western blot 操作流程

western blot 操作流程

（一） SDS-PAGE电泳

（1） 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用

自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。 （2） 灌胶与上样

1．玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶）

2．灌分离胶时，可用1ml 枪吸取1ml胶沿玻璃放出，溶液缓慢加入到装配好的板中至凝胶高度为6cm左右，预留1.5 cm高度配制浓缩胶。然后胶上加一层水，液封后的胶凝得更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）室温放置0.5－1小时左右至完全凝固。

3．当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4．制备浓缩胶（PH6.8）：4%浓缩胶配合<10%的分离胶使用，6%浓缩胶配合>10%的分离胶使用。 将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。凝胶聚合约0.5－1小时左右。 5. 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面向外。）

6. 取提取好的蛋白，约10－15ul与5×SDS上样缓冲液按5：1的比例混合，加到1.5ml 离心管中，然后沸水中煮3－5min使蛋白完全变性。

7. 电泳：电泳时间一般 2-3 h，电压为 100V 较好，也可用 120－150V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，然后进行转膜。（电泳缓冲液用1×SDS上样缓冲液） （二） 转膜

实验前的准备工作：

1. 制备足够的转移缓冲液以充满转移槽，另外准备200 ml 用于平衡凝胶和膜以及润湿滤纸 2. 从玻璃板上取下凝胶，去除所有浓缩胶。 3. 将凝胶浸入转移缓冲液中15 - 30 分钟。 4. 滤纸在转移缓冲液中至少浸泡30 秒。 5. 准备膜：

a、硝酸纤维素膜：将膜浸入转移缓冲液中15 - 30 分钟 b、PVDF 膜

在甲醇中润湿膜15 秒，保证膜由不透明变成半透明。小心将膜放入双蒸水水中浸泡2 分钟。小心将膜放入转移缓冲液中平衡至少5 分钟。

（1）将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

（2）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破，同时在胶的右上角做个记号。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，

要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）

（3）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的红面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。转膜装置置于冰水中，打开电源30 mA过夜或200 -300mA2小时。 （4）转完后在膜上做个记号，以判断膜的正反面，如果需要看转移是否成功，可以将膜用1×春红染液染5min（于脱色摇床上摇）,然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。 （三）免疫反应

（1）将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下,用封闭液在脱色摇床

上摇动封闭2h或者４度过夜，如果预实验做完后，发现背景比较高，可以适当延长封闭时间。如果以后需要做膜再生实验的，最好用脱脂奶粉做封闭剂。

（2）通常用自封袋装溶液，溶液体积大概2-5ml，从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后（不必洗涤），

将膜蛋白面朝上放于抗体液面上，脱色摇床上室温孵育2h后，用TBST（现配）在室温下脱色摇床上洗3次，每次5-10min，如果预实验发现背景比较高，可适当增加洗涤和洗涤时间；如果预实验发现条带较淡，可以一抗４℃过夜孵育。

（3）同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温孵育 2h 后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次

5-10min；如果预实验发现背景比较高，可适当增加洗涤和洗涤时间；如果预实验发现条带较淡，可以二抗４℃过夜孵育。

（四）ECL化学发光，显影，定影

（1）将 A 和 B 两种试剂在离心管中等体积混合；1min 后，将溶液平铺在膜蛋白面，暗

室反应2min后去尽残液，包好，放入X-光片夹中。

（2）在暗室中，将影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出 X－光片，用切纸刀

剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大 1cm）；打开X-光片夹，把 X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上 X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为 1min 或 5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开 X-光片夹，取出 X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于 16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把 X-光片浸入定影液中，定影时间一般为 5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。 （五）凝胶图象分析

将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标条带和内参条带的净光密度值以及它们的比值。

附录：夹层装置如下图：

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/6qs7.html