德泰生物：原核表达概述(一)

u表达载体

u表达菌株

u表达条件

原核表达原理概述目的基因

表达载体构建

重组载体

转化

表达菌株

培养，诱导“基因——载体——菌株——

培养”

?启动子

?融合标签

?常用表达载体系统

常见启动子

?λpL启动子：热诱导启动子

? trp启动子：化学诱导启动子

? trc启动子：trp+lac杂交启动子

? tac启动子：trp+lac UV5杂交启动子；

pGEX（Pharmacia）、pMal（NEB）

?T7/T7lac启动子：pET（Novagen）、pEASY-E1/E2（Transgen）

T7启动子

T7lac 启动子

?常用于蛋白检测与纯化。

?有时也可增加蛋白可溶性、将蛋白运转至特定位置。

表达量高

提前终止会干扰纯化

二级翻译起始不影响纯化

基因不能自带终止密码子

提前终止不影响纯化

二级翻译起始会干扰纯化

? MBP·Tag pMal系统

常用表达载体系统系统名称公司启动子抗性常用标签特点pGEX GE

(Pharmacia)

tac Amp GST·T ag

pMal NEB tac Amp MBP·Tag

pET Merck

(Novagen)T7

T7lac

Amp

Kan

His·Tag

pEASY Transgen T7lac Amp His·Tag同pET系统

考虑因素细胞特性

蛋白稳定性蛋白酶缺陷型——B型菌株，缺失lon、ompT蛋白酶

多种常用表达菌株均为此类，如BL21、Origami、Rosetta等启动子tac启动子需要大肠杆菌自身的RNA聚合酶即可：BL21

T7启动子需要能够提供T7 RNA聚合酶的细胞：DE3溶源菌

抗性细胞不能与载体带有相同的抗性：

pET-28a + OrigamiB(DE3)No！

pET-21b + OrigamiB(DE3)Yes！

严谨调控BL21(DE3)pLysS / BL21(DE3)pLysE

稀有密码子Rosetta系列

溶解性Origami系列

稀有密码子

不同生物使用密码子存在偏爱性。某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基因

的mRNA 无法正常在E. coli 里表达，是为“稀有”密码子。

?常用表达条件的优化

?1980年，Guarante L等构建了以乳糖操纵子为基础的大肠杆菌表达系统

Guarante L, Roberts TM, Ptashne M. A technique for expression eukaryotic genes in bacteria. Science, 1980, 209: 1428~1430

?启动子Plac + 操纵基因lacO + 结构基因

?lacI负调控：

阻遏物lacI与操纵基因lacO结合，抑制表达

IPTG：半乳糖苷类似物，结合阻遏物lacI使其失活，启动诱导表达

? cAMP-CAP正调控

cAMP结合并激活CAP，起始转录，实现正调控

葡萄糖抑制腺苷酸环化酶，ATP不能转化为cAMP，无cAMP-CAP，无转录

?温度

? IPTG浓度

? OD值

?培养体积与溶氧量

?根据实验目的选择表达策略

?载体选择

?感受态细胞选择

?表达条件

1.明确实验目的

2.选择表达载体

3.选择表达菌株

4.优化表达条件

…………

选择表达载体

系统名称公司启动子抗性常用标签特点pGEX GE

(Pharmacia)

tac Amp GST·Tag

pMal NEB tac Amp MBP·Tag

pET Merck

(Novagen)T7

T7lac

Amp

Kan

His ·Tag

pEASY Transgen T7lac Amp His·Tag同pET系统

选择表达菌株菌株

适合启动子特性BL21

tac 、trc……(pGEX 、pMal)适用于非T7启动子的表达系统BL21(DE3)

T7/T7lac (pET ，pEASY)适用于T7、T7lac 的表达系统，适用于非毒基因的表达BL21(DE3)pLysS T7/T7lac (pET ，pEASY)

质粒pLysS 含有表达T7溶菌酶的基因，可结合T7 RNA 聚合酶，降低本底表达水平。适用于严谨调控毒基因的表达Rosetta(DE3)Trans etta(DE3)

T7/T7lac (pET ，pEASY)

补充6种稀有密码子对应的tRNA ，提高外源基因，特别是真核基因在原核系统中的表达水平OrigamiB(DE3)Trans B(DE3)

T7/T7lac (pET ，pEASY)具有thioredoxin reductase/glutathione reductase 双

突变，有助于形成更多的二硫键，增加蛋白的可溶性。毒基因：基因表达产物——即目的蛋白，影响宿主生长（“毒性”）

BL21(DE3)pLysS 、BL21(DE3)pLysE 利用T7溶菌酶的严谨调控机制

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/723q.html