固相萃取高效液相色谱法测定水中痕量微囊藻毒素

分析化学(FENXIHUAXUE)　研究报告第5期

2001年5月ChineseJournalofAnalyticalChemistry522～525第29卷

固相萃取高效液相色谱法测定水中痕量微囊藻毒素

张维昊　徐小清3

(中国科学院水生生物研究所,武汉430072)

摘　要　微囊藻毒素是有害的蓝藻水华释放的有毒代谢物,对人类及环境具有很大危害性。建立了固相萃取2高效液相色谱测定水中痕量藻毒素的方法。该法对两种常见微囊藻毒素MC2、MC2RR的检测限为0.02～0.05μg/L,线性定量范围为0.1～50μg/L。应用该法分析了天然水样,关键词　微囊藻毒素,固相萃取,高效液相色谱

1　引　　言

(harmfulalgalbloom,HAB)的频繁

1。微囊藻毒素(microcystins,MC)即为有害的蓝藻水华释放的,已发现60多种异构体。蓝藻水华及其毒素已列为微生物和有机污染

2〕

物的检测项目〔。并已有国家推荐水中微囊藻毒素的安全浓度为1μg/L。我国自80年代就对微囊藻

3〕毒素的毒性做过研究〔,而对于水体中微囊藻毒素的检测,由于含量低、干扰大,目前还未有可靠的定性

3～9〕

和定量检测方法的报道。本文在综合国外文献〔的基础上,结合国情,建立了固相萃取(SPE)高效液

相色谱(HPLC)检测水环境中痕量藻毒素的分析方法,并用于实际样品分析,取得满意结果。

2　实验部分

2.1　仪器和试剂

LC2890A型高效液相色谱仪(北京星达技术公司),配有S23702型紫外2可见光检测器(日本相马公

司),LC2850型柱室恒温箱;色谱数据工作站,HypersilBDSC18分析色谱柱(4.6×250mm,5μm),C18保护预柱,C18固相萃取柱(100g/L)均为中国科学院大连化学物理研究所提供。

RE252A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂),250mL杯式滤器,0.45μm混合纤维素酯微孔滤膜

和0.45μm针头过滤器。

微囊藻毒素标样为MC2LR,MC2RR(Sigma公司),三氟乙酸(化学纯,上海化学试剂公司),甲醇(

色谱纯,上海化学试剂研究所),双蒸水。2.2　色谱分析条件

流动相为含0.1%三氟乙酸的水溶液∶甲醇=30∶70(V/V),流速1mL/min,进样量10μL,色谱柱恒温箱设为25℃,紫外检测波长为238nm,实验依据保留时间定性,外标法定量。2.3　储备液和标准液配制

分别将0.500mg微囊藻标准品溶于2.00mL甲醇中,作为储备液。用前再以甲醇稀释配制成标准系列。2.4　样品制备

取水样500mL,于杯式滤器中经0.45μm滤膜减压过滤。滤液中加10mL甲醇调节后过C18反相固相萃取柱。C18反相固相萃取柱用前以10mL甲醇活化并用20mL双蒸水调整。将水样以5～10mL/min的流速流过固相萃取柱进行富集浓缩。装样完毕后,用5%甲醇水溶液10mL淋洗以净化样品,待固相萃取柱吹干后,以4mL甲醇将微囊藻毒素洗脱并经针头过滤器过滤后收集于浓缩瓶内。洗脱液用旋转蒸发器蒸发至0.2～0.5mL,氮气吹干后于-20℃冷冻保存。分析前用甲醇溶解,定容为0.20

　2000207203收稿;2001201215接受

本文系国家科技部与云南省政府资助课题(课题号:DCH201)

第5期张维昊等:固相萃取高效液相色谱法测定水中痕量微囊藻毒素5　　23

mL。

3　结果与讨论

3.1　流动相的选择

国外文献中流动相通常用乙腈及磷酸盐缓冲液,并进行梯度洗脱,不仅毒性大、成本高,且容易堵塞色谱柱,对仪器要求高。本文以甲醇2水配制流动相,以三氟乙酸调节pH值并进行等度洗脱,降低了分

析成本,实验后色谱柱易清洗,并减少了对操作人员的危害。3.2　线性范围和检测限

将MC2LR和MC2RR标准品逐级稀释配制成0.25、0.50、1.25、2.50和0L系列质量浓度,在色谱分析条件下依次测定,以峰面积(Xμ,V ,g),回归方程、s)(Yμ线性范围及相关系数列于表1。在信噪比(S/N)为3,ng。

表1　校准曲线回归方程及其参数(n=5)Table1　Regressienequationsofthen=5)

毒素

Toxins

Macrocystins(MC)2LR

MC2CR

(g/mL)2.5×10-7～2.5×10-52.510

-7

回归方程

Regressionequation

Y=1.17X-0.03Y=0.88X-0.33

相关系数

Correlationcoefficient(r)

0.99870.9983

～2.5×10

-5

313　样品处理的优化

3.3.1　SPE柱的选择　对比了不同品牌C18反相固相萃取柱(德国ChromabondC18f,美国BoundElutJr.C18和大连化学物理研究所提供的ODSC18)对微囊藻毒素的提取率,发现它们之间的差异较小,平

均提取率均超过90%。最后选择了价格较低的ODSC18柱进行微囊藻毒素的固相萃取。

表2　不同固相萃取柱的提取率

Table2　Extractionsofdifferentsolidphaseextraction(SPE)cartridges

固相萃取柱

SPECartridgeChromabondC18fBoundElutJr.C18ODSC18

毒素

ToxinsMC2LRMC2RRMC2LRMC2RRMC2LRMC2RR

μAdded(g)

0.140　0.280　0.5600.520　0.840　1.6800.140　0.280　0.5600.520　0.840　1.6800.140　0.280　0.5600.520　0.840　1.680

加入量

μRecoveryamount(g)

0.132　0.269　0.5380.486　0.782　1.5620.136　0.258　0.5420.478　0.786　1.5640.135　0.262　0.5280.482　0.786　1.568

回收量回收率

Recovery(%)94.3　96.1　96.193.5　93.1　93.097.1　92.1　96.891.9　93.6　93.196.1　93.6　94.292.7　93.6　93.3

平均回收率

AverageRecovery(%)

95.593.295.392.994.693.2

淋洗对提取率的影响(n=3)3.3.2　淋洗液的选择　分别用10mL的5%、表3　

10%、20%的甲醇水溶液梯度淋洗SPE固定相以去

Table3　Theeffectofelutiononextraction(n=3)

淋洗液

除杂质。

发现较高浓度的甲醇水溶液淋洗会造成

藻毒素的流失,且随甲醇浓度增加而增加见表3。所以选用5%甲醇10mL溶液淋洗以净化固定相。3.3.3　洗脱液的选择　洗脱液是为了将分析物尽

量从固定相中洗脱以进行分析。文献报道用90%

的甲醇洗脱。但实验发现,该洗脱液会将一些杂质同时洗脱,造成色谱峰干扰严重。因此,用100%甲醇洗脱,减少了杂质干扰。3.4　色谱分离由于流动相的极性,pH值可在一定范围内改变分析物的保留时间,为尽可能减少对分析物色谱峰的干扰,选定了上述分析色谱条件,图1为标样和实际样品的色谱图。

提取率Extraction(%)3

ElutionsolventMCLRMCRR5%MeOH96.2±1.494.3±1.710%MeOH90.6±1.287.8±1.320%MeOH86.4±0.882.6±1.0　3加入的MC2LR和MC2RR分别为0.56μg和1.68μg(MC2LRandMC2RRadded:0.56μg,1.68μgrespectively)。

524分析化学第29卷

　图1　微囊藻毒素的色谱图　Fig.1　ChromatogramofMicrocystins

　a.标样(standardsmixtures),0.5mg/L;b.实际样品(water)2LRRR3.5　方法的精密度及回收率

按上述优化的实验条件,。将收集的水华蓝藻用蒸馏水反复冻熔提取毒素,,加入蒸馏水中,进行整个实验流程的操作,,一是因为微囊藻毒素纯品价格昂贵,二是因为该,MC2LR、MC2RR的回收率≥80%。实际样品分析时,由于样品基质的干扰,其方法检测限可达0.02～0.05μg/L,线性定量范围为0.1～50μg/L。3.6　实际样品的分析

应用建立的分析方法,检测了2000年2月至12月滇池水样中的微囊藻毒素含量。检测到微囊藻毒素含量随季节、温度、光照而变化,平均浓度范围为0.3～1.5μg/L。该结果表明对滇池中微囊藻毒素应予以重视。

表4　精密度及回收率测定结果(n=6)Table4　Resultsofprecisionandrecoveries(n=6)

毒素

ToxinsMC2LRMC2RR

μAdded(g/L)

0.5601.680

加入量

μDetected(g/L)

0.522　0.504　0.480

0.453　0.532　0.4781.432　1.346　1.2881.454　1.326　1.355

检出量

μSD(g/L)

0.030.06

标准偏差相对标准偏差

RSD(%)5.53.8

Recovery(%)

88.381.3

平均回收率

4　结　　语

建立了SPE2HPLC分析水中痕量微囊藻毒素的方法,该法具有操作简便,灵敏度高的特点,适合水

质监测部门应用。同时,与酶联免疫法相比,在定性和定量上更加可靠,可推广进行水中藻毒素含量的检测。References

1　ChorusI,BartramJ.Toxiccyanobacteriainwater.NewYork:E&FNSpon,1999:113～125

2　SusanDR.Anal.Chem.,1999,71:181～215R

3　ZhangQingxue(张青学),Yuminjuan(俞敏娟).ActascientiaeCircumstantiae(环境科学学报),1989,9(1):86～94

4　TsujiK,NaitoS,KondoF,WatanabeM,SuzukiS,NakazawaH,SuzukiM,ShimzdaT,HaradaK.Toxicon,1994,32(10):

1251～1259

5　RivasseauC,RacaudP,DeguinA,HennionM.Environ.Sci.Technol.,1999,33:1520～15276　RivasseauC,MartinsS,HennionM.J.ChromatographyA.,1998,799:155～1697　LawtonL,EdwardsC,CoddG.Analyst,1994,119:1525～15298　MoollanR,RaeB,VerbeekA.Analyst,1996,121:233～238

9　KondoF,MatsumotoH,YamadaS,TsujiK,UenoY,HaradaK.Toxicon,2000,38:813～823

第5期张维昊等:固相萃取高效液相色谱法测定水中痕量微囊藻毒素5　　25

DeterminationofTraceLevelMicrocystinsinWaterUsingSolid2phase

ExtractionandHighPerformanceLiquidChromatography

ZhangWeihao,XuXiaoqing3

(InstituteofHydrobiology,ChineseAcademyofSciences,Wuhan430072)

Abstract　Thispaperpresentsamethodfortracelevelanalysisofmicrocystinsinwatersolid2phaseextractionandhighperformanceliquidchromatography.Theoptimizedofcommon

μmicrocystinsatlevelsaslowas0.02～0.05g/L,andtheLμg/L.ThemethodhasbeenappliedtotheanalysisoffieldsamplefromKeywords　Microcystin,solid2phasechromatography

(Received3July2000;accepted15January2001)

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随着新世纪的来临,人类社会的发展,特别是中国将进入WTO,人们对产品的质量要求也就愈来愈高。无损检测、理

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