硕士论文--肝靶向阿克拉霉素A固体脂质纳米粒的研究

四川大学

硕士学位论文

肝靶向阿克拉霉素A固体脂质纳米粒的研究

姓名：李素华

申请学位级别：硕士

专业：药剂学

指导教师：蒋学华

20030425

中文摘要

肝靶向阿克拉霉素Ａ固体脂质纳米粒的研究

药剂学专业

硕士研究生李素华导师蒋学华教授

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，在我国，肝癌的死亡率占居民恶性肿瘤死亡率的第二位，严重影响了人们的健康。迄今为止，化学药物疗法仍是治疗肝癌的主要方法之一，抗癌药物肝靶向传输系统为肝癌的药物治疗提供了一种新的思路和给药方法。

本课题以阿克拉霉素Ａ（ＡｃｌａｃｉｎｏｍｙｃｉｎＡ．“ＡＣＭ—Ａ”）为模型药物，以卵磷脂为载体材料，制备阿克拉霉素Ａ固体脂质纳米粒（ＡＣＭ．ＳＬＮ），以期达到提高ＡＣＭ．Ａ抗肝癌效果，降低其毒副作用的目的。并对ＡＣＭ—ＳＬＮ物理化学特性、药剂学特性、体内分布和药动学特征等进行了系统研究。

以ＡＣＭ．ＳＬＮ的粒径及分布、包封率和载药量等为指标，通过单因素试验考察了表面活性剂的种类和用量、搅拌时间、搅拌速度、胆固醇用量、水相体积等因素对ＡＣＭ—ＳＬＮ性质的影响，筛选出了影响ＡＣＭ－ＳＬＮ质量指标的主要因素。并在此基础上，以ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ．６８的浓度、搅拌时间、胆固醇用量和水相体积为考察因素，以ＡＣＭ—ＳＬＮ粒径及分布、包封率、载药量等为评价指标，采用正交设计对处方和制备工艺进行了优化。优化后得到的ＡＣＭ．ＳＬＮ的粒径为６３ｎｍ，包封率为８９．３２％，载药量为４．４７％。优选的制备工艺简单，有利于ＡＣＭ—Ａ的稳定性，包封率高，有利于药物的有效利用。

以外观、色泽、再分散性等为指标，优选了ＡＣＭ．ＳＬＮ冻干针剂的处方和制各工艺，解决了ＡＣＭ．ＳＬＮ物理化学稳定性差、不易久贮和疏水性ＡＣＭ—ＳＬＮ再分散性差等问题。冻干过程不影响ＡＣＭ—ＳＬＮ的稳定性，ＡＣＭ—ＳＬＮ的粒径及分布、包封率、载药量、ｐＨ等其它相关质量指标均未明显改变。吸湿性试验结果表明，ＡＣＭ．ＳＬＮ冻干针剂的临界相对湿度为

中文摘要

７４．０８％。体外释药试验结果表明，ＡＣＭ．ＳＬＮ冻干针剂的释药曲线由一级动力学方程和Ｗｅｉｂｕｌｌ模型拟合较好，具有明显的缓释特征。以ＡＣＭ．ＳＬＮ的粒径及分布、包封率、载药量、ｐＨ值等为质量指标，评价了ＡＣＭ．ＳＬＮ冻于针剂的初步稳定性，结果显示其稳定性良好。

选用小鼠为动物模型，以ＡＣＭ—Ａ溶液剂为对照，研究了ＡＣＭ．ＳＬＮ冻干针剂体内分布过程，探索了ＡＣＭ．ＳＬＮ冻于针剂体内分布的靶向特征。研究结果表明，与ＡＣＭ—Ａ溶液剂比较，ＡＣＭ—ＳＬＮ冻干针剂给药后各时间点肝脏中药物浓度和药物百分比均显著高于同等剂量的ＡＣＭ—Ａ溶液剂给药后同一时间点肝脏中的药物浓度和药物百分比。统计学分析结果表明，ＡＣＭ．ＳＬＮ冻干针剂显著改变了ＡＣＭ—Ａ在小鼠体内的广泛分布行为，显著提高了ＡＣＭ—Ａ在靶器官肝脏中的药物水平。并引入药物靶向指数（ＤｒｕｇＴａｒｇｅｔｉｎｇＩｎｄｅｘ，ＤＴＩ）和药物选择性指数（ＤｒｕｇＳｅｌｅｃｔｉｎｇＩｎｄｅｘ，ＤＳＩ）对ＡＣＭ—ＳＬＮ冻干针剂的肝靶向性进行定量评价，结果给药１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ和６０ｍｉｎ后，ＡＣＭ．ＳＬＮ冻干针剂对于ＡＣＭ．Ａ溶液剂在肝脏中的ＤＴｌ分别为２．８１６、２．５４７和３．００１，ＡＣＭ．ＳＬＮ冻干针剂在肝脏中的ＤＳｌ分别为１６．５７１、３７．９００和８１．９０５，ＡＣＭ—Ａ溶液剂在肝脏中ＤＳｌ分别为３．５０８、９．３３４和１７．４９２。ＡＣＭ．ＳＬＮ冻干针剂较ＡＣＭ—Ａ溶液剂对肝脏靶向性显著提高，达到课题设计要求。

在家兔体内药物动力学研究中，以反相高效液相色谱法分别测定了静脉给予ＡＣＭ．ＳＬＮ冻干针剂和ＡＣＭ－Ａ溶液剂后家兔体内ＡＣＭ—Ａ的药时曲线，用３ｐ８７程序对测定结果进行处理，确定最佳房室模型，求算药动学参数。结果表明，ＡＣＭ．ＳＬＮ冻干针剂和ＡＣＭ—Ａ溶液剂在家兔体内的药物动力学过程均符合二室模型，对主要药动学参数进行统计学检验，结果表明，ｔｍ∥、ＭＲＴ、Ｖ（ｃ）、ＡＵＣ和ＣＬ均有显著性差异。与ＡＣＭ．Ａ溶液剂相比，ＡＣＭ．ＳＬＮ冻干针剂在家兔体内的消除半衰期和滞留时间显著延长，ＡＵＣ显著增高，清除率显著降低，可显著延长药物在体内存留时间，从而延长药物与肝脏肿瘤组织的接触时间，提高ＡＣＭ．Ａ抗肝癌效果。

本文研究结果表明，以卵磷脂为载体材料的ＡＣＭ—ＳＬＮ制备工艺简便可行，重现性好：冻干针剂解决了ＡＣＭ．ＳＬＮ稳定性差、不易久贮和疏水

中文摘耍

性ＡＣＭ—ＳＬＮ在分散性差等问题；ＡＣＭ．ＳＬＮ冻干针剂可显著改变ＡＣＭ．Ａ在动物体内的广泛分布和药物动力学过程，显著增加靶器官肝脏中的药物水平，从而显著提高ＡＣＭ—Ａ的抗肝癌疗效，并降低全身毒副作用，达到了课题预期的肝靶向性目的，为肝癌的临床化学药物治疗提供了一种新思路和新的给药剂型。

以ＡＣＭ—Ａ为模型药物。以卵磷脂为材料的固体脂质纳米粒目前国内外均未见报道。本文研究成果进一步丰富了国内外固体脂质纳米粒的研究内容，促进国内固体脂质纳米粒的发展，为固体腊质纳米粒的工业化生产和早日走向临床创造了良好的条件。

关键词：肝靶向给药系统阿克拉霉素Ａ固体脂质纳米粒

ＥｎｇｌｉｓｈＡｂｓｔｒａｃｔ

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．６．

墨！型！！！墨！！！！！！

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．７．

ＥｎｇｌｉｓｈＡｂｓｔｒａｃｔ

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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌｉｖｅｒ－ｔａｒｇｅｔｅｄｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙｓｙｓｔｅｍａｃｌａｃｉｎｏｍｙｃｉｎＡ

ｓｏｌｉｄｌｉｐｉｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ

．８．

前言

刖舌

癌症是严重危害人类健康的一大类疾病，肝癌是我国最流行的恶性肿瘤之一。除手术切除、放疗外，化学药物疗法也是肝癌治疗的重要手段。目前用于肝癌化疗的主要药物有５一氟尿嘧啶（５－Ｆｕ）、丝列霉素Ｃ（ＭＭＣ）、塞替哌、阿霉素（ＡＤＲ）和表阿霉素（ＥＢＰ）等。但遗憾的是，这些化疗药物在治疗癌症的同时常伴有明显肝功能损伤、腹水、黄疸、明显的骨髓抑制，免疫功能损失等毒副作用，不少患者因肝功能衰竭而死…。因此，如何进一步提高化疗药物的抗肿瘤作用，减少抗癌药物肝功能损伤和全身毒副作用成为提高肝癌患者远期生存率的关键。靶向给药系统（ＴａｒｇｅｔｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ）这一概念的提出，为广大药学研究人员提供了一种改进药物剂型的新手段和新思路，它可克服传统药物和工艺无法解决的难题，从而有希望解决药物无法到达特定的作用靶点，无法在病灶部位形成较高浓度同时不产生全身毒副作用等目前亟待解决的问题。在靶向给药制剂中，纳米粒（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）以其良好的靶向性、稳定性、表面易修饰性、释药的持续性、制备工艺简单等优点而倍受关注【２Ｊ。纳米粒给药后，主要被体内网状内皮细胞丰富的器官如肝、脾、肺等摄取，通过控制其粒径大小可达到不同的靶器官。化疗药物通过药剂学手段制成靶向给药系统后选择性地分布于体内癌变部位，而对非靶细胞、组织或器官等影响很小，从而提高药物抗癌疗效，减少药物的全身毒副作用。

固体脂质纳米粒（ＳｏｌｉｄＬｉｐｉｄＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ＳＬＮ）是近年来发展起来的一种新型靶向给药系统，是以天然或合成的的类脂，如卵磷脂、甘油三酯等为载体，将药物包裹或夹嵌于类脂核中制成粒径为５０．１０００ｎｍ的固体胶粒给药系统。与乳剂、脂质体相似，ＳＬＮ采用生理相容性、耐受性好的类脂材料为载体，可以采用高压乳匀法进行工业化生产；同时，固体载体又使它具有聚合物毫微粒的优点，如可以控制药物的释放、避免药物的降解或泄露以及良好的靶向性等【３’４Ｊ。ＳＬＮ主要用于亲脂性药物，也可用于亲水性药物，也可将亲水性药物通过酯化等方法制成脂容性强的前体药物后，再制各ＳＬＮ。ＳＬＮ的水分散系统可以进行高压灭菌或ｙ辐射灭菌，也可通

前言

过冻干或喷雾干燥制成固体粉末，为ＳＬＮ的工业化生产提供了条件。ＳＬＮ既可用于静脉给药，也可用于口服给药，还可用于局部或眼部给药等１３４］。ＳＬＮ的这些优点使其成为目前靶向给药系统中的一个比较活跃的领域。在制备方法、稳定性、给药途径及体内过程等方面部有比较广泛深入的研究。

阿克拉霉素Ａ（ＡｃｌａｃｉｎｏｍｙｃｉｎＡ，“ＡＣＭ．Ａ”）是第二代葸环类抗癌抗生素，１９７５年由日本学者梅泽滨夫报道【９Ｊ，１９８１年１２月由日本三乐株式会社开发上市。国内由四川抗菌素工业研究所研制，１９９２年被卫生部批准为四类新药，现有冻干针剂一种剂型。药理学研究表明，ＡＣＭ．Ａ对大鼠腹水肝癌ＡＨ４ｌＣ、ＡＨ６６、ＡＨｊ３、Ａｊ｛“，小鼠Ｌ１２１０及Ｐ３ｓｓ白血病，Ｅｈｒｌｉｃｈ癌，Ｌｅｗｉｓ肺癌，肉瘤１８０，ＣＤ８Ｆ１乳腺癌，Ｃ３Ｈ乳腺癌等试验肿瘤均有延长生命的作用。作用机理主要是通过与癌细胞的ＤＮＡ结合而抑制核酸合成，特别是ＲＮＡ的合成。临床主要用于肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、急性白血病、卵巢癌及恶性淋巴瘤等。与临床常用的本类药物阿霉素和柔红霉素相比，具有抗菌谱广、作用强、毒性低等特点。但ＡＣＭ．Ａ化学分子结构复杂，稳定性差，临床用药发现有骨髓抑制，胃肠不适等毒副作用［Ｉｏ，１”。

抗癌药物肝靶向传输系统无疑是肝癌化疗的理想给药剂型，为肝癌的治疗提供了一种新的思路和给药方法。本课题以ＡＣＭ．Ａ为模型药物制备具有肝靶向性的固体脂质纳米粒，从而提高ＡＣＭ—Ａ稳定性，增大药物在靶部位的浓度，延长药物在体内的滞留时间，降低药物对正常器官的损害，达到提高ＡＣＭ．Ａ的抗肝癌活性，减少全身副作用的目的。选择卵磷脂为载体材料，制备出阿克拉霉素Ａ固体脂质纳米粒，并对其进行质量评价，通过对其理化性质、药剂学性质、稳定性、药物释放规律、体内分布、药动学、药效学及毒性等方面的研究，以期为肝癌的临床化学药物治疗提供了一种新思路和新的给药剂型

以ＡＣＭ．Ａ为模型药物，卵磷脂为载体材料的固体脂质纳米粒研究目前国内、外均未见报道，本课题研究能进一步丰富国内外固体脂质纳米粒的研究内容，促进国内靶向固体脂质纳米粒的发展，为固体脂质纳米粒早同走向临床创造良好的条件。

阿克拉霉素Ａ固体月旨质纳米粒制备工艺的研究

第一部分

阿克拉霉素Ａ固体脂质纳米粒制备工艺的研究

靶向给药制剂（ＴａｒｇｅｔｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍ，ＴＤＤＳ）自７０年代未诞生以来就受到人们特别是医药学家们的高度关注。到今天，人们已经发展了毫微粒、毫微囊、磁性微球、脂质体、复合乳剂等多种新剂型，这些剂型可以通过静脉、动脉、腹腔注射，有的还可通过口服给药或局部给药使药物自动浓集于某些病变器官、组织或细胞【”。研究者们对各种靶向制剂的制备方法、性质、靶向机理、体内分布和代谢规律等都进行了广泛深入的研究并取得了可喜的成果。胶体微粒制剂是靶向给药制剂的重要组成部分，包括纳米粒（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｔｅｓ）、脂质体（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、微乳（Ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ）等。脂质体是人们研究较多的一种靶向制剂，以磷脂和胆固醇为载体材料，具有靶向性、长效性、低毒性和良好的生物相容性等特点，但由于其不稳定，药物泄漏快，贮存期易变质，脂质体的发展和应用仍受到限制”孙。７０年代发展起来的聚合物毫微粒以可生物降解的高分子聚合物如聚乳酸（ＰＬＡ）、聚乳酸．乙醇酸共聚物（ＰＬＧＡ）、聚腈基丙烯酸烷酯（ＰＡＣＡ）等为载体材料，可以很好地解决脂质体稳定性差的问题，但研究发现，这些聚合物微粒进入体内后仍有一定的毒性ｆ１３，１４１。固体脂质纳米粒（ＳｏｌｉｄＬｉｐｉｄＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ，ＳＬＮ）是九十年代发展起来并广受关注的一种新型靶向给药系统，是采用天然的或合成的固态类脂质材料，如卵磷脂、三酰甘油等，将药物包裹或夹嵌于类脂质载体中，制成粒径为５０．１０００ｎｍ的固体胶粒给药系统。与脂质体相比，ＳＬＮ具有良好的稳定性，它可以很好地控制药物的释放，避免药物的泄漏；与聚合物毫微粒相比，由于所使用的载体材料毒性低和生物相容性好，ＳＬＮ的毒性更低，更适于静脉注射给药１３，４）。同时，载体材料脂溶性好，根据相似相容原则，ＳＬＮ特别适合于脂溶性药物。

阿克拉霉素Ａ（ＡｃｌａｃｉｎｏａｃｒｙｌａｔｅＡ，ＡＣＭ—Ａ）是第二代葸环类抗癌抗生素，１９７５年由同本学者梅泽滨夫报道ｌ引，１９８１年１２月由日本三乐株式会社开发上市。国内由四川抗菌素工业研究所研制，１９９２年被卫生部批准为四类新药。ＡＣＭ—Ａ为黄色或橙黄色粉末，熔点为１５１—１５３℃。在甲醇、

阿克拉霉素Ａ固体脂质纳米粒制备工艺的研究

乙醇、乙酸乙酯、丙酮和氯仿中易溶，在水和石油醚中几乎不溶‘９。”，其结构见图１—１。

在本课题中，我们结合实验室现有条件，综合考ＡＣＭ—Ａ的理化特性和所选用的载体材料的理化特性，确定了ＡＣＭ．ＳＬＮ的制备工艺。

Ｃ

Ｆｉｇ．１—１ＴｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｃｌａｃｉｎｏｍｙｅｉｎＡ

１仪器与试药

１．１主要仪器

ＬＣ．ＩＯＡ高效液相色谱仪（Ｓｈｉｍｄａｚｕ，日本），包括ＳＰＤ．１０ＡＶ紫外检测器，ＬＣ一１０ＡＴ泵；

Ｓｔａｒｔｏｒｉｏｕｓ１７１２型电子天平（德国）；

Ｍａｌｖｅｒｎ一２０００型激光散射粒径分析仪（英国Ｍａｌｖｅｍ公司）；

Ｌ８—８０Ｍ型超速冷冻离心机（美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司）；

ＪＡ一１０Ｔ型透射电子显微镜（日本Ｈｉｔａｃｈｉ公司）：

８５—２型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）；

ＰＨＳ一４Ｃ型酸度计（成都方舟科技有限公司）：

ＣＱ一２５０超声波清洗器（上海超声波仪器厂）；

旋转蒸发仪（上海玻璃仪器二厂）

阿克拉霉素Ａ固体月旨质纳米粒制备工艺的研究

１．２药品与试剂

ＡＣＭ－Ａ（批号２００２０３０２，含量９６．Ｏ％，扬州制药厂）；

卵磷脂（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｃｈｏｌｉｎｅ，ＰＣ，四川大学生化技术实验厂）

胆固醇（上海伯奥生物科技有限公司）；

硬脂酸（浙江海盐日用化工厂）；

ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ一６８（南京金陵石化公司）：

Ｔｗｅｅｎ一８０（天津市化学试剂三厂）：

Ｔｗｅｅｎ一２０（天津市化学试剂三厂）：

聚乙烯醇（上海爱建试剂厂）；

十二烷基磺酸钠（成都科龙化工试剂厂）；

其余药品、试剂均为分析纯。

２方法与结果

２．１ＡＣＭ．ＳＬＮ中药物的测定方法

２．１．Ｉ溶剂的选择

在载药ＳＬＮ粒胶体溶液中，除被包裹或吸附于ＳＬＮ的药物外，还存在一定量的未被包封的药物。为考察药物的包封率和载药量，需同时测定ＳＬＮ胶体溶液中总的药量和游离的药物量，因此在测定之前，必需选择合适的溶剂或混合溶剂破坏ＳＬＮ，溶解ＳＬＮ胶体溶液中所有药物。

取ＡＣＭ—ＳＬＮ胶体溶液适量，分别加入不同种类和比例的溶剂或混合溶剂。实验筛选了乙醇、丙酮、氯仿．丙酮．甲醇按不同比例混合等多种溶剂系统，均不能使ＳＬＮ胶体溶液溶解，加入异丙醇超声ｌｍｉｎ，ＳＬＮ胶体溶液完全溶解，溶液澄明。根据实验结果选择异丙醇为溶剂。

２．１．２色谱条件

色谱柱：ＤｉａｒｎｏｎｓｉｌｌＭＣ１８（钻石，４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５ｕｍ）：

流动相：甲醇：０．２ｍ０１．１。醋酸铵：ＬＮ＝５０：３０：２０，混合后用磷酸调ｐＨ至３．Ｏ±０．ｊ；

流速：１．０ｍ１．ｍｉｎ：

阿克拉霉素Ａ固体脂质纳米粒靠Ⅱ备工艺的研究

柱温：４０℃：

检测波长：４３Ｉｒｍａ。

此条件下ＡＣＭ．Ａ的色谱图见图１．２。

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Ｆｉｇ．１－２ＨＰＩＡ２ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｏｆＡＣＭ－ＡｆＡ）ｂｌａｎｋ（Ｂ）ｓａｍｐｌｅ

２．１．３标准曲线的制备

精密称取ＡＣＭ—Ａ５．６４ｍｇ于２５ｍｌ容量瓶中，用甲醇溶解定容制成２２５．６ｕ∥ｍｌ贮备液。精密吸取不同体积的贮备液，用异丙醇稀释得到浓度为１．１２８、２．２５６、５．６４、１１．２８、２２．５６、３３．８４、４５．１２ｔａｇ／ｍｌ系列对照溶液，取２０“ｌ在上述色谱条件下进样分析，记录ＡＣＭ．Ａ的峰面积，结果见图表１．１和图１—３。

Ｔａｂｌｅｌ－１ＲｅｓｕｌｔｏｆｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＡＣＭ－Ａｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｉｎｉｓｏ－ｐｒｏｐｙｌａｌｃｏｈｏｌ

以浓度（ｃ）对峰面积（Ａ）进行线性回归，得标准曲线回归方程为Ｃ＝０．０５４２０＋０．００００７４４４Ａ，ｒ＝Ｏ．９９９９。

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