成栋学院实验指导

实验一 细胞膜的渗透反应

一、实验目的

1．了解细胞膜对物质通透性的一般规律: 细胞膜的渗透性及各类物质进入红细胞的速度。 2．了解溶血现象及其发生机制。 二、实验原理

细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。渗透作用是细胞膜的主要功能之一。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对某些溶质具有通透性，溶质可进入细胞内，导致膜内渗透压升高，胞外的水随之进入细胞内，发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞进度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化，判定红细胞对不同物质的通透性如何。 三、实验材料

鸡血

四、实验器材

50ml小烧杯、10ml移液管、试管（15ml）、试管架。 五、实验试剂

抗凝剂：肝素（5 μg/ml）

0.17M氯化钠 0.17M氯化铵 0.17M醋酸铵 0.17M硝酸钠 0.12M草酸铵 0.12M硫酸钠 0.32M葡萄糖 0.32M甘油 0.32M乙醇 0.32M丙酮

六、实验方法

（一）鸡红细胞悬液

以肝素液湿润5ml注射器内壁，推出多余的肝素液（针头内必须留下肝素液，不要进空气），取鸡的静脉血2ml左右。取50ml小烧杯一只，加一份鸡血和十份0.17M氯化钠溶液，形成一种不透明的红色液体，此即稀释的鸡血。 （二）低渗溶液

取试管一只加入10ml 蒸馏水，然后再加入1ml 稀释的鸡血，混匀，注意观察溶液的颜色变化，由不透明的红色逐渐澄清，红细胞发生破裂，造成100%红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。

（三）鸡红细胞的渗透性

1、取试管一只，加入0.17M氯化钠溶液10ml，再加入1ml 稀释的鸡血，轻轻摇动，注意是否有颜色变化？是否有溶血现象？为什么？

2、取试管一只，加入0.17M氯化铵溶液10ml ，再加入1ml 稀释的鸡血，轻轻摇动，注意是否有颜色变化？是否有溶血现象？若发生溶血，记下时间（自加入1ml稀释鸡血到溶液变成红色透明澄清所需时间）。

3、分别在下列八种等渗溶液中进行实验，步骤同2。 （1）0.17M醋酸铵 （2）0.17M硝酸钠 （3）0.12M草酸铵

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（4）0.12M硫酸钠 （5）0.32M葡萄糖 （6）0.32M甘油 （7）0.32M乙醇 （8）0.32M丙酮 七、注意事项

1．肝素用量要适宜，过少无抗凝作用，过多易导致溶血。

2．为了保证实验结果的精确性，应准确计时，并确定开始计时的标准和完全溶血的标准。 3．有的溶液不发生溶血，有的发生溶血时间比较长，可以将他们与对照组（氯化钠组）一起对比，如果发现有溶血现象但尚未完全溶血的说明该溶液可使血细胞发生溶血，只是时间未到，但是如果与对照无差别，说明它不会使血细胞溶血。 八、实验报告

将观察到的现象记录，并进行分析比较和讨论（填写表格）。 管号 处理 是否溶血 时间(单位) 结果分析 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10ml氯化钠＋1ml稀释鸡血 10ml氯化铵＋1ml稀释鸡血 10ml醋酸铵＋1ml稀释鸡血 10ml硝酸钠＋1ml稀释鸡血 10ml草酸铵＋1ml稀释鸡血 10ml硫酸钠＋1ml稀释鸡血 10ml葡萄糖＋1ml稀释鸡血 10ml甘油＋1ml稀释鸡血 10ml乙醇＋1ml稀释鸡血 10ml丙酮＋1ml稀释鸡血 10 九、思考 1.红细胞在不同溶液中溶血时间为什么不同？ 2.试述细胞膜有哪些种跨膜运输的机制？

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实验二 红细胞的计数

一、实验目的

掌握动物细胞计数的方法。 二、实验原理

细胞计数板是由特殊硬质玻璃载物片构成。计数板的中央部分有四条沟，形成三条隆起，两边较窄的隆起，是放置盖玻片用。中央较宽隆起部分，可有一个或两个计数室用来计数白细胞和红细胞。中央的隆起比两边的隆起低0.1毫米，因此盖上盖玻片，在这一间隙中充满红细胞稀释液时，其深度恰好为0.1毫米。其计数部分是由一个长3mm宽3mm深0.1mm的小室，其上被等分为9个大方格(其边长为1mm)，中间的大方格又用双线等分为25个中方格（其边长为1mm/5=0.2mm），每个中方格又被单线等分为个16小方格（小方格的边长为0.2mm/4=0.05mm）。计数时，通常选择计数室中央大方格四角和中央的五个中方格（每个中方格包含16个小格）来计数。 三、实验材料 鸡血。 四、实验器材

① 剪刀

② 玻璃毛细管 ③ 载玻片

④ 细胞计数器

⑤ 细胞计数板和相应的盖玻片 ⑥ 复式显微镜 五、实验试剂

① 抗凝剂：肝素（5mg/ml）。

② 血细胞稀释液：NaCl 0.9g，加蒸馏水至100ml。 六、实验方法

1、杀鸡取血，加入适量抗凝剂（取0.3ml 5mg/ml肝素于试管内，可抗凝1-3ml血液）；计数前将鸡血适当稀释(稀释100~200倍)。

2、在细胞计数板（见图1）的两条窄的隆起上涂一些液体，按住盖玻片从下方推上。

图1 细胞计数板的外观

3、用玻璃毛细管吸取鸡血稀释液于放有盖片的细胞计数板的边缘，液体自然流入盖玻片下的空隙，均匀地充满计数板小室即可。注意：向细胞计数板加鸡血稀释液时加量要适当，过多使盖玻片漂移，过少使计数板的小室内有气泡产生，不理想时要重新滴加，否则会影响细胞计数的效果。

4、静置2~3min，待细胞稍沉降，先在低倍镜下观察红细胞是否分布均匀（见图2），如分布不均匀，就应洗后重做。若分布均匀，则在普通光学显微镜的“10×”物镜下进行细胞计数。先调焦，看清计数板上的格线，然后将五个红细胞计数的中方格逐个移入视野中心，逐一计数（每一中格内含有16个小格）。对于细胞压线者，则遵循数上不数下、数左不数右的原则。计数后按下式计算：

鸡血红细胞数/ml血液=（5个中方格的鸡血红细胞总数/5）×2.5×105/ml×稀释倍数

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注：每个中方格的体积是(0.2mm)2×0.1mm=4×10－3mm3=4×10－6ml，因此：每毫升细胞数=稀释倍数×每个中方格细胞数/(4×10－6)= 每个中方格细胞数×2.5×105×稀释倍数

图2 细胞计数室示意图

七、注意事项

1、肝素用量要适宜，过少无抗凝作用，过多易导致溶血。

2、在观察时应将显微镜的光调弱，这样有利于更加清晰的观察到计数板横竖格线。 八、实验报告

1、鸡血红细胞计数 每个中方格血细胞数 2、血细胞数/ ml血液= 九、思考题

1 2 3 4 5 平均 1、为什么向计数板上加血液样品要事先稀释100-200倍？ 2、细胞计数板计数的原理是什么？

3、为什么要对5个中方格的红细胞计数后取平均值来计算每毫升血液中所含细胞数？

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实验三 红细胞的显微测量

一、实验目的

掌握动物细胞显微测量的基本原理和使用方法 二、实验原理

细胞的大小，一般可用显微测微尺来测量。显微测微尺是由目镜测微尺和镜台测微尺组成的，两尺必须配合使用。目镜测微尺是放入目镜内的一种标尺，是一特制的圆形小玻片，其上刻有50或100等分的刻度，每一刻度所代表的长度随放大倍数而改变。因此，使用前必须测定。镜台测微尺是在一块载玻片中央由圆形盖玻片封固的标尺，长度为1mm或2mm，分为100格或200格，每格的长度为0.01mm（10μm）。其目镜测微尺的长度标定方法和细胞显微测量方法如下：

1、将镜台测微尺置于载物台的中央（注意刻度面朝上），用低倍镜调准焦距，进行观察，找到镜台测微尺的刻度。每大格为0.1mm，每小格为0.01mm。

图1 目镜测微尺和镜台测微尺外观形态

2、取下目镜的上透镜，将目镜测微尺有刻度的一面朝下，放在镜内的光栏下，再旋上目镜的上透镜。

3、从目镜中观察目镜测微尺和镜台测微尺的刻度，转动目镜筒或移动镜台测微尺，使两标尺平行。转换高倍镜，在视野中使目镜测微尺的任一刻度线重合为起点，沿两标尺平行方向，找到另一重合刻度线为终点，记录下其间的格数，就可以算出目镜测微尺每小格的长度。

图2 显微测量原理图

公式如下： L=10×B/A（μm） A=目镜测微尺的格数 B=镜台测微尺的格数

L=目镜测微尺每小格的长度

4、取下镜台测微尺，换上需测量的玻片标本，记录目镜测微尺所测量的标本的刻度，乘以L，即为标本的长度。 三、实验材料 鸡血。 四、实验器材

① 剪刀

② 玻璃毛细管 ③ 载玻片

④ 复式显微镜

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