WB步骤

WB步骤

WB仪器和试剂：

ELX800uv酶标仪（Bio-TEK公司） 电泳槽（Amersham Biscience公司） 转移槽（Amersham Biscience公司）

ECL发光试剂盒（Thermo公司） SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）（Beyotime） 硝酸纤维化膜（Pall Corporation） 抗体（艾博抗（上海）贸易有限公司） SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（Beyotime） PBS（厂家：ORIGENE 批号：150309） 显影液(天津市汉中摄影材料厂) 定影液(天津市汉中摄影材料厂)

BCA蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime） Western 一抗二抗去除液（Beyotime） 低温高速离心机（Eppendorf）

小鼠抗β-Actin单抗（MouseAnti—beta ActinMonoclonal Antibody） 辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（Perxidase—Conjugated Affinipure Goat Anti—RabbitIgG(H+L)）

PageRulerTMPrestained Protein Ladder（Thermo公司）

Anti—P Glycoprotein抗体[EPR10364--57](abcam艾博抗（上海）贸易有限公司) GAPDH Monoclonal Antibody==鼠抗GADPH单克隆抗体(abcam艾博抗（上海）贸易有限公司）

Anti-beta Actin Mouse Monoclonal Antibody==鼠抗actin单克隆抗体

组织蛋白提取：

1. 2. 3. 4.

将组织（80mg-90mg）置于1-2ml匀浆器球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎 加1mLRIPA裂解液（含PMSF10uL）于匀浆器中进行匀浆然后置于冰上 几分钟后再碾一会再置于冰上，重复碾几次尽量碾碎 裂解30min后，即可用移液枪将裂解液移至1.5ml离心管中，4℃-12000rpm离心15min，取上清分装于0.5ml离心管中，-20℃保存

蛋白浓度的测定：BCA蛋白浓度测定试剂盒

1. 取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（20mgBSA）中，充分溶解后配制成

25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可长期保存

2. 取25mg/ml的蛋白标准溶液稀释至0.5mg/ml（用0,9%氯化钠或PBS稀释标准品放在

-20℃长期保存）

3. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA

工作液，充分混匀

4. 将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20微升加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液，补足

到200微升，加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准稀释液到20微升

5. 各孔加入200微升BCA工作液，37℃放置30min，注：也可以室温放置30min，BCA

测蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深并且显色反应会因温度升高而加快，如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间

6. 测定A562,540-595之间的波长也可以接受，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度

标准曲线为Y=0.023X+0.017

浓度测定：每孔加1微升蛋白+19微升PBS再加BCA试剂（A:B=50:1）200微升每孔，

室温放置40min，然后上酶标仪测562波长处A值，带入标准曲线计算得X值，上样量=100/X*0.5

蛋白质的变性：

1. 将5*SDS()稀释成2*SDS（400微升5*SDS加600微升超纯水）

2. 加100微升蛋白至EP管中再加入100微升2*SDS混匀，置于沸水中煮5min，然后将

变性蛋白分装待用

制胶与电泳：

1. 2. 3. 4.

把模具装好，短板在外，长板在内，检漏

分离胶配好后，加入模具中，用蒸馏水封满，将气体赶走，40-60min后，完全凝固 将蒸馏水倒掉，配浓缩胶，加入模具，插梳子，待40min

将模具放入电泳槽加入电泳缓冲液，然后将梳子拔出将样品加入梳孔中，弄好装置进行电泳（电泳条件：刚开始为55v待maker分出条后改为110v）

注：

1. 装置要配套，梳子和玻璃板要配套 2. 加入浓缩胶后立即插梳子

3. 拔梳子和加样要在加入电泳液之后

转膜：

1. 打开装置取出胶放入加好转膜缓冲液的托盘中，将转膜板黑色的平放，放上3层滤纸，

取出胶切好放于滤纸上，再放NC膜，最后放三层小于胶面积的滤纸盖好 2. 扣好放入转膜槽，倒入转移缓冲液，装好设备，I=200mA 2h冰上转膜

注：上面三层滤纸要比下面的小，以免上下接触发生短路 封闭：

封闭液现配：1.5g奶粉+30mlPBST常温3-6h或4℃冰箱过夜

一抗孵育：

1. 将封闭液倒掉，用PBST洗3次每次10min 2. 配备一抗稀释液

3． 将一抗倒入培养皿中，没过NC膜即可（4℃冰箱，摇床过夜或常温2h）

二抗孵育：

1. 将一抗稀释液回收，用PBST洗三次，每次10min

2. 配二抗稀释液如：1微升二抗+10mlPBST

3. 将二抗孵育液倒入培养皿中，常温孵育2h避光

4. PBST洗3次每次10min

曝光

1. 2. 3. 4.

准备20μL移液枪，黄色枪头，镊子，剪到，1.5ml离心管，发光试剂盒，显影液，定影液，保鲜膜，玻璃板 将保鲜膜贴到玻璃板上尽量无气泡

将NC膜用镊子取出放在玻璃板上，晾干正面朝上，塑料盒子装些自来水 拉住窗帘关灯，配发光试剂（A瓶20微升和B瓶20微升），且根据样品组数来计算用量，将配好的发光试剂，分两次用小的移液枪加在NC膜上，抹均匀些，用之前留好的保鲜膜盖在NC膜上尽量无气泡

5. 6. 7.

剪胶片曝光，在两个塑料盒里分别倒入显影液和定影液，两手把胶片拉近贴在NC膜上，把红灯关掉，可曝光10s，20s，30s，40s

先放入显影液中，待条带出来再放入定影液中，最后放入自来水盒子里 将显影液和定影液回收，4℃冰箱保存一年

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