlockingGoatanti-duckSamplecoatingantigenconditionIgG-HRP最佳浓度或稀释度6.25μg/mL12?S1:801:400Optimizeddilutions4℃/12h37℃/2h37℃/90min60min反应条件Reactionconditions2.7符合性试验应用NDRV全病毒间接ELISA

和建立的σC蛋白间接ELISA方法对80份疑似鸭血清样品进行检测。结果显示NDRV全病毒间接ELISA的阳性检出率为41.25%(33/80)，阴性检出率为58.75%(47/80)。本研究建立的σC蛋白间接ELISA方法阳性检出率为35%(28/80)，两者符合率为88.75%(表3)。

表3

σC蛋白间接ELISA和NDRV全病毒间接ELISA

方法的符合性试验

Table3ComparisonoftheagreementbetweenσC-ELISAandNDRV-ELISAPositive28/8033/80

Negative52/8047/80

Positiverates35.0A.25%

Coincidencerate

88.75%

2.3间接ELISA判定标准的确定应用优化的间

接ELISA方法，对164份NDRV阴性血清样品进行检测，经计算X为0.0564，SD为0.0381。确定临界值X+3SD为0.171，即OD490nm大于(等于)0.171判定为阳性，小于0.171则判定为阴性(图2)。

Numbersofnegativeserum60

40

σC-ELISANDRV-ELISA

20

2.8

<0

0-0.01

0.01-0.030.03-0.040.04-0.060.06-0.070.07-0.090.09-0.10

临床样品的检测应用建立的σC蛋白间接

0

ELISA方法对浙江、福建、广东等不同地区的132

S/Pvalue

份疑似感染鸭血清样品进行检测，结果显示检出阳性样品57份，阳性率为43.18%(57/132)。

Fig.2图2阴性血清S/P值分布图

FrequencydistributionofS/Pvalueofnegativeserum2.4阻断试验将阳性血清与重组抗原等体积混合

3讨论

后加入已包被抗原的ELISA板进行阻断试验，结果显示，经重组蛋白阻断的阳性血清OD490nm值比未被阻断的对照阳性血清明显降低，阻断后OD490nm值平

σC蛋白是禽源呼肠孤病毒(ARV)的重要结构蛋白。在病毒感染过程中，σC蛋白被活化，形成同源

690中国预防兽医学报2015年

三聚体，与易感细胞表面的受体结合，促使病毒侵入易感细胞，是病毒的重要致病因子。此外，σC蛋白还能诱导机体产生保护性中和抗体[7-9]。研究表明，杆状病毒表达的ARV[10]和MDRV[11]的σC蛋白能够有效地诱导实验动物产生保护性抗体，表明σC蛋白是一种保护性抗原。耿宏伟等利用E.coli系统表达出具有良好反应原性的MDRVσC蛋白，并基于该蛋白建立了间接ELISA方法[12]。本实验也选择E.coli系统表达NDRVσC蛋白。经westernblot鉴定表明，重组蛋白具有良好的反应原性。因此，选择E.coli表达的σC蛋白作为抗原能够满足建立检测NDRV抗体间接ELISA方法的要求。

目前，国内外尚未见利用NDRV重组σC蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法的报道。本实验利用原核表达系统表达了NDRVσC蛋白，并采用纯化的蛋白作为包被抗原，建立了检测NDRV抗体的间接ELISA方法，并对反应条件进行了优化。同时试验表明其具有良好的特异性和重复性。通过对浙江、福建和广东3省采集的132份疑似血清样品进行检测阳性率为43.18%。因此，采用该方法用于检测大批量血清样品具有较高的应用价值，可以广泛应用于σC蛋白抗体的流行病学调查，同时也为研制检测NDRV抗体的间接ELISA试剂盒奠定了基础。

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(本文编辑：彭永刚)

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/72kv.html