我国凝乳酶的研究进展

我国凝乳酶的研究进展

凝乳酶（Chymosin）,一种酸性蛋白酶，能够促使乳内蛋白质凝聚形成乳酪。在生产过程中，凝乳酶是生产干酪的一种不可缺少的酶制剂，主要来源为未断奶的小牛胃粘膜。凝乳酶的主要作用是使原奶凝结，给乳清排出提供一定的条件。在凝乳酶作用下形成的乳酪易被各种蛋白质酶消化，因此凝乳酶只是提高酶效率，在实际运用中，并不能算酶。由于随着生产的发展，传统来源的凝乳酶已经越来越不能满足社会需要，通过科学技术手段寻求其替代品，寻找凝乳活力高，蛋白水解活力低的凝乳酶。通过研究凝乳酶发酵生产及分离纯化，使凝乳酶回收率达到最优。

1. 凝乳酶的简介

1.1凝乳酶的结构及其活力

凝乳酶是以无活性的酶原分泌到胃里，凝乳酶原含365个氨基酶，在酸性条件下形成有活性、成熟的凝乳酶，与天冬氨酸蛋白酶有高度同源性，能够专一地切割κ酪蛋白的Phe105-Met106之间的肽键，从而使牛奶凝集[1]。凝乳酶没有绝对的活力单位，是以一定的凝乳酶稀释液，在特定条件下，将一定量牛乳凝固所需时间为标准，牛乳凝固时间不相同，因此很难标准化[2]。 1.2凝乳酶的作用

原奶在凝乳酶作用下凝结，主要是因为酪蛋白发生变化。一般酪蛋白可分为α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。κ-酪蛋白的作用可以保护蛋白质胶体不发生凝固，在凝乳酶作用下，κ-酪蛋白会水解成副κ-酪蛋白，同时释放相对分子量大约为6000-8000的可溶性糖肽。而副κ-酪蛋白则可以和Ca2+结合凝固，α-酪蛋白和β-酪蛋白对Ca2+本身不稳定，同时有失去了κ-酪蛋白的保护作用，因此一起凝固形成奶酪。

在干酪生产中，凝乳酶是起着凝乳作用的关键性酶，其传统来源是从小牛皱胃中提取，即皱胃酶[3]。随着干酪生产的需要，不得不促使人们寻找其他凝乳酶来替代其传统来源。目前已从动物、植物、微生物和基因工程等方面着手，来寻找传统凝乳酶的替代品。但是由于高蛋白水解作用是细菌来源的凝乳酶成为商品凝乳酶的主要障碍，因此凝乳酶活力高，蛋白水解活力低的细菌凝乳酶也将成为传统凝乳酶的替代品，在工业化生产中将脱颖而出。另外，凝乳酶在医药领域也具有良好的作用和功能，例如凝乳酶的分泌有助于移植血管和PTCA后血管增殖，用于治疗腰椎间盘突出，但有可能造成过敏反应等，治疗胃病，如萎缩性胃炎, 浅表性胃炎和各种慢性胃炎等方面都有较好的体现。工业上，凝乳酶干酪素由于具有良好的染色附着力和抗挤压力强，可以作为添加剂用在塑料工业上[4]。 1.3凝乳酶活性的影响因素

凝乳酶作为一种酶，因此能影响酶活性的各项因素肯定能影响牛乳的凝固。这些因素包括PH值、温度、Ca2+浓度、底物浓度和负离子基团等其他因素[1]。凝乳酶作为酸性蛋白酶，因此最佳PH值应当为4.8左右，乳温在30-33℃时，凝乳酶活性最佳，Ca2+浓度的增加会减少凝乳时间，但增加乳块的硬度，而底物浓度的增加则会促使酶促反应速率，其他一些离子对凝乳酶的作用则会有促进或抑制作用。起促进作用的离子有Na2+、Fe2+和EDTA等，抑制作用明显的有Mg2+、Cu2+和Ba2+等。

2. 凝乳酶的发酵生产工艺

通过细胞各种生命活动合成酶的过程称之为酶的生物合成[5]。酶的生物合成法分为多种，根据使用细胞种类的不同，可分为植物细胞培养产酶、动物细胞培养产酶和微生物发酵产酶。在酶的生产过程中，第一要有优质的产酶细胞，第二要有适宜的培养基和培养条件，通过细胞的生命活动合成各种各样的酶。目前，由于微生物的生长周期短，产量大等优势，微生物细胞发酵产酶已经被广泛运用[6]。 2.1产酶细胞及培养基的选择

目前，在工业上运用的产凝乳酶微生物主要有米黑毛霉、粟疫霉和微小毛霉[7]和酵母等真菌发酵生产酶。与丝状真菌比较，细菌具有的特点主要有体积小，生长周期短，成本低且发酵产物容易提取，可以在人工控制的条件下生产，较方便[8]。但由于微生物凝乳酶蛋白质水解活力大，因此在产酶细胞研究上，基因工程将成为理想途径。刘振民等[9]将主要菌系为根霉的酒药作为分离源，利用酪蛋白平板初筛，霉菌完全培养基、霉菌基本培养基和土豆汁等多种培养基摇瓶复筛，以发酵凝乳酶酶活作为指标筛选出凝乳酶高产菌株。孙健等[10]以产酶量较高的总状毛霉为出发菌株，以Co60释放的γ射线为诱变剂，对总状毛霉进行不同剂量照射，筛选到一株变异菌株R132，凝乳活力提高了80%。

微生物培养基主要分为两种，一种用于微生物培养，另一种则用于发酵生产。培养基的基本成分主要包括碳源、氮源、无机盐、生长因子和水分等。但是对于不同微生物生产凝乳酶，所运用的培养基必定不同，必须根据实际条件对培养基进行优化选择。程巧玲等[11]的研究表明，影响霉菌产凝乳酶的主要因素包括葡萄糖，Na2SO4和吐温-80，但培养基液固比为0.9:1，CaSO40.04%，葡萄糖2.8%，Na2SO40.031%，吐温-80为0.34%时，为培养基最优成分。张丽红[12]等利用响应面法优化微小毛酶的发酵培养基，研究发现CaCl2浓度，葡萄糖浓度和乳清粉浓度均能影响微小毛酶发酵制取凝乳酶，其中CaCl2浓度影响凝乳酶活力大于葡萄糖浓度，乳清粉浓度影响最小。 2.2发酵工艺条件优化

在微生物发酵产酶过程中，除了对性能优良的产酶细胞的选择和适宜培养基的配制外，还需对发酵产酶工艺条件的优化，例如PH、温度和溶解氧等，从而满足细胞生长、繁殖与产酶的需要，使凝乳酶活力达到最优。

李建涛等[13]通过单因素和正交试验对解淀粉芽孢杆菌产凝乳酶发酵条件的研究发现，培养温度、摇床转速、发酵时间和培养基初始PH等均能影响凝乳酶活力，但摇床转速影响最大，而培养基初始PH则影响较少。由此可以说明在发酵过程中需要严格控制摇床转速，使凝乳酶活力达到最优。丁明亮等[8]对枯草芽孢杆菌研究，通过单因素实验和响应曲面法研究表明，葡萄糖添加量，装料液量和接种量均能影响产酶。葡萄糖浓度若过高，则可能会影响培养基中的营养平衡，并发生钝化作用。而装料液量则影响的是发酵液中溶解氧的浓度，不同菌种在不同发酵阶段的需氧量，溶解氧浓度与细胞生产能力之间有着不可忽视的关系。接种量的多少就会影响发酵时间，过少将不利于产酶，过多则会产生营养不足，也不利于产酶。

除优化工艺条件外，还可以通过其他一些有效措施提供产酶量，如添加诱导物，控制阻遏物浓度，添加表明活性剂和添加产酶促进剂等都可以增加产酶量。在发酵生产酶的过程中，通过研究酶发酵动力学，对于了解酶的生物合成模式，优化发酵工艺条件，提高酶产率方面都有重要意义。对于胞外酶的研究，固定化微生物细胞发酵产酶方面已经取得成功，可以通过研究，尝试运用固定化细胞发酵生产凝乳酶。 2.3凝乳酶发酵工艺流程

细胞筛选 细胞保藏 细胞活化 细胞扩大培养 培养基 产酶 米黑毛霉粟疫霉酵母无菌空气 碳源氮源无机盐生长因子 有机溶剂沉淀法 分离纯化 离子交换树脂 3. 凝乳酶的提取、分离与纯化

通过各种细胞生命活动合成的酶，需要经过提取、分离与纯化等一系列步骤方可成为酶制品。酶的提取、分离与纯化是在一定条件下将酶从细胞或者其他含酶的原料溶解到溶液中，然后与杂质分离，从而得到所需的酶制剂的过程。酶的提取是在一定条件下，用适宜的溶剂或溶液处理含酶原料，从而是酶充分溶解到溶剂或溶液中，亦称之为酶的抽提。酶的提取方法一般有盐溶液提取、酸或碱溶液提取和有机溶剂提取。对于凝乳酶的提取，一般运用有机溶剂提取。分离方法有沉淀分离、离心分离、过滤与膜分离、层析分离、电泳分离和萃取分离。

酶的分离纯化大约可以分为是三个阶段：粗蛋白质分离，大多使用盐析沉淀法，可以粗略去除蛋白质以外的物质，得到出蛋白质；部分纯化，运用各种层析法，对粗蛋白质进行初步纯化；最后均质酶，对目标酶进行进一步的精制和纯化，可以运用制备式电泳或高效液相色谱等。

我国在凝乳酶的分离纯化方面目前几乎是一片空白，药用产品则几乎依赖于进口，因此就目前为止，寻求一种简单有效，适用于工业化生产方面的分离纯化方法一直成为科研工作者的研究热点。潘道东[14]等采用70%乙醇对凝乳酶进行粗提，使凝乳酶回收率达到52.65%，又用DE-52阴离子交换树脂和Sephdex G-75凝胶柱进行分离纯化，经过冷冻干燥形成凝乳酶粉，凝乳酶粉其活力达到1813.74U/mg，回收率为11.25%。研究过程中发现，凝乳酶回收率随乙醇体积分数呈现先增加后减少趋势，在70%时达到回收率最优，当超过70%时，会沉淀较多杂蛋白，不利于后续操作。王景会等[15]用80%饱和度的硫酸铵酵母培养液，将沉淀物溶于磷酸钠缓冲液中得到粗酶液，然后在Sephadex G-75柱上洗脱，用DEAE-52离子交换柱分离纯化，重组凝乳酶从发酵液到最终纯化产物，酶比活力提高了近2倍，由最初的855.34U/mg到纯化后的1707.84U/mg。邓静等人[16]将木瓜蛋白凝乳酶粗酶溶解后，直接用于离子交换柱层析。将粗酶溶于EDTA溶液，经Maer-preg High S Support离子交换层析，得到木瓜凝乳蛋白酶。该方法操作步骤简单，结果比较稳定，而且重现性好，较适合大规模分离纯化木瓜凝乳蛋白酶。姜铁民等[17]采用纤维素离子交换柱从江米酒中分离纯化得到单一蛋白酶，该酶凝乳活力与蛋白酶水解活力的比值提高到了16.0，是之前的5倍之多。先经乙醇沉淀浓缩得到粗酶液，然后经纤维素离子交换树脂。通过该方法分离纯化的凝乳酶其凝乳活力与蛋白水解活力比值高，有望成为传统小牛凝乳酶的替代品。

凝乳酶

4. 小结

凝乳酶一种酸性蛋白酶，能够促使乳内蛋白质凝聚形成乳酪，在生产过程中，凝乳酶是生产干酪的一种不可缺少的酶制剂，被广泛用于乳酪制造业。随着我国改革开放的不断深入和社会主义事业的快速发展,，人民生活水平已大幅度提高，人均生活逐渐步入小康社会，因此对干酪的需求量将逐渐增加。但由于在凝乳酶作用下形成的乳酪易被各种蛋白质酶消化，因此凝乳酶只是提高酶效率，在实际运用中传统凝乳酶效率使用不高，而且我国凝乳酶还没有产业化，因此对凝乳酶性质及其替代品的研究具有重大意义，发展前景广阔。由于传统凝乳酶的来源主要是未断奶的小牛胃粘膜，在其他动物中找到的凝乳酶出品率差，效果不好，因此寻找凝乳酶的替代品已经是迫在眉睫的事。从分离纯化各个方面研究，提高凝乳酶的出品率，需要科学工作者的艰辛努力和不断探索。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/6lr7.html