动物细胞工程实验指导

实验时间 4月11日 4月18日 4月25日 实验内容 实验一 培养用液的配制、除菌与分装 实验二 细胞的传代培养 实验三 鱼类细胞原代培养（组织块法）（1-5组）401 实验四 染色体制备（6-10组）301 5月2日 实验三 鱼类细胞原代培养（组织块法）（6-10组）401 实验四 染色体制备（1-5组）301 5月9日 实验五 细胞的复苏与冻存

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实验一 培养用液的配制、除菌与分装

【实验目的】

1. 掌握常见培养用液的配制方法。 2. 掌握常用的灭菌方法。 3. 了解每种培养用液的作用。

【实验原理】

常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和EDTA溶液。PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和 EDTA。培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM 和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。EDTA 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。

细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS和EDTA可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。

【试剂、材料与仪器】

试剂：NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，EDTA，胰蛋白酶，HEPES，碳酸氢钠，盐酸，MEM或PRMI-1640培养基干粉，GPS

材料：三蒸水，蒸馏水瓶，药匙，称量纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH试纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），移液管（5 mL、10 mL），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，已高压灭菌试剂瓶（500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，封口膜

仪器：精密天平，高压灭菌锅，超净工作台，加液枪，4℃冰箱

【实验分组】

实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。配制PBS并高压灭菌，配制胰蛋白酶溶液并过滤除菌和分装，配制EDTA溶液高压灭菌并分装，配制培养基，过滤除菌培养基并分装。

每个实验小组需准备试剂有：胰酶 50 mL；EDTA 50 mL；培养基90 mL（使用前加入10 mL血清）。

【实验步骤】

1．PBS（1000mL）的配制

分别称取NaCl 8g；KCl 0.2g；Na2HPO4·12H2O 2.9g ；KH2PO4 0.2g于烧杯，加入800 mL三蒸水，玻棒搅动充分溶解后，倒入1000mL容量瓶中，用三蒸水定容至刻度。PBS用于2胰蛋白酶溶液和3 EDTA溶液的配制，余下高压灭菌备用。

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2．胰蛋白酶溶液（0.25%）的配制、除菌与分装

称取0.625g胰蛋白酶于250 mL烧杯，加入1配制的PBS 200 mL，玻棒搅拌充分溶解后，倒入250 mL容量瓶中，用PBS定容至刻度。拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5个试剂瓶（100 mL），每瓶50 mL。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4 ℃冰箱保存备用。标签上标明：0.25%胰蛋白酶液、配制日期、以及组号与组长姓名。

3．EDTA（0.2％）的配制、除菌与分装

称取0.5 g EDTA 于250 mL烧杯，加入1配制的PBS 200 mL，溶解时加少量NaHCO3，调整pH为8.0，玻棒搅拌使EDTA充分溶解。再用 PBS定容到250 mL容量瓶里，终浓度为0.2%，用浓盐酸，调pH为7.2-7.4。装于250 mL试剂瓶中，高压灭菌备用。

在超净工作台内，将已灭菌的EDTA溶液分装至5个无菌试剂瓶（100 mL），每瓶50 mL。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4 ℃冰箱保存备用。标签上标明：0.2% EDTA、配制日期、以及组号与组长姓名。 4．培养基的配制、除菌与分装

将培养基干粉（MEM或PRMI-1640）倒入1000 mL烧杯，加800mL三蒸水，玻棒搅拌充分溶解；再加入加1.8g HEPES和2.2g碳酸氢钠，玻棒搅拌充分溶解，溶液呈橙色（弱酸性，pH在7.0左右）；再倒入1000 mL容量瓶，用三蒸水定容至刻度。

工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。在超净工作台中摆放好试剂瓶和滤器。

将培养液拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5个无菌试剂瓶（100 mL），每瓶90 mL，余下装入500 mL无菌试剂瓶，每瓶内需加入无菌的GPS（谷氨酰胺-青霉素-链霉素），轻轻摇匀，使之终浓度为1%。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4 ℃冰箱保存备用。标签上标明：MEM或PRMI-1640、配制日期、以及组号与组长姓名。

用于细胞培养时，培养基内需要加入血清，生长培养基内血清浓度为10%。

【注意事项】

1. 滤过除菌时，将容量瓶内的液体倒入烧杯内，再拿到超净台里，采用一次性滤器或是

抽滤法除菌。

2. 培养基中的抗生素可在配置时加入青霉素和链霉素的粉末，也可在过滤除菌后加入无

菌的液体，终浓度为100 U/mL 青霉素和100 μg/mL链霉素。

【思考题】

1. 配制细胞生长培养液时，需要添加哪些物质，为什么？如何调节培养液的pH？ 2. 生长培养基中的血清一般在什么时候添加，为什么？ 3. 细胞培养中的各种试剂的灭菌和除菌方法有哪些，如何使用？

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实验二 细胞的传代培养

【实验目的】

1. 掌握贴壁细胞换液和细胞传代的方法。 2. 了解细胞传代培养的意义。

【实验原理】

细胞在培养瓶里的生长，分为贴壁生长和悬浮生长。贴壁生长细胞在培养瓶中生长数天后，就会在培养瓶底部长满，如果不进行处理，就会继续生长而产生堆积，最后因缺乏营养供给而死亡。因此当细胞生长贴满瓶底时，就需要将细胞消化下来，并接种成多瓶细胞，使细胞继续生长。这一处理接种的过程就叫传代，每接种一次就叫做传一代。细胞传代培养使得细胞增殖，可获得大量细胞供实验所需。传代培养是组织培养常规保种方法之一，是几乎所有细胞生物学实验的基础。接种后的细胞放在培养箱里静置培养，培养的温度视动物种类而定。一般，温水性鱼类细胞的最适培养温度为25-28℃，冷水鱼类细胞为15-20℃，水生哺乳动物细胞为37℃。

细胞培养过程中常出现培养基营养缺乏、代谢产物增多、变酸等不适宜细胞生长因素，而此时细胞还未生长达到饱和密度（没有贴满底部），仍需继续培养，因而需要更新营养液来更新营养成分，以满足细胞继续生长繁殖的需要，这一过程叫换液。单纯换液不需要接种细胞。

【试剂、材料与仪器】

试剂：生长培养基（PRMI-1640或 MEM，添加10% 小牛血清或胎牛血清），0.25% 胰蛋白酶，0.2% EDTA

材料：细胞培养瓶，移液管（5 mL、10 mL），无菌离心管，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，记号笔，橡胶手套，封口膜

仪器：生化培养箱或CO2培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，4℃冰箱

【实验分组】

实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。

【实验步骤】

工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。在超净工作台中摆放好移液管、离心管和培养瓶等。

1． 观察细胞：倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代，当细胞长满瓶底时

可以传代；

2． 超净工作台准备：将试剂瓶、培养瓶等培养用具用酒精喷洒，用消毒纱布擦净，置于

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超净工作台酒精灯左侧；

3． 开盖：旋开细胞培养瓶瓶盖，将瓶盖侧立于（严禁倒扣放置）酒精灯旁，将培养瓶内

液体（旧培养基）倒入15 mL离心管，3000 rpm/min 离心5 min 备用。培养瓶瓶口、瓶盖以及离心管管口、管盖均需过酒精灯火焰后再盖好；

4． 清洗细胞表面：打开移液管盒，用普镊捏住移液管（5mL）后部从盒子中拖出（注意

移液管的管壁和管口不能碰到其他物品），安装好加液枪，移液管管口和管壁均过酒精灯火焰。酌情吸取 2-4 mL EDTA溶液，清洗细胞表面，去掉残留的旧培养基以及漂浮的死细胞，再倒弃EDTA溶液；

5． 胰酶消化：用移液管吸取2 mL 胰蛋白酶，从培养瓶侧面加入细胞培养瓶内，盖好瓶

盖后，在倒置显微镜下观察，当80%的细胞收回突起变圆时，立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶；

6． 中和消化：用移液管吸取旧培养基上清液3 mL（也可用新鲜生长培养基），加入细胞

培养瓶中，终止胰酶消化，并反复轻轻吹打消化好的细胞使其脱离瓶壁并分散； 7． 沉淀细胞：将细胞悬液吸入15 mL的离心管中，1000 rpm/min离心8分钟，获得细胞

沉淀；

8． 加入新鲜培养基：倒弃上清液，保留细胞沉淀（注意只能倒一次，不能反复倒），然后

用另一新移液管吸取10 mL的新鲜培养基加入培养瓶中5mL，余下5mL加入离心管内悬浮细胞沉淀，吸取离心管中的细胞悬液加入细胞培养瓶中，与另外5mL培养基混匀； 9． 接种细胞：吸取5 mL上述的细胞悬液，加入另一个新细胞培养瓶中，接种后2个培养瓶中

的悬液各5 mL；

10. 静置培养：盖上瓶盖，拧紧，标记（包括细胞名称、代数、传代日期），放入常规的生

化培养箱静置培养（如果放入CO2培养箱，瓶盖拧紧后再稍回转）； 11. 观察细胞：每天观察细胞生长状况，并确定是否进行第2代的传代。

【注意事项】

1. 传代培养时要注意无菌操作，所有操作要尽量靠近酒精灯火焰，手不能在瓶口上方操

作，以免污染气体进入瓶内。要防止细胞之间的交叉污染，每次最好只进行一种细胞的操作，每一种细胞使用一套器材。每种试剂使用一个移液管，培养用液要严格分开。 2. 坚持每天观察细胞，生长致密时即可传代。如发现有污染迹象，应丢弃污染的细胞。 3. 细胞消化时要注意观察，不要消化过度，否则细胞不宜存活。吹打细胞时，确保瓶壁

所有地方均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，以防细胞破碎。 4. 培养箱不要反复多次开关，以免影响温度的稳定和增加污染的机率。

【思考题】

1. 贴壁细胞的传代培养方法及注意事项。

2. 常用的细胞消化液有哪些？ 各种消化液的作用原理分别是什么？ 3. 悬浮生长的细胞如何传代培养？

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【注意事项】

1. 细胞复苏时，注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动冷冻管，使之尽快通过最易受

损的温度段（-5～0℃）。这样复苏的冻存细胞存活率高，细胞生长及形态良好。 2. 由于冻存的细胞中会有部分细胞死亡，静置培养24小时后，可将不贴壁、飘浮在培养

液上的死细胞弃去，更换新鲜培养液。

3. 如果冻存的细胞保存时间较长或之前细胞复苏时，细胞存活率不高，可以直接在培养

瓶内加入冻存管内的细胞悬液和5 mL的新鲜培养基，静置培养10-12h后，更换新鲜培养基。

【思考题】

1． 复苏细胞时，为什么要快速融化？

2． 如果冻存管内的细胞密度偏低，复苏时如何处理？

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实验六 染色体制备

【实验目的】

1. 掌握培养细胞的染色体的制备方法 2. 熟悉细胞染色体制备的原理

【实验原理】

每一物种的细胞一般都具有一定数目、形状和大小的染色体。在秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在中期，此时染色体形态最典型，然后通过低渗、固定、染色等步骤，便可在显微镜下呈现出其形态。

【试剂、材料与仪器】

试剂：生长培养基（PRMI-1640或 MEM，添加10% 小牛血清或胎牛血清），0.25% 胰蛋白酶，0.2% EDTA，PBS，冰醋酸，甲醇，秋水仙碱，95%乙醇，HCl ，Giemsa染液，双蒸水

材料：细胞培养瓶，移液管（5 mL、10 mL），无菌离心管，载玻片，胶头滴管，染色缸，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，消毒纱布，医用酒精，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜

仪器：生化培养箱或CO2培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，切片烘干机，制冰机，水浴锅

【实验分组】

实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。

【实验步骤】 1. 细胞处理

1) 将细胞接种于2个T 75cm2培养瓶中生长约24 h，形成80%融合的单层细胞； 2) 弃去旧培养基，加入10 mL新鲜含10%血清的生长培养基和0.1 mL秋水仙碱溶液（1

μg/mL，PBS配制），25°C下继续培养13~15 h；

3) 用EDTA和胰蛋白酶消化收集细胞，1000 rpm/min离心5分钟；

4) 收集沉淀细胞，加 2 mL PBS 混匀细胞，移到T 75cm2 的培养瓶，慢慢加10 mL 预

冷的双蒸水（4℃），室温孵育10 min；

5) 慢慢加入10 mL 固定液（现配的冰醋酸：甲醇=1:3），室温放置10 min，移入2个离

心管，每管11 mL，1000 rpm/min离心10 min，弃上清，留约2 mL，再加入3 mL 新鲜固定液，轻轻混匀，1000 rpm/min离心5 min；弃上清，留约 0.5 mL，再加入0.5 mL

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新鲜固定液，轻轻混匀细胞, 然后加4 mL 新鲜固定液，轻轻混匀，室温放置5分钟，1000 rpm/min 离心5分钟；

6) 弃去4.8 mL上清，仅留 0.2 mL，合并两个离心管内的细胞悬液，加入1-1.5 mL 新鲜

固定液，轻轻混匀细胞沉淀。

2. 清洁载玻片和染色准备：

1) 取6-8个干净的载玻片，浸泡在95%乙醇里，烘干，浸泡在冰水里至少 30 min； 2) 把装有1N HCl的染色缸，浸入60℃水浴中加热备用。

3. 滴玻和染色：

1) 用移液管吸取细胞悬液0.2mL，滴在湿载玻片上，火焰上拖动，固定2-3次； 2) 放在预热的切片烘干机上，15 min（蒸发液体）；

3) 把载玻片插入装有1N HCl的染色缸（60℃水浴中）孵育10min，取出载玻片，用双蒸

水清洗玻片2次，空气干燥；

4) 将载玻片浸入Giemsa染液的染色缸中（现稀释1：25），孵育15 min，用双蒸水冲洗

载玻片2-3次，除去残液，空气干燥，于显微镜（Motic BA400）下进行拍照和染色体计数。

【注意事项】

1. 进行染色体制备时，细胞要处于对数生长期，且需用秋水仙碱处理13-15h。

2. 将细胞悬液滴加在载玻片上时，动作要快，载玻片和滴管要呈45度角，保证多数细胞

能破裂。

【思考题】

1. 为什么制备染色体时，要加入秋水仙碱？

2. 制备染色体时，处理细胞时，步骤4中要加入预冷的双蒸水？

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/6let.html