分析实验

实验七 高锰酸钾吸收曲线的绘制

【实验目的】

1.熟悉紫外可见分光光度计的原理、组成及使用方法； 2.掌握测定及绘制药物吸收曲线的方法。 【实验器材】

752N型紫外可见分光光度计、万分之一电子天平、计算机

1000ml棕色容量瓶、20ml大肚移液管、烧杯、50ml容量瓶、胶头滴管、擦镜纸、滤纸、坐标纸

KMnO4（分析纯）、蒸馏水、甲醇（分析纯） 【实验原理】

在紫外-可见光区，物质对光的吸收主要是分子中外层电子的能级跃迁所致，主要是指π→π*、n→π*两种跃迁类型，物质分子结构不同，产生的跃迁类型也不同，物质通过紫外吸收产生的吸收光谱也不相同。

在待测物质的浓度一定的条件下，用各种不同波长的光线作为入射光，测定物质的吸光度（A），然后以波长（λ）为横坐标，相应的吸光度（A）为纵坐标，绘制出的曲线就称为该物质的吸收光谱曲线。吸收光谱曲线是物质的特征曲线，体现了物质对不同波长的光的吸收能力。

在一定的温度、pH值等条件下，待测物质的性质确定，吸收光谱的曲线形状是一定的。在吸收光谱中，往往可找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长（λmax）。物质的结构不同，它们的最大吸收波长也往往不同。 本实验是采用紫外可见分光光度计测定相应波长下的高锰酸钾溶液的吸光度，作图可得吸收曲线，分析高锰酸钾溶液的最大吸收波长。

紫外-可见分光光度计的介绍 一、构造： 光源 单色器 吸收池 检测器 数据处理系统 二、操作步骤：

1接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热20分钟。 2.缓缓转动波长选择钮至所需波长。

3.将空白溶液及待测溶液分别倒入比色杯4/5处，用擦镜纸擦净外壁，分别

放入吸收池内，使空白溶液的比色皿对准光路。

4. 轻按“A/T/C/F”键使光标处于“T”位臵，开启暗箱盖，轻按“▽/0%”键调零，应显示“0000.0”；盖上暗箱盖，轻按“Δ/100%”键，应显示“100.0”。

5. 轻按“A/T/C/F”键使光标处于“A”位臵，应显示“0.000”，拉动拉杆使待测溶液处于光路中，待数字稳定后读数，记录吸光度A值。

6.如要改变波长进行测定，将拉杆推回，使空白溶液处于光路中，重复步骤4中“轻按“Δ/100%”键，应显示“100.0””和步骤5。

7.测定完毕，关闭仪器开关、拔掉电源，取出比色皿洗净，浸泡在甲醇中，若长期不用，取出比色皿洗净后晾干放于比色皿盒中保存；吸收池中放臵干燥剂，防止比色架吸潮损坏。

8.填写《仪器使用记录表》。 【实验内容】

取分析纯的KMnO4 0.125g，精密称定，至1000ml棕色容量瓶中，加蒸馏水溶解完全并稀释至刻度，摇匀，作为储备液备用（0.125mg/ml）。

精密吸取上述储备液20m1，臵50ml容量瓶中，加蒸馏水稀释并定容至刻度，摇匀，作为待测溶液；另用蒸馏水作为空白溶液；

将空白溶液和待测溶液分别盛于厚度为1cm的比色皿中，放入紫外可见分光光度计中，按以下要求测定不同波长的吸光度；

从410nm至510nm，每隔20nm测定一次吸光度；510nm至540nm，每隔5nm；540nm至700nm，每隔20nm；并及时记录吸光度A值。

每变换一次波长，都需要用空白溶液进行校正，将透光率T调节至“100.0”再行测定。

在座标纸上或计算机上，以波长(nm)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制吸收曲线，并指出最大吸收波长。

实验数据记录及结果计算

波长（nm） 410 430 450 吸光度（A） 波长（nm） 535 540 560 吸光度（A） 470 490 510 515 520 525 530

【注意事项】

580 600 620 640 660 680 700 1.严格按照仪器的操作步骤进行操作；

2.比色皿拿其磨砂面，液体装入约4/5高度，并用擦镜纸擦净外壁，每次用完后自来水冲洗干净，浸泡在甲醇中，使用时倒臵于滤纸上晾干； 3.倒取溶液时不能在仪器表面上方操作，仪器上请勿放任何物品； 4.每调换一次波长，都需要用空白溶液进行校正，使其吸光度为“0”。 5.两人相互合作，一人操作仪器，一人记录数据。 【思考题】

1.单色光不纯对测得吸收曲线有何影响？ 2.不同仪器上测得的吸收曲线是否一样？为什么？

实验八 标准曲线法测定高锰酸钾溶液的浓度

【实验目的】

1.进一步熟悉紫外可见分光光度计的使用方法；

2.掌握紫外可见分光光度法的定性和定量方法； 3.掌握标准曲线的绘制及计算方法。 【实验器材】

752N型紫外可见分光光度计、计算机

25ml棕色容量瓶、1、2、10ml大肚移液管、10ml刻度移液管、烧杯、胶头滴管、擦镜纸、滤纸、坐标纸

KMnO4（分析纯）、蒸馏水、甲醇（分析纯）

【实验原理】

根据物质对于入射光的特征吸收，可对待测物质进行定性分析，常采用的方法包括对比吸收光谱特征数据（λmax）、对比吸光度的比值、对比吸收光谱的一致性。

用于定量分析的依据是朗伯-比尔定律：A=ξ〃C 〃L。其物理意义是指当一束平行的单色光通过某一均匀溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和光程的乘积成正比。

采用最大吸收波长作为入射光，当待测物质确定，物质的吸光系数（百分吸光系数E或摩尔吸光系数ξ）是一常数，人为固定L=1cm，即吸光度A与浓度C之间成正比关系，就能够测定待测组分的浓度或含量。

常见的定量方法包括吸光系数法、标准曲线法、标准对照法。其中最常用、最准确的是标准曲线法。即先用标准物质配制一定浓度的储备液，再将该储备液配制成一系列浓度不同的标准溶液。在一定波长下，测试每个标准溶液的吸光度，以标准溶液的浓度为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，求得线性回归方程Y = a X + b和相关系数r。将未知浓度的待测溶液在同一条件下测得吸光度值，在标准曲线上查出待测溶液对应的浓度或含量。 【实验内容】

取分析纯的KMnO4 0.125g，精密称定，臵于1000ml棕色容量瓶中，加蒸馏水溶解完全并稀释至刻度，摇匀，作为储备液备用（0.125mg/ml）。

分别精密吸取上述储备液1、2、4、6、8、10m1，臵于6个25ml棕色容量瓶中，分别加蒸馏水稀释并定容至刻度，摇匀，作为标准溶液；另取蒸馏水作为空白溶液；

调节波长选择钮，以525nm作为测定波长；

将空白溶液盛于厚度为1cm的比色皿中，放入紫外可见分光光度计中进行校正，使吸光度为“0”；再按仪器操作规程依次测定6个标准溶液的吸光度，并记录数据。

取待测溶液（量取储备液5ml，稀释至25ml即得），同法进行测定吸光度，并记录数据。

在座标纸上或计算机上，以浓度(mg/ml)为横坐标，相应的吸光度(A)为纵坐

标，绘制标准曲线，求出线性回归方程Y = a X + b和相关系数r。

将待测溶液的吸光度代入回归方程，解出X值，即待测溶液的准确浓度。

实验数据记录及结果计算

标准溶液浓度（mg/ml） 线性回归方程 相关系数 待测溶液的吸光度（A） 待测溶液的准确浓度（C） 【注意事项】

1.严格按照仪器的操作规程进行操作；吸收池暗箱盖应轻开轻放。 2.配制不同浓度的标准溶液时应注意条件一致，否则引入的人为误差不能使相关系数达到0.999以上。

3.测定不同浓度的溶液时，一种溶液测定完毕，将比色皿用蒸馏水洗净，再用待装溶液润洗2～3次，再装至比色皿4/5高度，用擦镜纸擦净外壁，进行测定。

4.采用同一波长测定，只需一次校正空白溶液后，更换溶液后无需再校正，直接进行测定。 【思考题】

1.标准曲线法为什么是最准确的、最常用的定量方法？ 2.朗伯-比尔定律的适用条件是什么？

r= mg/ml 吸光度（A）

实验九 硅胶粘合薄层板的铺制

【实验目的】  学会薄层板的制备方法 【实验器材】

载玻片、薄层用硅胶、CMC-Na(羧甲基纤维素钠)(1%) 【实验原理】

薄层色谱法是一种微量、快速、简易、灵敏的分析方法，其原理为吸附色谱或分配色谱。吸附色谱是利用混合物中各组分被吸附剂吸附能力的不同以及在流动相中溶解度的不同而使之分离。分配色谱则是利用混合物中各组分在固定相和流动相中的分配系数不同而使之分离。其特点是将吸附剂（固定相）均匀地铺在玻璃板上制成薄层，把欲分离的试样点加在薄层上，然后用合适的溶剂展开，通过化合物自身颜色或显色剂显色后，在板上出现一系列斑点，从而达到分离鉴定和定量测定的目的。 【实验内容】 

本实验以硅胶H为吸附剂，羧甲基纤维素钠(CMC)为粘合剂，制成薄层板， 薄层板制备

取7.5×2.5cm左右的载玻片5块，洗净晾干。

在50mL烧杯中，放臵3g硅胶，逐渐加入1%羧甲基纤维素钠(CMC)水溶液约9mL，边加边搅拌，调成均匀的糊状，用药匙或玻棒涂于上述洁净的载玻片上，用食指和拇指拿住玻片，作前后左右摇晃摆动，使流动糊状物均匀地铺在载玻片上。必要时，可在实验台面上，让一端接触台面而另一端轻轻跌落数次并互换位臵。然后把薄层板放于水平的长玻板上，自然晾干。半小时后臵于烘箱中经110℃活化30min。取出，稍冷后臵于干燥器中备用。 【注意事项】

制板时要求薄层均匀光滑，薄层厚度一般为0.1～2mm。可将吸附剂调得稍稀一些，尤其是制硅胶板，否则吸附剂调得很稠，就很难做到均匀。 【思考题】 

在调制硅胶板时，糊状物应该怎样调制?

实验十 硅胶薄层层析的使用

1.掌握薄层层析的基本原理。 2.学会比移值Rf的测定方法 【实验器材】

硅胶层析板、层析缸、毛细管、菠菜、分液漏斗、研钵、三角瓶、甲醇、石油醚、无水硫酸钠、丙酮或乙酸乙酯、NaCl。 【实验原理】

薄层色谱法是一种微量、快速、简易、灵敏的分析方法，其原理为吸附色谱。吸附色谱是利用混合物中各组分被吸附剂吸附能力的不同以及在流动相中溶解度的不同而使之分离。

试样中各组分的分离效果可用它们比移值Rf的差来衡量。Rf值一般在0～1之间。

【实验内容】  1.菠菜色素的提取

称取5g无水的新鲜菠菜叶，用研钵研碎，加入15 ml石油醚-乙醇溶剂(3：2)研磨至桨，抽滤，滤液放至分液漏斗中，加入5ml饱和NaCl 水溶液，分层，上层再用饱和NaCl 水溶液洗涤，有机层用无水Na2SO4 干燥，滤去Na2SO4 后，滤液放入小烧杯中，水浴蒸去溶剂（控制温度（60°-70℃），浓缩至2.5ml 左右为止。 2.点样

在离薄层板一端1cm处，用铅笔轻轻画一直线。取管口平整内径小于1mm的毛细管插入样品溶液中吸取液面高度为5mm，于铅笔画线处轻轻点样，斑点直径不超过2mm，每块板可点样两处，样点与样点之间相距1～1.5cm为宜，待样点干燥后，方可进行展开。先点已知纯样品，再点混合样品。 3.展开(层析)

取活化后的层析板，点样，小心放入盛有展开剂（7：3石油醚-丙酮）的广口瓶内，样点不能浸到展开剂中，盖好瓶盖，待展开剂上升至规定高度时，取出

层析板，在空气中晾干，计算三种色素（叶绿素、叶黄素和胡萝卜素）的Rf值。 注：叶绿素会出现两点（叶绿素a，叶绿素b）。 叶黄素易溶于醇而在石油醚中溶解度小，从嫩绿叶中得到提取液，叶黄素会显很少。 【注意事项】

1. 点样用的毛细管必须专用，不得弄混。

2. 点样时，使毛细管刚好接触薄层即可。切勿点样过重而使薄层破坏。如果太淡，待溶剂挥发后再点一次。

3. 若为无色物质的色谱，应做显色处理。本实验分离的物质都有颜色，可省去显色一步。 【思考题】 

1.在一定的操作条件下，为什么可利用Rf值来鉴定化合物? 2.在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层上的位臵?

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