IEF-SDS PAGE双向电泳技术

双向电泳

一、材料

样品：人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH

二、试剂

SDS-PAGE所需试剂 1、30％Acry-Bis (w/v)

29.2％Acry29.2g

0.8％Bis0.8g

加水至100ml溶解，棕色试剂瓶4℃贮存，PH<7，数月后重配

2、10％的SDS贮液 (w/v)

RT保存，因SDS在4℃会析出

3、Tris-HCl buffer

①1.5M的PH8.8的Tris-HCl buffer——分离胶buffer

100ml含Tris18.171g，加DDW至80ml，用浓HCl调PH8.8，再定容至100ml，4℃保存

②1.0M的PH6.8的Tris buffer——浓缩胶buffer：

50ml 含Tris6.057g，加DDW至40ml，用浓HCl调PH6.8，再定容至50ml，4℃保存

4、TEMED

以游离碱形式发挥作用，催化AP形成自由基，故PH较低时，聚合反应受抑制，易吸湿，被氧化，从无色变为黄色，故因密闭4℃保存

5、10％ AP

1g的AP溶于10ml水中，4℃保存，隔周新鲜配置

6、PH8.3 电泳缓冲液1L，RT保存

Tris碱

Gly（25.05） SDS

加水至1L，可不调PH

7、甘油液4℃ 31ml 丙三醇 5.5ml DDW 25.5ml

3g 14.4g 1g

终浓度 250mM 250mM 0.1% (192mM)

8、考马斯亮蓝染液CBB （RT，50%甲醇+冰醋酸+R250）

总体积

100ml 45ml 45ml 10ml 0.25g

终浓度 45% 10% 0.1%

甲醇Methanal

水 冰醋酸

R250

改进：（0.12% G250, 10% (NH4)2SO4, 10% H3PO4, 20% 甲醇）

100ml H2O+100ml H3PO4（先混匀，产热的）+100g粉末状(NH4)2SO4（边搅拌边加）先溶解，然后加入1.2g G250再溶解（不能真正溶解），定容至800ml，边搅拌边加200ml甲醇，终体积1000ml（可至少保存半年）。

9、脱色液

7.5ml的冰醋酸

5ml的甲醇 加水至100ml

或者用含有少量NaCl的清水进行脱色

IEF 试剂

10、一向裂解液Lysis buffer ，-80℃贮存

总体积 urea

硫脲(thiourea) CHAPS DTT

Amphylyte PH3~9.5 Tris-base

EGTA (100mM)

临用前加

PMSF(100mM)

MW 60.06 76.12 614.89 154.25 121.14

10ml 4.2042g 1.5224g 0.4g 0.108 200μl 0.048456g 400μl 200μl

终浓度 7M 2M 4% 70mM 40mM 4mM 2mM

11、一向管胶覆盖液 Overlay buffer ，-80℃贮存 Lysis buffer 稀释一倍即可

12、上下槽电泳液（现配）

上槽阴极液（20mM的NaOH）：10ml 1M的贮液加水至500ml

下槽阳极液（10mM的H3PO4）：5ml 1M的贮液加水至500ml 注：若分离碱性蛋白，上下槽电极液互换

13、平衡缓冲液：一向管胶之后的balance buffer

2% SDS 10%甘油

5%β-巯基乙醇/DTT 62.5mM的Tris-HCl (PH6.8) 微量溴酚蓝

SDS 甘油

β-巯基乙醇/DTT

Tris-base 溴酚蓝 浓HCl调PH6.8

14、固定液

50%的甲醇+10%的乙酸

15、一向管胶配方

尿素 DDW 10% NP-40 30?ry-Bis 甘油液

PH4~6

Amphylyte

PH6~8

PH3~9.5 10%APS TEMED 100ml 2g 10ml 5ml/1.54g 0.757125 微量

200ml 4g 20ml 10ml/3.08g 1.51425 微量

终浓度 2% 10% 5% 62.5mM

14~15cm*4 1.152g 160μl 160μl 400μl 744μl 18μl 18μl 36μl 3.2μl 0.8μl 14~15cm*8 2.304g 320μl 320μl 800μl 1488μl 36μl 36μl 72μl 6.4μl 1.6μl

16、分离胶 40ml 18*16*0.1cm (1块)

胶浓度 DDW 30% Acry-Bis 1.5MPH8.8 Tris 10% SDS 10% AP TEMED 12.5% 12.4ml 16.8ml 10ml 400μl 400μl 16μl 12.8% 12.13ml 17.07ml 10ml 400μl 400μl 16μl 13% 11.87ml 17.33ml 10ml 400μl 400μl 16μl

17、5% 浓缩胶 3.2ml 18*1.5*0.1cm (一块)

H2O

1.84ml 0.536ml 0.8ml 0.032ml 24μl 4μl

30% Acry-Bis 1M PH6.8 Tris 10% SDS 10% AP TEMED

三、实验步骤

蛋白质样品制备

1、 收集冻存的细胞至1.5ml以称重的eppendof管中 2、 离心 1000rpm 5min

3、 弃上清，吸干液体后称重，得到细胞样品质量

4、 按每μg/3μl的量加入lys液和1/10的ase 5、 混匀后冰浴超声40min~50min

6、 4℃放置30min~1h使细胞充分裂解，蛋白溶解 7、 临上样前0~2℃266g/min 离心30min 8、 测蛋白浓度，分装

第一向：等电聚焦电泳（IEF）

1、 管胶的配置：按照试剂所示将各成分溶解于5或10ml的玻璃小烧杯中，搅拌至urea

完全溶解，最后加入TEMED＆APS轻轻搅拌混合均匀（注意搅拌温度不能超过脲的分解温度37℃）。

2、 灌胶：将上次做完2D的1st管泡酸。使用前捞出，自来水/蒸馏水冲洗，80℃烘干

备用（确保管内干燥无水分）。APS新购一瓶12ml，先分装1ml至离心管中，原瓶用封口膜封好（体积占总胶体积的2%）。在玻管14cm处标记，底部用封口膜封住，管子凉后用注射器罐胶，然后用正丁醇封顶，待胶凝。

3、 预电泳：配置上下槽电泳缓冲液，上槽20mM的NaOH，下槽10mM的H3PO4，磷

酸先倒入下槽，NaOH待用（若分离碱性蛋白，上下槽电极液互换）。吸出管中正

丁醇，用DDW洗3次，拆除底部封口膜，用少量磷酸湿润管底以防气泡产生。将管安装至电泳槽上，上槽加入10μl覆盖液+NaOH至顶部溢出，NaOH倒入上槽，安装好电泳槽，开始预电泳，200V 15min ，300V 30min ，400V 45min 。 注：管子、平皿做好标记，表明处理组和对照组。

4、 IEF电泳：预电泳结束后，将上槽电极缓冲液倒出，吸出管中上部液体，DDW洗3

次，上样：40μl样品+10μl覆盖液+NaOH至溢出，倒回NaOH，安装好电泳槽，打开电源开始电泳，600V 14~18h ，800V 1~2h ，1000V 30min~1h 。

5、 下胶及平衡：等电聚焦结束后，小心取下胶管洗净玻管表面电极液，将胶条从管中

脱出，DDW洗数次后，balance buffer 中平衡2次，10~15min/次（平衡前，也可用

12%的TCA固定胶条30min以上，清洗后平衡）。

第二向：SDS-PAGE

1、 凝胶的制备：同SDS-PAGE，不用插Telfon梳子。

2、 上样及电泳：同时拆掉二向胶的夹子和底部胶布，用针头小心将平衡后的一向管胶

移至平板上，再转移至二向胶的顶部，用0.5琼脂糖（用PH8.3的电泳缓冲液配置）

封好，安装好电泳槽，倒入下槽电泳缓冲液，移至4℃冰箱中，带琼脂糖完全凝固（以防顶部的agorose未凝，buffer将管胶冲出）之后加入上槽电泳buffer，初始电压60V，待溴酚蓝跑出琼脂糖完全进入分离胶之后，将电压升至120V。下同PAGE。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/6sh.html