《食品微生物检验技术》课程作业要求

班级：__食生111__学号：___53__姓名：樊继国 分数___________

黄豆酱中微生物的检验

一、国家标准中鱼类罐头需检测的微生物种类及标准 微生物种类 菌落总数 酵母 霉菌 金黄色葡萄球菌 国家标准 < 100cfu/ml ≤100cfu/ml ≤30cfu/ml 不得检出 二、黄豆酱中菌落总数的检测 1、实验原理

菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。

菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。本方法规定的培养条件下所得到的结果，仅包括在培养琼脂上面生长的嗜中温性的菌落总数。

2、实验器材 2.1仪器：

冰箱：2 ℃～5 ℃。

恒温培养箱：28 ℃±1 ℃。 均质器。 恒温振荡器。

显微镜：10×～100×。 电子天平：感量0.1 g。

无菌锥形瓶:容量500 mL、250 mL。 无菌广口瓶：500 mL。

无菌吸管：1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)。 菌平皿：直径90 mm。 无菌试管: 10 mm×75 mm 无菌牛皮纸袋、塑料袋。

2.2培养基：平板计数琼脂培养基 ⑴组成成分

1.0g 葡萄糖

2.5g 酵母浸膏

5.0g 胰蛋白胨

15.0g 琼脂

1000mL 蒸馏水

PH7.0±0.2

1

⑵营养琼脂培养基的配置

①取20g营养琼脂培养基放到三角瓶并且加入1000mL的蒸馏水，然后震荡摇匀。 ②然后用脱脂棉做成棉塞塞到三角瓶口，用牛皮纸包扎好。 ③放到高压锅内以高温、十五分钟杀菌

④杀菌后，取出培养基，自然冷却到40℃左右备用

⑶琼脂培养基做法

把组成成分里面的成分加入到蒸馏水中煮沸溶解，然后调节PH，装到试管里面和三角瓶中，在高温杀菌十五分钟左右。

2.3磷酸盐缓冲液 2.31成分

34.0g 磷酸二氢钾

500.0mL 蒸馏水

PH7.2

贮存：取34g的磷酸二氢钾放入烧杯中，并倒入500mL蒸馏水，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节PH，然后再用蒸馏水将其稀释到1000mL存到冰箱。

稀释：将贮存液中取1.25mL，用蒸馏水将其稀释到1000mL，装到三角瓶中高压灭菌锅中灭菌十五分钟。

2.4无菌生理盐水

8.5g 氯化钠

1000mL 蒸馏水

做法：将氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，高温杀菌十五分钟。 3、操作步骤 （1）样品处理

在无菌操作将取黄豆酱25mL放到225mL的灭菌生理盐水中，经充分的震荡并研磨制成1：10的均匀稀释液。

（2）具体操作方法

用1mL灭菌吸管1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水试管中，用定量移液器在试管内鼓气使其均匀，做成1：100的稀释液。

另取1mL的吸管做递增稀释液。根据国家标准要求对检样污染情况的估计，选取二至三个稀释度，分别做10倍数递增的同时，即吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液溶于灭过菌的平皿中，每个稀释度做两个平皿，并表上样品编号，稀释度等。

稀释液在移入平皿后，注入冷却到451℃营养琼脂将平皿底覆盖，放在桌上徐徐振摇，使培养基和检样混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液的灭菌平皿中做空白实验对照。待平皿中的营养琼脂凝固后，将平板翻过来，放到35到37度的培养箱中培养两天左右。

菌落计数的方法：在做平板计数的时候，可以用肉眼观察，必要的时候用放大镜观察，以防止遗漏。在记下各个平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。

4、结果处理

2

稀释度 平板 菌落数 1 2 10-1 3 平均 1 2 10-2 3 平均 1 2 10-3 3 平均 三、酵母的检测 1.实验原理 霉菌和酵母菌菌数的测定是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含的霉菌和酵母菌菌落数。

2.实验器材 2.1仪器和材料 恒温培养箱 冰箱 天平 均质器 恒温振荡器 无菌吸管 无菌锥形瓶 无菌广口瓶 无菌平皿 无菌试管

2.2培养基和试剂

马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基、孟加拉红培养基 3.检样程序及方法 3.1

检样 ↓

25g（mL）样品+225mL无菌水，均质 ↓

10倍系列稀释 ↓

选择2-3个适宜稀释度的样品匀液，各取1mL分别加入无菌培养皿内 ↓

每皿加入15-20mL马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基或孟加拉红培养基 ↓

培养28±1℃，5d ↓ 菌落计数 ↓ 报告 3.2样品稀释

3.2.1固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225mL灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。或放入盛有225mL无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10 的

3

样品匀液。

3.2.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL无菌蒸馏水的锥形瓶中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。

3.2.3取1mL1:10 稀释液注入含有9mL无菌水的试管中, 另换一支1mL无菌吸管反复吹吸,此液为1:100 稀释液。

3.2..4按3.2.2操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1mL无菌吸管。在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mL样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。

3.2.5及时将15mL～20mL冷却至46℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

3.3 培养

待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养5d，观察并记录。 3.4 菌落计数 肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（CFU）表示。

选取菌落数在10 CFU～150 CFU 的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。

4.结果报告 霉菌测定结果 稀释度 平板 霉菌菌落数 1 2 3 平均 1 2 3 平均 1 2 3 平均 每mL菌液中霉菌数_________。

酵母菌测定结果 酵母菌测定结果 稀释度 平板 酵母菌落数 1 2 3 平均 1 2 3 平均 1 2 3 平均 每mL菌液中酵母菌数_________。 四、金黄色葡萄球菌的检测 1.实验原理 葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌，金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。

金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。

2.实验器材

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恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 冰箱：2 ℃～5 ℃。

恒温水浴箱：37 ℃～65 ℃。 天平：感量0.1 g。 均质器。 振荡器。

无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。 无菌锥形瓶：容量100 mL、500 mL。 无菌培养皿：直径90 mm。 注射器：0.5 mL。

pH计或pH比色管或精密pH试纸。 2.1培养基和试剂 10％胰酪陈大豆肉汤 7.5%氯化钠肉汤 血琼脂平板

Baird－Prker琼脂平板 脑心浸出液肉汤（BHI） 兔血，

营养琼脂小斜面 无菌生理盐水。 3.检样程序及方法

25g（mL）样品+225mL7.5％氯化钠肉汤或10％胰酪陈大豆肉汤，均质 36±1℃ ↓ 18-24h

Baird－Prker平板，血平板 36±1℃ ↓ 18-24h

涂片染色 观察溶皿 BHI肉汤和营养琼脂小斜面 36±1℃ ↓ 18-24h 血浆凝固酶试验 ↓ 报告 3.1检样处理

称取25g固体样品；吸取25mL液体样品，加入225mL灭菌生理盐水，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。

3.2增菌及分离培养

吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪陈大豆肉汤50mL培养基内，置36±1℃温箱培养24h，转种血平板和Baird－Parker平板，36±1℃培养24h，挑取金黄色葡萄球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。

3.3鉴定

（1）染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5～1μm。

（2）血浆凝固酶试验：吸取1∶4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，放36±1℃温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。

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4.结果报告

（1）结果判定：在Baird－Prker琼脂平板和血平板菌落以及血浆凝固酶阳性，可判定为金黄色葡萄球菌。

（2）结果报告：在25g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。

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