拟南芥植物组织培养

拟南芥组织培养

一、种子消毒：

方法一：将拟南芥种子置于1 .5 ml eppendorf 管(微量离心管)中，加入1 ml 蒸馏水，4C春化3 d，70 %（v／v ）乙醇1mi n、7 %（v／v ）次氯酸钠10 mi n 浸泡消毒，并用无菌水冲洗5 次。

方法二：在超净工作台内，用无菌蒸馏水浸泡1 min，然后用80％乙醇消毒90s，最后用无菌蒸馏水冲洗3～5次备用。

消毒完毕的种子可以用200ul的tips吸去洗涤液，然后在超净工作台上挥发掉残余水分、洗涤液。

方法三、取野生型拟南芥种子放人离心管内，75％乙醇清洗后，无菌蒸馏水清洗1—2次，转入无菌离心管；5％次氯酸钠溶液浸泡5—6 min，用无菌蒸馏水清洗3～4次，加入1 ml无菌水，用移液枪接种。 二、选用的培养基

选用1/2MS培养基对种子进行培养。（MS和1/2MS都可以，1/2MS就是大量元素减半，其他东西和ms培养基是一样的量。糖可以加，会长得比较好，但是也很容易污染。如果在平板上要生长时间比较长，需要做一些实验的，比如根的发育，最好不要加。）也可以用MS+30 g／L蔗糖的固体培养基。（我想两种培养基都接种上，比作对比确定好坏）。

MS培养基配料表：

三：接种方法

拟南芥种子消毒后，用移液枪吸取拟南芥种子和水的混合物，均匀地在MS 生长培养基的培养皿平板上滴落，并使之形成两条平行的直线。（如不行，可适当添加琼脂）。

四、培养得无菌苗 接种后置于光照培养箱(型号：GXZ．500C；培养光照条件为16小时光照，8小时黑暗，培养温度为22℃中竖直培养。3天后即可取材用于器官离体再生实验。萌发5天后，在超净工作台中，用镊子将苗移栽到装有1／2 MS培养基的50ml三角瓶中（每瓶4--6棵，视情况而定），于短日照条件下培养30天左右获得无菌苗。（短日照光照条件8小时光照，16小时黑暗，长日照光照条件为16小时光照，8小时黑暗，培养温度均为22℃。）此处获得无菌苗的时间有异议，应该为2--3周？

五、外植体的选取

B5 + 5 mg／L2 ，4-D+ 0 .5 mg／L KT 培养基上诱导愈伤组织,莲座叶作外植体出愈慢，出愈率低，愈伤组织质量较差；叶柄、下胚轴和根作外植体出愈快，且愈伤组织质量好，后期易分化。

由于叶柄、下胚轴相对较短，难于收集，为了便于操作，减少污染，试验中采用根作为外植体诱导愈伤组织和诱导分化试验。

所取外植体的大小为5mm左右，不宜过大或过小。

滴落种子形成的两条直线位于平皿的上半部，可以避免伸长的根被培养基中渗出的水分所淹。无菌苗的苗龄太短不易得到足够多的外植体，苗龄太长则外植体脱分化的时间明显延长，最适苗龄以2 --3 周为宜。

六、胚性和非胚性愈伤组织的诱导

1、以MS 为诱导培养基, 附加2, 4一D 2mg/L,KT、NAA各0.5mg/L,水解酪蛋白300mg/L，6%蔗糖，0.7琼脂，PH5.8

2、接种幼穗长度为1--2cm 左右, 置于2 8 ℃恒温箱内暗培养。

形态鉴定：幼穗接种后, 一星期左右开始长出愈伤组织。将其置于解剖镜下观察可以

发现两种不同类型的愈伤组织。一类质地紧密, 有光泽, 乳白色或浅黄色,愈伤组织表面有许多光滑的球形突起, 呈颗粒状。每个球状体用镊子很易从愈伤组织上分离下来。这种愈伤组织被认为是胚性愈伤组织。另一类质地疏松且湿软, 常伴有粘液物质, 没有光泽, 黄色至褐色, 此类愈伤组织没有一定的形态结构。（栽培稻）

NB培养基可明显提高拟南芥的愈伤组织出愈率，且以NB培养基为基础配以2，4一D 2．0 mg／L和6一BA 1．0 mg／L时，拟南芥的愈伤组织生长状态最好。

MS+ 2, 4",D 0. 5 mg/ L+ 6",BA 0. 3 mg/ L, 诱导率达87. 5%, 且愈伤组织生长较好。培养基中添加5 g/ L 活性炭能有效地抑制外植体褐化。

MS培养基对籼稻种胚愈伤的诱导培养效果较好, NB培养基则更适合粳稻种胚愈伤的诱导培养。诱导继代培养基为NB( N6培养基的大量元素,B5培养基的微量元素和有机物)、MS和LS基本培养基, 辅加2, 4- D( 2.5mg /L ), 6- BA( 0.5mg /L ), 30 g /L蔗糖, 10 g / L琼脂或3 g / L 植物胶。

BA对于愈伤组织诱导不可缺少，但其浓度太高易产生玻璃化；NAA单独使用利于生根，配合6一BA使用利于分化芽；获得最适愈伤组织诱导培养基为Ms+O．50 mg／L 6-BA+0．10me,／L NAA，愈伤组织诱导率可达100％。

NB培养基 用途：用于植物组织培养 配方：（mg/L） 硝酸钾(KNO3) 硫酸铵((NH4)2SO4) 氯化钙(CaCl2·2H2O) 磷酸二氢钾(KH2PO4) 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 硼酸(H3BO3) 硫酸锰(MnSO4·4H2O) 硫酸锌(ZnSO4·7H2O) 钼酸钠(Na2MoO4·2H2O) 硫酸铜(CuSO4·5H2O) 氯化钴(CoCl2·6H2O) 碘化钾(KI)

2830 463

166 400 185 3

10 2 0.25 0.025 0.025 0.75 27.85 100

10 （最后加） 1 1

乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA) 37.25 硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) 肌醇(Myo-inositol)

盐酸硫胺素(Thiamin HCl/VB1) 盐酸吡哆醇(Pyridoxin HCl/VB6) 烟酸(Nicotinic acid/VB5)

水解罗蛋白（VB1 MW337.3) 300 谷氨酰胺 500 脯氨酸 500 PH 5.8 蔗糖 30000

。

方法一：可以用5%的次氯酸钠溶液进行表面消毒（添加0.1%的TritonX-100，效果会更好。）。 Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 是一种非离子型表面活性剂（或称去污剂）。分子量为646.86（C34H62O11）。它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。免疫细胞化学中Triton X-100常用浓度为1%和0.3%，其中1%的Triton X-100常用于漂洗组织标本，0.3%的Triton X-100则常用于稀释血清，0.1%的Triton X-100常用于LAMP（环介导等温扩增），配制BSA等。但通常是先配制成30%的Triton X-100储备液，临用时稀释至所需浓度。

方法二：在1.5ml ep管中放<50ul的种子，＋1ml 0.1%升汞，加一滴吐温20，脱色摇床5min，种子快速离心下来，用无菌水洗涤种子4－6遍，播种于ms培养基上 。

方法三：1、拟南芥种子在8% NaClO（95％乙醇稀释 V/V）的溶液中表面灭菌5-10min（如果种子多，可分几个管），期间不断震荡，使种子充分接触灭菌液体如果种子很少，就少洗几分钟）。2、吸除灭菌液，加入1ml 95%乙醇，颠倒震荡2min，重复5-6次，洗净种子表面残留的NaClO溶液。3、吸除洗涤液，在超净台上挥发掉残留的乙醇，将种子吹干后，盖好管盖，封口备用。

方法四：取少量种子放入1.5mlEP管，加75%酒精+0.05吐温20 1ml 300rpm 于37度摇床摇10min，用枪吸去乙醇，加95%乙醇1ml,吸去，重复此步骤2-3次，加300uL无水乙醇，迅速吸出放在灭好的滤纸上晾干。

一、培养基

一种拟南芥的培养方法，包括以下步骤：１）对种子进行灭菌，然后将种子在２－４℃、湿润，黑暗条件下春化处理１－３天；２）将经灭菌的培养基质装到经灭菌的培养盆中，然后将培养盆放在盛有水的托盘中，静置１２－２４小时后将托盘中多余的水分倒出，将经步骤１）处理的种子播到基质表面；３）将播种后的培养盆连同底部托盘置于经灭菌的人工气候箱中，调节人工气候培养箱的环境因子控制器，使光周期为１５－１７小时光照，７－９小时黑暗；光强为３００－４００μｍｏｌ ｍ↑［－２］ｓ↑［－１］；光照条件下的温度为２２－２４℃，相对湿度为７０－９０％；黑暗条件下的温度为１８－２０℃，相对湿度大于９０％，经培育得到拟南芥植株。

外植体是指植物组织培养中的各种接种材料。包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质体等。在操作时，最好将取材植株放在室内或较为清洁的环境中生长一段时间，不要使植株遭受雨淋，应避免用喷水的方法给植株供水。否则当水分蒸发后，所遗留的钙斑有时会将细菌等微生物覆盖，在给外植体消毒时，这些细菌由于包埋在钙斑中难以被杀死。随着培养的进行，这些细菌有时会从破碎的钙斑时进入培养基，从而给以后的培养埋下隐患。

无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，以提高成功的几率，增加其实用价值。 1.选择健壮的植株

组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功。此现象可能是由于外植体内部的植物激素水平能够在接种后得以维持所致。 2.选择最适的时期

组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和植物的生长发育阶段。一般进行快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，如选取茎尖，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高，携带细菌数量较少，在器官建成上也更为容易，因此是花卉组织培养中经常采用的部位。此外，嫩叶、花蕾等携菌量较少，容易形成愈伤组织。相比之下，生长时间较长的块茎、鳞茎、球茎等，往往由于携菌量较多，不易消毒而难以培养成功。花药培养应在花粉发育到单核期时取材，这时比较容易形成愈伤组

织。

3.选取适宜的大小

建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在养或脱毒培养的材料，则应更小。

1、实验所使用的器材必须要严格灭菌，注意无菌操作，避免因染菌导致实验失败； 2、配制贮存母液时，要算好各种成分逐次加入，等第一种成分完全溶解后再加入第二种成分，切忌“一锅煮”。有机物质和铁盐溶液配好以后要装入棕色瓶放入电冰箱内保存，其它两种种母液可在常温下保存但最多不能超过一个月；3、pH值对培养基的硬度有影响，pH过高培养基变硬，pH过低培养基不能凝固，所以要调整好培养基的pH值；4、材料脱毒时不要在酒精中停留过长时间，以免材料被杀死。

Columbia型拟南芥愈伤组织培养研究

Columbia哥伦比亚型

选取Columbia型拟南芥种子，在超净工作台内，用无菌蒸馏水浸泡1 min，然后用80％乙醇消毒90s，最后用无菌蒸馏水冲洗3～5次备用。

采用在培养基中添加适量的维生素C、活性炭、GA。和ABA等物质，能抑制酶的活性，减轻褐变的程度，提高愈伤组织的产物质量?。特别是ABA在很入程度上限制了酚类物质的活性，减轻了褐变，并且提供了生长调节物质和碳源，促进了愈伤组织的生长。

Landersberg 生态型拟南芥愈伤组织的诱导和植株再生体系的研究

B5 + 5 mg／L2 ，4-D+ 0 .5 mg／L KT 培养基上诱导愈伤组织,莲座叶作外植体出愈慢，出愈率低，愈伤组织质量较差；叶柄、下胚轴和根作外植体出愈快，且愈伤组织质量好，后期易分化。根外植体在MS+ 5 mg／L KT+ 0 .1 mg／LI AA 配方的出芽诱导培养基上诱导2 !3 周后，愈伤组织能有效分化出芽，分化率达100 。分化出的芽移至MS+ 2 mg／L NAA 培养基上竖直培养，2周左右诱导分化出根，然后移至MS 培养基上开花结果。 种子消毒

将拟南芥种子置于1 .5 ml eppendorf 管(微量离心管)中，加入1 ml 蒸馏水，4C春化3 d，70 %（v／v ）乙醇1mi n、7 %（v／v ）次氯酸钠10 mi n 浸泡消毒，并用无菌水冲洗5 次。 拟南芥无菌苗的生长

拟南芥种子消毒后，用移液枪吸取拟南芥种子和水的混合物，均匀地在MS 生长培养基的培 养皿平板上滴落，并使之形成两条平行的直线。在超净台上吹干水分，移入光照培养间（光强平均6 000 lx ）并竖直放置。由于根的向地性，根会沿着琼脂表面竖直向下生长，而茎则竖直向上生长，这样便于收集得到各个部分的外植体，特别是根。 愈伤组织的诱导

用剪刀分别剪取生长2 周的拟南芥的莲座叶、叶柄、下胚轴和根作为外植体诱导愈伤组织，每个愈伤组织诱导培养基平板上（9 cm 培养皿）均匀放置10 !12 个外植体，并与培养基良好接触。愈伤组织诱导培养基配方为B5 + 5 mg／L2 ，4-D+ 0 .5 mg／L KT。 根的诱导分化

由于叶柄、下胚轴相对较短，难于收集，为了便于操作，减少污染，试验中采用根作为外植体诱导愈伤组织和诱导分化试验。

在制作生根诱导培养基（MS + 2 mg／LNAA）平板时，使之成为一个斜面，诱导根分化时竖直放置，较厚的一边向下。切下已分化的芽转入生根诱导培养基，芽排成一条横线竖直放置于培养基表面并使之与培养基良好接触。 无菌苗的生长

滴落种子形成的两条直线位于平皿的上半部，可以避免伸长的根被培养基中渗出的水分所

淹。试验过程中发现，无菌苗的苗龄太短不易得到足够多的外植体，苗龄太长则外植体脱分化的时间明显延长，最适苗龄以2 !3 周为宜。 芽的诱导分化

愈伤组织每周继代1 次。据观察，生长3 周以上的愈伤组织不同程度的呈现黄褐色，均不能诱导出芽，而生长1 !2 周的愈伤组织却可以很好的诱导分化。因此，转入分化培养基之前，愈伤组织的生长时间不能超过2 周。

拟南芥Atsuc2突变体愈伤组织的诱导及再生体系的建立

诱导愈伤组织的最佳外植体为具柄叶切片，其在B。+3．0mg／L2，4一D+0．5 mg／L KT的培养基上愈伤组织出现的时间最早，质量最好；产生的愈伤组织在配方为MS+2．0 mg／L 6一BA+0．1 rag／L IBA的生芽培养基上被诱导生芽，分化率可以达到86．7％；在配方为MS+1．0mg／L IBA+0．1mg／I。6一BA的生根培养基上丛生芽生根率为85．3％。

将野生型拟南芥种子(Ws和Col生态型)，置于1．5mL离心管中，依次用70％的酒精表面消毒5min后，经灭菌的dd H20(含0．1960 Tween)冲洗2遍，再用2．6％的NaCIO消毒10min，最后用灭菌的dd H20(含0．1％oTween)清洗5．8遍，均匀平铺于1／2 MS培养基上(培养基配方见2．2．4)。在4\冰箱黑暗放置三天后，置于光照培养箱(型号：GXZ．500C；培养光照条件为16小时光照，8小时黑暗，培养温度为22℃中竖直培养。3天后即可取材用于器官离体再生实验。

在培养皿中春花处理后的种子在光照条件下萌发5天后，在超净工作台中，用镊子将苗移栽到装有1／2 MS培养基的50ml三角瓶中，于短日照条件下培养30天左右获得无菌苗。短日照光照条件8小时光照，16小时黑暗，长日照光照条件为16小时光照，8小时黑暗，培养温度均为22℃。

将种子放于4℃冰箱内春化3—4 d。在．180 mill直径的培养皿中平铺约2--13m厚的蛭石，用自来水浸湿。上面覆盖l张160 nlm直径的滤纸。用1 IIll的播种枪在滤纸上播种。播种完毕后盖上培养皿的盖子。放在4℃条件下处理4 d。然后转移到22℃条件下，光照条件为：光照16 h，暗处理8 h。生长7～10 d即可对种子的发芽率进行统计。在白色的滤纸上，无论是发芽的幼苗还是没有发芽的种子，都可以非常清楚地看到。

取野生型拟南芥种子放人离心管内，75％乙醇清洗后，无菌蒸馏水清洗1—2次，转入无菌离心管；5％次氯酸钠溶液浸泡5—6 min，用无菌蒸馏水清洗3～4次，加入1 ml无菌水，用移液枪接人MS+30舄／L蔗糖的固体培养基；25℃、16／8 h灯暗周期下培养，待其萌发生长至2—3 cm时，取出拟南芥植株，转入MS+30 g／L蔗糖的固体培养基，每瓶4—6株无菌苗的种植密度；培养室内温度22—25℃，光照强度l 500—2 0120 Ix，待其无菌苗生长7 d、拟南芥莲座叶生长完全、植株开始抽薹时,取其叶片作为外植体进行诱导分化培养。

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