灵芝真菌固态发酵产三萜类化合物的工艺条件

耵资开与用源发利

灵芝真菌固态发酵产三萜类化合物的工艺条件张志才何林富黄达明

江苏大学食品与生物工程学院生物工程研究所摘要采用单因子试验和响应面法优化灵芝真菌固态发酵产灵芝三萜类化合物 (芝酸 )灵的

3艺条件。于 3因素 3水平的中心组合设计， -基得到了描述灵芝真菌固态发酵的灵芝酸产量与操作

参数间的二次响应面模型。在起始 p ., H6 4以料水比 1 .,N 4 O质量浓度为 1 7% 2:2 (H) 12 S .灵芝真菌 0 固态发酵时，由回归方程预测在此条件下的灵芝酸产量的理论值为 22 5t/。模型优化条件下 7. g 5 xg 的灵芝真菌固态 2k发酵所得灵芝酸含量 ( 0 3I/ -灵芝真菌固态 2 g g 2 . g ) 7 0 x g￣ 0k放大发酵所得灵芝酸含量(6 . gg本与理论值相符。 2 86 4/基 )关键词灵芝灵芝酸固态发酵单因子试验响应分析

中图分类号： 1 .5 S8 63

文献标志码： B

文章编号：0 2 2 1 (0 91 - 0 8 0 1 0— 8 32 0 )1 0 6— 311主要仪器 .3 .

灵芝酸活性物质提取过程中主要通过液态发

酵来提取固态发酵工艺的报道较少。段明星等进行了灵芝纤维酶的性质和纯化研究，明了灵芝真菌证

72 5 C可见紫外分光光度计；转蒸发仪。旋1试验方法 . 2

能降解秸秆的可能性；东平对灵芝液体发酵产纤孙维素酶的提取及性质分析进行研究，明了灵芝能证产纤维素酶。而进一步证实了灵芝真菌能降解秸从秆。试验以麦草秸秆为碳源，使灵芝真菌诱导产生

1 .标准曲线的绘制 .1 2

准确称取熊果酸标准品约 5m,于 5 L乙 g溶 0m

酸乙酯，混合均匀得标准溶液( 10 I/ L。分别约 0 gm ) x吸取标准溶液 0 01 0、. 06 08 1和 1 L、.、. 0 .、 .、 2 4、 .m, 2在 1 0o水浴上蒸干，入 5%的香草醛一冰乙酸 0 C加

纤维酶从而分解麦草秸秆纤维素成为糖类物质供灵芝真菌自身生长。同时，芝真菌能产生胞外和灵胞内灵芝酸。灵芝真菌固态发酵灵芝产灵芝酸一方面对灵芝酸的生产是个新的尝试。另一面可有效利用秸秆资源 .芝真菌固态发酵秸秆产物

中还富含灵灵芝多糖和灵芝菌体蛋白等物质，灵芝真菌固态发酵秸秆产物可作为功能性秸秆饲料。

溶液 O L后和 1mL高氯酸，0℃水浴中加热 .m 4 6 1 i移入冰水浴中， 5m n后并加入 5mL冰乙酸， 摇匀后置于室温。 1 i用分光光度计在 5 81a 5 m n后 4. m 波长下测定其吸光度。1 .灵芝酸的提取 .2 2

称取灵芝真菌固态发酵产物1 0g用 1 0倍 9 5%乙醇， 5℃水浴回流 4 h,复 3次，醇提取 8 重乙液冷却后合并过滤，空浓缩至干，到浸膏。真得 浸膏用 1 5倍体积氯仿溶解，移至分液漏氯仿， 再用氯仿洗残渣 2次，并氯仿液 .空浓缩至合真原体积 11用饱和碳酸氢钠萃取氯仿液 4/0:次，酸氢钠层用 6 m lm碳 o/ L盐酸调 p至 2 3, H~

l材料与方法11试验材料 . 111灵芝菌种 . .

灵芝菌种 JU 0, S 9江苏大学生物工程研究所分离纯化。灵芝菌种 J U 0 S 9培养基，去皮的马铃薯取

2 0g水 1 0 L 0加 0m。煮沸并过滤后加葡萄糖和琼 0脂各 2, 0g放置灭菌锅 1 1C灭菌 2 i。 2 I= 0r n a11主要试剂 .. 2

再用氯仿萃取 4次，合并氯仿液所得沉淀用氯仿溶解。缩至于得粗灵芝酸，乙酸乙酯定容浓加至 5m L容量瓶中，备得到待测样品溶液。制1 .灵芝酸的测定 .3 2吸取乙酸乙酯定容液 1,0 水浴蒸干， mL 10o C然后加入 5%香草醛一冰乙酸溶液 04 m . L和 1m L高氯酸，0℃水浴中加热 1 n后移入冰水浴中， 6 5mi

熊果酸标准品，于中国药品生物制品检定所：购

高氯酸、冰醋酸、香草醛、无水乙醇、乙酸乙酯、乙冰酸和三氯甲烷均为国产分析纯试剂。收稿日期：0 9—0 20 6— 1 7通信作者：张志才

6 饲料研究 F E) F I R 8 E 1 R .¨{ S. A

∽0 l2

资开利耵源发与用并加入 5m L冰乙酸，匀后置于室温。 5m n后用摇 1 i分光光度计在 5 81n 4 . m波长下测定其吸光度。 1数据处理 - 3试验数据采用 D s

n—ep￣7 0软件进行方 ei g xe .差分析。试验数据以平均值±准误差的形式表示。标 他时间有明显升高，明 8~1说 4d时消耗的资源较多，能灵芝产生较多的灵芝纤维素酶，可能较好的

利用麦草秸秆资源，而所产的灵芝酸在此期间能从达到一个峰值。一一

灵芝酸含量发酵过程失质量

2结果与讨论21灵芝酸标准曲线 .

根据试验方法中标准曲线的绘制方法，从图 1可见：= .0 一 .013R= .9 y O0 35 X 00 , 09 9 3。03 _5 03 -0 02 .5 02 .0 01 .5 0I .O OO .52 4 b 子 l U l j l 2 4 O

固态发酵时问， d∞删如 灵芝酸对照品质量浓度/p 3 (￣ mL ) g 22 l l

图 3发酵时间对产灵芝酸的影响

∞ 24 图 l灵芝酸标准曲线 ∞∞卯∞∞ 0 .

接种量对灵芝发酵产灵芝酸的影响接种量对灵芝发酵产灵芝酸的影响研究中 .所

22 3种金属离子对灵芝发酵产灵芝酸的影响 . 江苏大学生物工程研究所在前期的灵芝纤维素

接种子是江苏大学生物工程研究所前期经优化研究的产灵芝产纤维素酶和木聚糖酶活性都较高的固态培养基培养的菌种，灵芝真菌固态培养基培养7d后接人到灭过菌的发酵基质中。从图 4可见： 接种量为 5%时 .同的发酵时间内灵芝酸的产量不相

酶酶学性质的研究过程中发现， 3种金属离子 Z、 n K和 Mg对灵芝纤维素酶酶活有较明显的促进作 2 用。在发酵的料水中按其研究得出的质量浓度分别添加 1 gmL的 Z M,. g .m/ 6 n和 02 r/ 4a mE的。从图 2可见：添加 Z 灵芝酸的产量几乎没有影响， n对2 1而和 M对灵芝酸的产量都提高约 22 1 g 0 5。灵5 O 5 O 5

高 .可能是灵芝真菌菌体与发酵基质的接面较少，O

发酵速率较慢。当接种量在 l 0%~2 0%,同时间相内对灵芝酸的产量影响不大。+灵芝酸含量

芝在生长和代谢产物阶段，+ Mg是其

生长的必 I和 ( 2需因子，不添加 K或 Mg时，芝发酵过程中 K在 。灵 暑蟋/黏

和 Mg+ 2质量浓度可能还没达到其生长的所需的质量浓度。 23发酵时间对产灵芝酸的影响 -灵芝生长发酵前期主要以菌丝细胞生长为主，

一3 o 0

酒精粗提物质量7 O

望 20 5皿I2 0旺 0 {

6面 56瞧 05 5

塞1 5 010 0 5 OO

菱

当后期菌丝发育到一定程度，图 3可见：验中从试发酵时间为 8~1 4 d时平均每天发酵失质量比其

5;藿4 0

接种量/%20 8

图 4接种量对灵芝发酵产灵芝酸的影响

望20 620 4缸

25起始 p对产灵芝酸的影响 . H

链 20 220 0

发酵前把配置好的营养液，用 1mo L的 H 1 l/ C和 1m l o/ L的 N O调 p为 3、 5 6、和 8并 aH H 4、、 7,添加z“添加M 2添加 n g t组别图2 3种金属离子对灵芝发酵产灵芝酸

l0 8

不添加离子

测定实验室用水为 p .,相同料水比加入基料 H6按 2中，究不同起始 p对灵芝酸产量的影响，果见研 H结图 5

饲料研究 F E E E C| E DR S AR INO.}20 6 1 05 ) 9

耵资开与用源发利

∞卿扣留

如 ∞ 0 O∞∞∞如 ∞

从图 5可见：起始 p H小于 5或大于 7时对灵

27 N 4S 量浓度对灵芝发酵产灵芝酸的影响 . Hh O质 f f H ) O作为灵芝生长的氮源， N-) O作 N 4S 2以( I: LS为氮源的固体发酵培养物获得的纤维素酶酶活较高 .能在酶水解无定型纤维素成为纤维素寡糖的可过程中， I O起到明显的促进作用。从图 7可 (￣ N&S

芝酸的生成不利。始 p起 H为 6时，酒精精提物质量可达到最大值 .胞外内总三萜的含量也可达到最大值，以，所综合考虑选择发酵的起始 p H分别为 5 6、和 7为响应面的分析点。

见： 1%的添加量最佳，高的( H) O含量将以较 N 4S 2—

+一芝酸含量/ g灵

导致培养初期菌体生长和对碳源的消耗过快，而低的 f

H ) O含量将由于氮源不足而使菌体生长繁 N 4S 2∞M/Ⅲ咖瞧

一发酵过程失质量幢

如

∞

殖太慢 2种情况可能都不利于产灵芝酸。这∞

集照+一灵芝酸含量酒精粗提物质量

∞

i

p H

咖I

图 5起始 p对产灵芝酸的影响 H

裔f

26料水比对灵芝发酵产灵芝酸的影响 .

固体发酵是以气相作为流动相，温度的维持和

o

o5 .

1

1 . 5

2

气体的交换都通过气体进行，分过高影响气体交水换 .分过低影响菌体从培养基吸收水。图 6可水从见：固体发酵培养基中，水比在 1 1 1 15和 12料：、:.:时，芝酸产量和酒精粗提物质量都较高。灵一一

H ) O质量浓度/ 4S ,:%图 7 ( H )质量浓度对灵芝发酵产灵芝酸的影响 N 4s 2

28温度对灵芝发酵产灵芝酸的影响 .产灵芝酸温度一般应≤3 0℃,温度过高，芝灵产生纤维素酶能力可能下降或所产的纤维素酶失

灵芝酸含量酒精粗提物质量8 0

一

活，接影响灵芝对碳源麦秸秆的利用，芝生长直灵7竽 06 04 0

受到明显的抑制，从而影响灵芝酸的产量。从图 8

:∞ 2 ∞ ∞ ∞Ⅲ咖霉霹熙/

∽

i

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可见：温度控制在 2 0~3 O℃,产灵芝酸含量相比所在其他温度时产量高。

5 0蜓

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+0 10. 1 1 1 15: 5:: .】 2 1 2 5: : .

灵芝酸含量

一

酒精粗提物质量

料水比/g m ) ( i

图 6料水比对灵芝发酵产灵芝酸的影响

咖如

甾

当固体发酵培养基中料水比在 10 5 12 5:.和：.

时，灵芝酸产量和酒精粗提物质量都较低，料水比 l0 5,: .时可能是水分不够灵芝本身的新陈代谢 .而影响整个发酵体系；固体发酵培养基中从当料水为 12 5时，:.可能是水分过多。影响灵芝生长的温度/￣ C

图 8温度对灵芝发酵产灵芝酸的影响

通气性，培养基内部散热难。综合考虑选择发酵使的起始料水比分别 1:、】 l】: . 5和 1: 2为响应面的分析点。

(待续 ) 通信地址：苏镇江学府路 3 1 2 2 1江 0 1 0 3

7 饲料研究 F E) l I R: i I{9 0 1Ri i IHN l{2} :: SA o

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