细胞生物学实验指导

实验一 显微镜的结构及使用

[实验目的]

（一）熟悉显微镜的结构及各部件性能。 （二）掌握显微镜的使用方法。 （三）了解显微镜的维护方法。 [实验原理]

虽然显微镜的目镜和物镜的结构很复杂，但它的作用相当于一个凸透镜，其成像原理和光路图如图1所示，被检物体AB放在物镜（O1）下方的1—2倍焦距之间，则在物镜（O1）后形成一个倒立的放大实像A1B1，这个实像正好位于目镜（O2）的下焦点之内，通过目镜后形成一个放大的虚像A2B2，这个虚像通过调焦装置使其落在眼睛的明视距离处，即25cm,使所看到的物体最清晰，也就是说虚像A2B2是在眼球晶状体的两倍焦距之外，通过眼球后在视网膜形成一个倒立的A2B2缩小像A3B3。

[实验器材]擦镜纸 字母装片 羊毛交叉擦片 普通光学显微镜 二甲苯 香柏油 三 内容与方法：

普通光学显微镜(Microscope)的外形和结构因类型不同略有差异，但基本结构和功能是相似的。（图2） （一） 1.

微镜的基本结构及功能：光学显微镜由机械部分、照明部分和光学部分构成。 机械部分：

（1）镜座：位于底部的金属座。一般为马蹄形，用以支持和稳定整个镜体。 （2）镜柱：镜座与镜臂相连的短柱。

（3）镜臂：镜柱上方弯曲部分，是取用显微镜时握拿的部位。

（4）镜筒：在镜臂的上方倾斜的金属园筒，上端装有目镜、下端转折处装有棱镜，使光线转折450。其上有一固定螺钉将镜筒连接于镜臂上方。

（5）调节器：在镜柱两侧有大小两个螺旋，大螺旋为粗调节器，转动时能使载物台快速升降。调节范围较大，适于低倍镜调焦用。小螺旋为细调节器，转动是载物台仅缓慢升降，调节范围较小，适于调节物象的清晰度。此外，在右侧粗调节器内侧有一窄环，称粗调松紧调节轮，用以调节粗调节器的松紧度。向外转时偏紧，向内转时偏松。左侧粗调节器内侧有一粗调限位调节环凸柄，向上推紧时，镜台上的最高点被固定（这两个环一般不需调节 ）。 （6）旋转盘：又称物镜转换器，安装在镜筒下端，为一可旋转的圆盘，上有4个圆孔，

图2 显微镜的结构

1.目镜 2.镜筒 3.物镜转换器 4.物镜 5.通光孔 6.聚光器 7.光圈 8.反光镜 9.粗调节器 10.细调节器 11.镜臂 12.推进器 13.载物台 14.倾斜关节 15.镜柱 16.镜座 17.照明装置 18.粗调限位环凸柄 19滤光片座

用以安装放大倍数的物镜，转动旋转盘使不同的物镜达到工作位置（即与光路合轴）。 （7）镜台（载物台）：为方形平台，位于物镜下方，用以放置观察标本。镜台中央有一通光孔。

（8）推进器：位于镜台后方，上安有弹簧夹，用来固定玻片标本。在镜台左下方有两个同轴螺旋，转动时可使玻片标本前后或左右移动。推动器上有纵横两个游标尺，用以测定标本在视野中的方位（图1-2）。游标尺一般由主标尺（A）和副标尺（B）组成。副标尺的分度为主标尺的9/10。使用时，先看副标尺的0点位置，再看主副标尺的重合一致点，即可读出数值。如图所示数值为26.6mm。

图3 游标尺的用法

2．光学部分：

（1）目镜：装于镜筒上端，其上端刻有10×或15×等符号，表示不同目镜的放大倍数。可根据不同的需要选择不同的目镜。目镜中有视场光光阑，光阑上装有指针，可转动目镜，将指针指向标本的具体部位。目镜中也可安装目镜测微尺。

图4 物镜的工作距离和同高调焦

（2）物镜：依放大倍数不同，分低倍镜，高倍镜和油镜三种。每个物镜上刻有相应的标记（图4）。如10倍物镜上标有10/0.25和160/0.17:10为物镜的放大倍数，0.25为镜口率，它决定物镜的分辨率；160表示镜筒长度为160mm，0.17表示标准盖玻片厚度应为0.17mm。从外形上怎样区分几种物镜？低倍镜：镜身短小，镜面直径最大，镜身上刻有8或10。高

倍镜：镜身长而较较粗，镜面直径较小，刻有40或45。油镜：镜身最长，镜面直径最小，其上刻有90或100。各种物镜上标有不同的色圈，如红，黄或白色。高倍镜下方有黄色圈，油镜下方有白色圈，作为识别标志。不同的物镜有不同的工作距离。所谓工作距离是指显微镜处于工作状态（对焦后，物象清晰）时，物镜最下端与盖玻片上表面之间的距离。物镜的放大倍数与工作距离成反比。当低倍镜调节到工作距离时，可直接转高倍镜或油镜，然后由细调节器稍加调节，即可见到清晰物象，这就称为同高调焦。显微镜的放大倍数=目镜放大倍数×物镜放大倍数。如目镜为10×，物镜为40×，其放大放大倍数为10×40=400倍。 （3）聚光器：位于镜台通光孔下方，由一组透镜组成，能将反光镜反射而来的光线集中到标本上，以增加亮度，其左下方有一小螺旋，转动时可升降聚光器，上升时，光线增强，下降时，则光线减弱。

（4）反光镜：位于聚光器下方，分平、凹两面，能向各方向转动，将光源发射的光线反射到聚光器中。凹面有聚光作用， 适用于较弱光和散射光。光线较强时采用平面镜。 （5）光阑：装有聚光镜下方，由许多金属片组成，外侧有一小柄，拨动时可使光阑扩大或缩小，以调节亮度。光阑大则光线强，适于观察深色标本；色浅或未染色的标本，则应缩小光阑，使光线减弱，才能观察。光阑下方有滤光片座（或）环放置各式滤光片。 （二）显微镜的使用方法 1.低倍镜的使用：

（1）准备：打开镜箱，右手握镜臂，取出显微镜，左手托座，轻轻放于实验台座位偏左侧，以镜座后端距桌边约5cm为宜。

（2）对光：转动粗调节器，使镜台略有下降，转动旋转盘使低倍镜对准通光孔，此时可听到轻微的扣碰声，使目镜和物镜的光轴一致。开大光阑，上升聚光器，双眼睁开，用左眼向目镜内观察，转动反光镜，直到视野内光线明亮均匀。

（3）置片：将标本有盖玻片的一面向上置于镜台上，夹住，然后转动推进器螺旋，把标本移到通光孔中央。

（4）调焦：转动粗调节器，从侧面注视，使低倍镜距标本约为5mm处（切勿边在目镜中观察，边转动粗调节器，以防镜头碰撞玻片造成损坏）。然后双眼睁开，用左眼观察，慢慢转动粗调节器，使镜台下降，当视野中出现物象时停止。上下转动细调节器，使物象调到最清晰为止。如果物像不在视野中心，可扭动推进器螺旋，前后、左右移动将标本移到视野中央。在调焦时，若镜头与标本玻片的距离已超过1cm时，还未见物像，则应按上述步骤从头重新操作调焦。这些步骤必须反复练习，熟练掌握。 2．高倍镜的使用：

（1）一定要在低倍镜下找到要观察的清晰物像后，再把需要放大的部位移到视野正中，然后转换高倍镜观察。

（2）转换高倍镜时，先从侧面注视，镜头不与玻片碰撞时，才能转换高倍镜。然后用左眼观察，慢慢上下转动细调节器（切勿使用粗调节器），即可见到清晰物像。注意：若发生高倍镜头玻片碰撞，不能用力强转，若转换后找不到物像时，应仔细查找，可能有下列原因：一、若玻片标本放反了，应将有盖玻片的一面朝上放置。或物镜未旋紧，使工作距离偏差太大，应将镜头旋紧。二、观察的标本不在视野内，标本太小或太少。这时应转换低倍镜，仔细地找到标本并置于视野正中心，再转换高倍镜观察。三、色浅或未染色标本，光线太强，也不易看到。应将聚光器降低，或缩小光阑，减少进光。更换标本时，应先转开高倍镜，然后再取出或放置标本。

3．油镜的使用：在观察标本的细细微结构时使用。

（1）在低倍镜或高倍镜下，把欲观察的部分移到视野的正中央。

（2）将聚光器升到最高位置，并将光阑开到最大（因油镜所需光线较强）。

（3）移开物镜，在待观察部位滴一滴香柏油。眼睛从侧面注视着，使油镜转到工作状态，此时油镜的下端镜面一般正好浸在油滴中。也可先稍稍上升镜筒（或下降载物台），使油镜对准通光孔，再使油镜下端浸入油滴中。

（4）用左眼观察目镜，慢慢转动细调节器，直到物像清晰。

（5）油镜使用完毕，应转开镜头，用擦镜纸把镜头上的香柏油擦干净，再用一张擦镜纸沾少许二甲苯轻擦，最后用干净的擦镜纸再擦一遍。 （三）标本观察

以英文字母（或数字）装片、红绿羊毛交叉装片或其它标本为材料，严格按照上述操作程序和注意事项反复练习低倍镜、高倍镜和油镜的使用方法。

1.字母装片：取字母片，先用眼睛直接观察一下字母的方位和大小，然后放到低倍镜下观察。注意视野中字母的方位发生了什么变化？标本移动的方向与视野中物像移动的方向有何不同？

2.红绿羊毛交叉装片：先在低倍镜下仔细观察找到两根羊毛的交叉点，将交叉点移到视野中央后换高倍镜观察，利用细调螺旋分别对两根羊毛进行调焦，分辨出两根羊毛的上下位置。 （四） 使用显微镜应注意的事项

1.取用显微镜时，应一手紧握镜臂，一手托住镜座，不要用单手提拿，以避免目镜或其它零部件滑落。

2.使用镜筒直立式显微镜时，镜筒倾斜的角度不能超过450，以免重心后移使显微镜倾倒。在观察带有液体的临时装片时，不要使用倾斜关节，以避免由于载物台的倾斜而使液体流到显微镜上。

3.不可随意拆卸显微镜上的零部件，以免发生丢失、损坏或使灰尘落入镜内。

4.显微镜的光学部件不可用纱布、手帕、普通纸张或手指揩擦，以免磨损镜面，需要时只能用擦镜纸轻轻擦拭。机械部分可用纱布擦拭。

5.在任何时候，特别是使用高倍镜或油镜时，都不要一边在目镜中观察，一边下降镜筒（或上升载物台），以避免镜头与玻片相撞，损坏镜头或玻片标本。

6.显微镜使用完后应及时复原。先升高镜筒（或下降载物台），取下玻片标本，使物镜转离通光孔；如镜筒、载物台是倾斜的，应恢复直立或水平状态。然后下降镜筒（或上升载物台），使物镜与载物台相接近；垂直反光镜，下降聚光器，关小光圈。最后放回镜箱中锁好。 7.在利用显微镜观察标本时，要养成两眼同睁，双手并用（左手操纵调焦螺旋，右手操纵标本移动器）的习惯，必要时应一边观察一边计数或绘图记录。 [作业与思考]

1.怎样区分三种物镜？为什么使用高倍镜或油镜必须按照从低倍镜到高倍镜再到油镜的顺序进行？

2. 如果在高倍镜下找不到物像，应从哪些方面找原因，如何解决？ 3. 要经过哪些步骤才能在镜下找到清晰物像？ 附录 其他显微镜简介

在生物学和医学研究中，还常用以下几种显微镜。

1.双筒解剖显微镜：解剖较小标本或观察玻片标本外形全貌时，需使用解剖显微镜，以观察自然状态的较小的实体（正像），解剖细小生物。

2.暗视野显微镜：它利用中央遮光板或暗视野聚光器，使光源的中央光束不能从聚光器的中心部分射入物镜，从而形成暗视野，而聚光器边缘的光线倾斜地照射在标本上，经标本的反射或散射，投入物镜内，因而在暗视野中看到的是被检测物体的衍射图像，并非物体本身。

所以暗视野显微镜被用来观察普通显微镜不易观察到的微小生物体的存在和运动，但它不能分辨其细微结构。

3.荧光显微镜：最主要的特点是以紫外光为光源。利用紫外光照射，激发标本内的荧光物质或被荧光染料染色的标本发出不同颜色的荧光，再通过物镜和目镜的放大进行观察，其敏感性高，可用来研究标本内某些物质的化学特性和存在位置。

4.相差显微镜：其聚光器下装有一环状光阑，物镜中安有相位板，两者互相配合，能使光波的相位差变成振幅差，这样可增大物体明暗的反差，用于观察未染色活细胞听微细结构。 5.倒置显微镜：物镜位于标本的下方，而光源位于标本的上方。使镜台上方距离增大，主要用于细胞培养时观察培养瓶中细胞的生长情况。

实验二 细胞的基本形态结构观察

[实验目的]

1. 掌握光镜下真核细胞的基本形态结构。 2. 掌握临时制片和显微绘图的方法。 [实验原理]

细胞是生物体的基本结构和功能单位。细胞的形态多样，大小差别很大。不同的细胞形态虽不同，但其基本结构相同，都包括细胞膜、细胞质、细胞核三部分，植物细胞还有细胞壁。细胞的这几部分结构在光镜下可以观察到。

在显微镜下观察的标本，有临时制片和永久制片两种。临时性的标本是指在进行实验观察时，临时制备的不能长期保存的标本片。临时制片有装片和涂片等。 [实验器材]

1. 器材：光学显微镜、载玻片、盖玻片、牙签、纱布、擦镜纸、香柏油。 2. 材料：人口腔上皮细胞、蟾蜍、洋葱。

3. 试剂：1%碘液、9%生理盐水、Ringer氏液70%酒精。 [内容与方法]

（一）人口腔粘膜上皮细胞临时制片与观察

1.载玻片与盖玻片的揩擦：取一张载玻片，用左手拇指及食指夹住载玻片长轴的两端，右手用食指和拇指夹取一块清洁的纱布，将玻片上下两面均匀擦拭，直到完全清洁为止。再取一张盖玻片，擦拭方法同上，但盖玻片小而薄，用力要轻而均匀，否则易破碎。

2.标本的制备：取一已擦净的载玻片，在其中央滴一滴生理盐水。先清洁口腔，然后用左手托腮部，用消毒牙签阔端在自己口腔面颊部粘膜上刮取少许上皮细胞，将刮下的上皮细胞放于生理盐水中轻轻摆动，使细胞分散；吸一小滴碘液滴在标本上，染色1~2分钟，然后用镊子轻轻夹住盖玻片的一端，将其对侧端先接触载玻片的液体，并与载玻片呈小于450的角度，慢慢地倾斜盖下，防止产生气泡。再用吸水纸从盖玻片的一端吸去多余的水分。

3.观察：将已制备好的人口腔上皮细胞临时制片置于显微镜的载物台上，先用低倍镜观察，可见被染成淡黄色的细胞，成群或分散存在。选择完整而轮廓清楚的细胞移至视野中央，转换高倍镜观察，可见口腔上皮细胞为扁平椭圆或不规则形。包围在细胞外围的一层薄膜称为细胞膜；中央有圆形或椭圆形细胞核，被碘液染成黄色，核中可见一致密的小体，即核仁；在细胞核与细胞膜之间的物质称为细胞质，其中分布有细胞器（图5）。

图6 血涂片推片方法示意图 图5 人口腔上皮细胞

图7 洋葱鳞茎表皮细胞

（二） 血涂片的制备与观察

用解剖针捣碎蟾蜍的脊髓，处死之后，（亦可用乙醚将蟾蜍麻醉）打开胸腔，剪开心包，小心地将心脏剪一小口，在干净的载玻片一端沾一小滴的心脏血，右手取另一张载玻片，使其中一端紧帖血滴，使血滴沿其边缘展开后，以300~450角向玻片的另一端推去（图6），制成较薄的血涂片，室温下晾干，70%酒精固定10分钟。然后将血涂片置于低倍镜下观察，可见大量的血细胞。选择涂片均匀的部位，移至视野中央，转换高倍镜观察，可见红细胞呈椭圆形，中央有一细胞核。 （三）洋葱鳞茎表皮细胞的观察

1.洋葱鳞茎表皮细胞装片标本的制备：取一擦净的载玻片，滴一滴碘液，将洋葱鳞茎用小刀分为几块，取一块肉质磷叶，用镊子在其内表面轻轻撕下一小块膜质表皮，剪成约3~4mm2的小块，置于载玻片的碘液滴中，铺平，盖上盖玻片。

2.观察：将制备好的装片标本放到显微镜下，先用低倍镜观察，可见许多长柱状排列整齐、彼此相连的细胞，选择其中一个较典型的细胞移至视野中央，再转换高倍镜仔细观察以下结构（图7）。

（1）细胞壁（cell wall）:为细胞最外面 一层由纤维素组成的较厚结构（它是植物细胞的重要特征之一）。细胞膜（质膜）位于细胞壁内侧并与其紧密相帖，光镜下不易分辨。 （2）细胞核(nucleus):位于细胞中央，呈椭圆形，成熟的细胞由于液泡挤压，核位于质膜边缘。调节细调节器，可见核内有1~2个折光较强的核仁。

（3）细胞质(cytoplasm):细胞膜与细胞核之间的区域，其中可见一至数个充满液体的小泡，称为液泡。

[作业与思考]

绘口腔上皮细胞、蛙红细胞及洋葱鳞表皮细胞图，并注明各部分的结构名称。

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