CRISPR说明书

用于CRISPR基因组编辑的一体式载体系统使用GeneArt? CRISPR核酸载体试剂盒进行转染、 富集、筛选并发表研究成果。GeneArt?规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)核酸系统是简单、

即用的多功能表达载体系统，同时包含用于快速、高效克隆靶向特异性crRNA的Cas9核酸表达

框架和gRNA框架。此系统允许您以序列特异性方式，从单个质粒编辑和设计您所选的遗传位点 。通过GeneArt? CRISPR鉴定相关靶标后，可采用GeneArt? Precision TAL验证生物相关突 变，以降低潜在的脱靶几率。 现以两种形式供应： 1. 内置即用型试剂盒 2. 定制

三组分的CRISPR编辑

基因组编辑采用人工核酸结合源性修复机制来改变细胞内的DNA。CRISPR/Cas系统充分利用了短gRNA的优势来靶向细菌Cas9核酸内切酶、定位遗传位点。由于gRNA能够提供特异性，更改靶标时，仅需要更改gRNA序列编码的设计。

基因编辑中所用的CRISPR/Cas系统包含三种组分：Cas核酸Cas9（双链DNA核酸内切酶）、一种靶向补充物crRNA以及一种辅助反式激活因子crRNA（图1）。GeneArt? CRISPR核酸载体的crRNA和tracrRNA都以gRNA的方式一同表达，其中gRNA则在细菌系统中模仿天然的crRNA-tracrRNA嵌合体。所有需要做的工作就是引入一个编辑所需的序列的双链寡核苷酸，以表达契合体的crRNA部分。

图 1. CRISPR/Cas9 靶向的双链断裂。双链上均出现断裂，发生在靶向序列3端NGG前间区序列邻近基序(PAM)序列的3碱基对上游。

GeneArt? CRISPR核酸载体试剂盒

GeneArt? CRISPR核酸载体试剂盒是用于表达哺乳动物细胞内CRISPR/Cas基因组编辑所需功能组分的报告基因载体系统。这一系列试剂盒现提供有不同的报告基因：带有OFP（橙色荧光蛋白）的GeneArt? CRISPR核酸载体，支持Cas9和CRISPR RNA表达细胞群的流式细胞术分选(FACS) （图2A）；带有CD4的GeneArt? CRISPR核酸载体，支持微珠法Cas9和CRISPR RNA表达细胞群富集（图2B）。

线性化GeneArt? CRISPR核酸载体可提供快速、高效的双链寡核苷酸克隆方法，可将编辑crRNA（代表所需的靶标）的双链寡核酸克隆进可对Cas9进行序列特异性靶向的表达框架中。

图2. GeneArt? CRISPR核酸酶载体图谱。使用预线性化的载体 (带有5个碱基对突出末端)，轻松克隆编码靶点特异性crRNA的双链DNA寡核苷酸。图谱为带有 (A) OFP报告基因和 (B) CD4报告基因的载体。gRNA、Cas9和报告基因均通过相同载体表达。Cas9通过核定位信号靶向细胞核 (NLS1和NLS2)。

采用一组GeneArt?基因组剪切检测试验测定基因修饰效率

切割效率可采用GeneArt?基因组切割检测试验进行检测，这一技术采用错配检测内切酶方法来检测胞内NHEJ修复期间因合并插入和/或切除而产生的插入或缺失。

图3. CRISPR/Cas9介导的切割效率。采用GeneArt?基因组切割检测试验（计划于2014年1月发布）研究HPRT位点时的凝胶图像。(A) 采用表达HPRT特异性CRISPR RNA的GeneArt? CRISPR核酸OFP载体获得的结果。(B) 采用表达HPRT特异性CRISPR RNA的GeneArt? CRISPR核酸CD4载体获得的结果。在转染进HeLa细胞后，进行三联切割试验，并计算插入或缺失的百分比。

富集表达Cas9和gRNA的细胞群

由于Cas9基因与OFP或CD4连接，使用GeneArt? CRISPR核酸多功能载体系统时的使用效率可采用荧光显微镜或FACS（如为含有OFP的质粒），或采用抗CD4荧光抗体（如为CD4质粒）进行监测。

图7. 表达Cas9和gRNA的细胞群的富集。(A) 使用靶向RelA 位点的GeneArt? CRISPR核酸OFP载体编码的crRNA时，在293T细胞中的沾染效率。数据显示，感染的样本中含有超过90%的OFP阳性细胞。(B) GeneArt? CRISPR核酸CD4载体的CD4功能。293 FT细胞转染了AAVS1特异性的GeneArt? CRISPR核酸CD4载体。采集细胞并采用抗CD4 FITC抗体染色，之后采用流式细胞仪进行分析以测定转染效率。一部分染色的细胞还被接种到一个平板上，以便采用荧光显微镜进行分析。

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