叶绿色素的提取分离、理化性质-清华 - 图文

现代生物学导论 普生实验报告 叶绿色素的提取分离、理化性质和含量测定 生医9 田雪霏 2009013189（同组人：蒋楠）

PART A

一、 实验名称：叶绿色素的提取与分离 二、 实验原理

叶绿体中叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素、叶黄素与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。提取液可用薄层色谱法加以分离和鉴别。由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附能力强的物质相对移动慢一些，而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。 三、 实验材料与试剂

1. 新鲜的菠菜叶片

2. 体积分数为95% 的乙醇，CaCO3粉末，展开剂（石油醚：丙酮：苯=7：

5：1，体积比）

3. 天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，

滤纸。

四、 实验步骤

（一）、色素提取液的制备

1．取新鲜叶片4～5片（2g左右），洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入研钵中

2．研钵中加入少量CaCO3，加2～3ml体积分数为95% 的乙醇，研磨至糊状，再加15ml 体积分数为95% 的乙醇，上清液用漏斗过滤，残渣再用10ml 体积分数为95% 的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液。提取液应避光保存，因提取量较大，可用于其它相关实验。

（制备的叶片中叶绿体色素的提取液） （二）、叶绿体色素的分离

1. 取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短

边，距下边缘1cm 处用毛细管划线，风干或吹风机吹干后再划第二次，重复操作3～4次。

2. 在干洁的层析缸中加入适量的展开剂，高度约0.5cm，将硅胶预制板带有色素的一端放入，使其下端浸入展开剂中。迅速盖好层析缸盖。此时，展开剂借毛细管作用沿硅胶预制板向上扩散，并把叶绿体色素向上推动，不久即可看到各种色素的色带。

当各种色素得到较好分离，展开剂前沿接近硅胶预制板上端近边缘处时，取出硅胶预制板，并迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。

—————————— 展开剂前沿，7cm —————————— 胡萝卜素， 6.5cm

—————————— 叶绿素a ， 5cm —————————— 叶绿素b ， 4.6cm —————————— 叶黄素， 4.2cm

—————————— 点样区， 0cm

五、 实验结果与分析

叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。各色素带的位置可用相对比移值Rf来表示。即Rf=斑点中心到原点的距离/溶剂前沿至原点的距离。

由于不同分组有不同的Rf值，所以比较其值可以进行定性分析。但影响其值的因素也有很多。如展开剂的极性、组成和配比，吸附剂的种类、颗粒度，层析缸的形状和大小、温度等。因此引用标样作对照实验进行定性分析更加可靠。 1. 提取液

溶剂样品的溶剂应避免用水，因为水溶液点样时容易扩散。一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等易挥发的有机溶剂。点样溶剂应能迅速挥发，并减少空气中水蒸气对薄层吸附剂的影响。 2. 硅胶

硅胶主要成分为无定形二氧化硅，化学性质稳定，具有微孔结构，有很强吸附能力，为常用的吸附剂。其表面有很多硅醇基团，—OH 与色素分子形成氢键结合而产生吸附作用，色素的极性越大，被硅胶吸附得越牢。 3. 展开剂

由几种溶剂混合的展开剂，占比例较大的主要溶剂在展开剂中起溶解物质和基本分离的作用，占比例较小的溶剂起调整改善分离物质Rf值及对某些物质的选择作用。混合展开剂中各溶剂极性顺序为石油醚<苯<丙酮，根据比例，此展开剂为弱极性 4. 色素

叶绿体色素的极性决定于其分子中所带官能团的极性，依据饱和烃、不饱和烃、醚、酯、醛、酮羟基化合物、酸和碱的极性依次增强分析各色素结构得出：胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素极性依次增大，与硅胶吸附能力依次增强 5. 色素展开顺序

根据展开剂、硅胶和色素的性质，各种色素由下至上的展开顺序为：叶黄素、叶绿素b、叶绿素a、胡萝卜素。由于薄层色谱的灵敏度较高，色素当中的同分异构体有时也会显出色素带，因此色素带不只限于以上四种。

PART B

一、 实验名称：叶绿体色素的理化性质 二、 实验原理：

叶绿素可与碱起皂化反应生成甲醇及和叶绿醇及叶绿素盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当变回基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，易受强光破坏，特别是叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的Mg可以

被H+取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在强光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。

三、 实验材料与试剂

1. 新鲜菠菜叶片

2. 刻度试管，小试管，试管架，水浴锅，10ml 移液管

3. 体积分数为95% 的乙醇，苯，醋酸铜粉末，质量分数为5% 的稀盐酸，

醋酸-醋酸铜溶液，氢氧化钾-甲醇溶液

四、 实验步骤

（一）、光对叶绿素的破坏作用

1.取2支小试管，各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用体积分数95%乙醇稀释1倍。其中1支放在阳光下，另外1支放到暗处或用锡箔纸包严，40min后对比观察颜色有何变化

*结果：40min后，包严的试管中叶绿体色素提取液基本上保持原来的颜色未变，而与阳光下暴晒的试管中叶绿体色素提取液的颜色渐渐由原来的鲜绿色变成深褐色。

（这是一只试管作对照，把两只试管在阳光下暴晒）

2.另取之前得到的薄层层析分离成的硅胶色谱板一个，按长度方向将一半用黑色纸或塑料薄膜包住，放在直射日光下，30min后比较色谱版上的各色素的颜色有何变化。

*结果：硅胶色谱版包严的部分颜色基本上没有变化，但是置于阳光下暴晒的部分颜色变浅，至浅褐色，有些部分甚至无法看出原来的颜色，硅胶色谱版中间隐约可以看出锡箔纸包盖后留下的痕迹。

（二）、皂化作用（绿色素与黄色素的分离）

1.取1支10ml刻度试管加入3ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，加入1ml KOH-CH3OH aq ，充分摇匀。

2.片刻后，加入3ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1ml左右蒸馏水，轻轻混匀（勿激烈摇荡），然后置于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时，静置。

*结果：可以看到溶液逐渐分为两层，下层的是稀的 CH3CH2OH 溶液，其中溶有皂化的叶绿素a 和叶绿素b （以及少量的叶黄素），上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/6hdt.html